ЭНДОФИТНАЯ РИЗОБАКТЕРИЯ KLEBSJELLA PLANTICOLA, ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С РАСТЕНИЕМ И ЦЕНОЗОМ МИКРОМИЦЕТОВ В ФИТОПЛАНЕ И РИЗОСФЕРЕ Бирюкова, Оксана Владимировна

Введение к работе

Актуальность темы. Изучение свойств ассоциативных азотфиксаторов изначально было связано с перспективой их использования как альтернативы минеральным азотным удобрениям для небобовых культур. Рядом исследователей было выявлено, что эти бактерии оказывают комплексное действие на растения (Nehl et al., 1996; Bashan et al., 1997; Reddy et al., 1999). Кроме улучшения минерального питания растений они обладают ростстимулирующими свойствами, а также повышают резистентность растений к различным фитопатогенам, что объясняется их выраженной в той или иной степени антагонистической активностью по отношению к микромицетам (Hoeflich et al., 1994; Govedarica et al., 1998). В то же время остается актуальным вопрос технологии инокуляции. При выборе метода применения микробных биопрепаратов наряду с корневой инокуляцией все больший интерес вызывает новый метод - нанесение азотфиксирующих микроорганизмов на филлосферу растений (Khotianovich, 1996). Эффективность метода инокуляции зависит от особенностей взаимодействия интродуцированных бактерий с растениями.

В настоящее время остаются менее освещенными такие вопросы, как влияние способов инокуляции на приживаемость бактерий, воздействие интродуцентов на сообщество микроорганизмов в ризосфере и фитоплане растений, поражаемость растений заболеваниями. Кроме того,. в последние годы получены результаты, свидетельствующие о том, ассоциативные диазотрофы, колонизирующие поверхность растений, могут нередко проявлять свойства эндофитов, т.е. колонизировать еще и внутренние ткани растений (Емцев с соавт., 1995; Wood et al., 1993; Quadt-Hallmann et al., 1997; Song et al., 1998; Cocking, 1999).

Целью настоящего исследования было изучение способности бактерий Klebsiella planticola к колонизации растений и инвазии при их инокуляции различными способами, а также воздействия интродуцента на изменение состава комплекса микромицетов ризосферы и фитоплана.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Изучить приживаемость бактерий Klebsiella planticola в ризосфере и фитоплане растений при их . инокуляции различными способами: традиционным предпосевным и обработкой листьев вегетирующих растений.

2. Изучить колонизирующую способность и инвазивность штамма при его интродукции под растения.

3. Определить влияние колонизирующей способности бактерий Klebsiella planticola на такие показатели ассоциативного симбиоза, как стимуляция роста семян, накопдеыие___ассимилированного углерода растением, нитрогеназную активность. ЦСгі ГРЛЛьНАЛ~~"""~"

НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Моск. сельс^оз ачадемии им. К. Л. "і иуип,чзеа

4. Изучить влияние различных доз азотных удобрений на приживаемость Klebsiella planticola в ризоплане и филлосфере ячменя при различных способах инокуляции растений

5. Изучить влияние различных способов инокуляции Klebsiella planticola на динамику и родовой состав микромицетов, в том числе фитопатогенных

6. Определить воздействие инокуляции семян и листьев ячменя бактериями Klebsiella planticola по фону различных доз азотных удобрений на динамику и состав микромицетов, в том числе фитопатогенных

7. Оценить влияние различных способов инокуляции Klebsiella planticola на поражаемость растений ячменя темно-бурой пятнистостью листьев и корневыми гнилями

Научная новизна Впервые изучены инвазивные свойства Klebsiella planticola TCXA-91 по отношению к небобовым растениям Установлено, что клетки Klebsiella planticola при инвазии в растение персистентны и способны мигрировать в его внутренних тканях Выявленные особенности взаимодействия Klebsiella planticola с небобовыми растениями позволяют отнести этот микроорганизм к эндофитным ризобактериям

Показано, что независимо от способа инокуляции бактерии колонизируют весь фитоплан растений, при этом уровень стабилизации численности интродуцента в течение вегетации растений составляет 10³-10^л кл/г сухой массы.

Впервые установлено, что интродукция Klebsiella planticola приводит к изменению состава комплекса микромицетов, населяющих фитоплан и ризосферную почву

Показано, что различные приемы инокуляции растений (семена или листья) эндофитной ризобактерией Klebsiella planticola TCXA-91 позволяют снизить поражаемость растений корневыми гнилями и темно-бурой пятнистостью листьев При этом число пораженных растений сокращается на 25-36%, степень развития заболевания уменьшается на 3-8%

Практическая значимость Отработаны оптимальные параметры инокуляции семян ячменя бактериями Klebsiella planticola Наибольшая эффективность инокуляции наблюдается при 30-минутном воздействии на семена 1-суточной культуры Апробированы различные технологии применения биопрепарата «Биоплант-К» для инокуляции небобовых растений традиционная предпосевная обработка семян, обработка листьев и сочетание обоих способов Показано, что инокуляция снижает поражаемость растения ячменя корневыми гнилями и темно-бурой пятнистостью листьев вне зависимости от способа инокуляции Наибольшая антифунгальная активность интродуцента наблюдается при сочетании предпосевной обработки семян и последующей обработки зистьев Результаты проведенной работы свидетельствуют о новых перспективах использования риюбактерий и, в частности, Klebsiella planticola штамм TCXA-91, применяющегося в качестве основы препарата «Биоплант-К»

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на международной научно-практической конференции «Savremena poljoprivreda», (Югославия, Новый Сад, 1998 год), на международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Направления стабилизации развития и вывода из кризиса АПК в современных условиях» (Воронеж, 1999), на Ежегодной Конференции ученых МСХА (Москва, 2000), на Второй Интернациональной Российско-Иранской Конференции «Agriculture and natural resources» (Москва, 2001), на 13-м Международном Конгрессе по азотфиксации (Hamilton, 2001).

Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части с описанием объектов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы. Материалы диссертации изложены на-/^страницах машинописного текста, иллюстрированы«?/рисунком, / таблицами и G приложениями. Список литературы включаетг&Ф наименований источников, из них /«&>на иностранных языках.

Автор выражает глубокую признательность и благодарность сотруднику кафедры низших растений МГУ к.б.н. Александровой А.А. за помощь, оказанную при идентификации выделенных микромицетов, сотруднику кафедры биологии почв МГУ д.б.н. Степанову А.Л. за помощь и методические советы при определении нитрогеназнои активности, профессору Штару К. за предоставление возможности проведения экспериментов по изучению инвазивности и миграции бактерий внутри растений, а также использование радиоиндикаторных методов на базе института почвоведения и ландшафтоведения Университета Хоэнхайм (Германия).

Объектом исследования были бактерии Klebsiella planticola ТСХА-91. выделенные из ризопланы огурца в 1990 году и полученные из коллекции кафедры микробиологии МСХА им. Тимирязева.

Для изучения инвазивности бактерий и их колонизирующей способности в зависимости от способа инокуляции применяли рифампицинустойчивый мутант Klebsiella planticola ТСХА-91 Rif²⁰⁰, способный. расти на среде LB с концентрацией антибиотика рифампицина 200 мкг на 1 мл среды, полученный методом последовательной адаптации к повышенным концентрациям антибиотика (Звягинцев с соавт., 1991). Этот штамм характеризуется нестабильной и более низкой нитрогеназнои активностью в отличие от исходного штамма.

При культивировании бактерии высевались на среду LB (Luria Bertoni), содержащую 10 г пептона, 5 г NaCl, 10 г дрожжевого экстракта (Миллер, 1976). Для получения накопительной культуры использовали жидкие среды LB и К2. Среда К2 имеет следующий состав: пептона 1,25 г, К2НРО4 0,5 г, НгР0₄ 0,3 г.

MgS0₄ 0,1 г, CaCl; 0,03 г, сахарозы 6 г, (NR|)2S04 0,14 г, дрожжевого экстракта 0,1 г на титр водопроводной воды

Тест-культуры ячмень посевной, сорт Зазерскии 85, райграс много четкий, овес посевной

В схему опыта по изучению роли инокуляции в стимулировании силы роста семян входили 1- ,2- ,3- ,4- суточные культуры Klebsiella planticola 1СХА-91, выращенные на среде LB, в разведении 1 50, с временем экспозиции 30 минут, 1 час, 2 часа и 5 часов Оценка эффективности инокуляции проводилась с исполыованием морфофизиологической оценки проростков по 5-балльной системе Котонизирующую способность и приживаемость бактерии Klebsiella planticola штамма ТСХА - 91 RiP" в ризоплане и филлосфере ячменя в зависимости от способа инокуляции растений оценивали в микроделяночных опытах, которые были заложены на станции защиты растений МСХА Схемы опытов включали следующие варианты инокуляции обработка семян, обработка листьев и совместная обработка семян и листьев Семена инокулировали в суспензии клеток суточной культуры с титром 10*-10' кл/мл в разведении 1 50 в течение 30 минут Инокуляцию филлосферы осуществляли путем опрыскивания вручную из пульверизатора по всходам жидкой культурой с титром 10^х-10^s кл/мл, в разведении I 50

Для изучения влияния уровня азотного питания растении в диапазоне 30-150 кг/га на приживаємось Klebsiella planticola в ризоплане и ришсфере растений ячменя также использовали рифампицинустончивый штамм Удобрения вносили в почву опытного участка за трое суток до посева вручную В качестве фосфорного удобрения исполыовали гранулированный двойном суперфосфат, калийного - хлорид калия, азотного - мочевину Уровни фосфорною и калийного фонов для всех вариантов 30 кг д в /га

Для изучения динамики численности и родового состава микроскопических грибов в качестве питательных сред использовали еле к>-агар (СА) и картофельно-пюкозный агар (КГА) с добавлением молочной кислоты (4 г/т) Посевы производили методом предельных разведении пубинным способом в трехкратной новторности (Теппер с соавт, 1987) Колонии грибов подсчитывали через двое суток после инкубации, через семь дней определяли родовой состав доминирующих колоний с помощью определителей микроскопических почвенных грибов (Литвинов 1467 Кириленко, 1977, Билай, 1984, Barnett, 1472, Barron, 1968, Ellis 1971, Aix, 1981)

Нитрогеназную активность определяли ацети неновым методом (Звягинцев, 1991) на газовом хроматографе CHROM-4-1 с пламенно ионизационным детектором

Фитосанитарное состояние посевов ячменя оценивали с учетом поражаемости растений корневыми гнилями (Григорьев, 1976) и темно-бурон пятнистостью листьев (Чумаков, Захарова, 1990)

Инвазивные свойства штамма изучали в стерильном модельном опыте с семенами овса, которые выращивали на стерилизованной почвенной вытяжке в

бактериологических пробирках. Заражение субстрата проводили на 7- день выращивания с помощью введения шприцем с длинной иглой, избегая контакта с проростками, суспензии бактерий Klebsiella planticola ТСХА-91 Rif²⁰⁰ с концентрацией 10⁹ кл/мл. Идентификацию штаммов, выделенных из гомогенатов тканей .корней и листьев проростков овса, проводили по фенотипическим признакам (рост на среде с рифампицином) и по наличию плазмидной ДНК. Выделение плазмидной ДНК осуществляли экпресс-методом Кадо с последующим электрофорезом. Электрофорез. ДНК проводили в агарозном геле (0,7%) следующего состава: агароза (тип 1 фирмы Сигма) с использованием трис-боратного буфера по классическому методу (Meyer et at., 1976). .

Радиоавтографии райграса получали методом наложения фотобумаги на гербарий меченых растений в течение одного месяца.

Для исследования влияния разных способов инокуляции на ассимиляцию, накопление и распределение углерода в растениях ячменя, на транслокацию углерода в почву, а также для изучения приживаемости, инвазивности. и .миграции клеток инокулянта в растении в модельном эксперименте, проведенном в, Университете Хоэнхайм, использовали изотоп ^,4С и' двухкамерные сосуды специальной конструкции, позволившей герметично изолировать верхнюю часть растений от нижней. Растения метили однократно в аті«лсфере ¹⁴С02, подаваемой в верхнюю камеру. По окончании эксперимента микробную биомассу в почве определяли методом экстракции -фумигации (Joerg