Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Биокаталитическое окисление органических сульфидов
1.1. Строение, свойства и биологическая активность оптически активных сульфоксидов 11
1.2. Биотрансформация прохиральных сульфидов – перспективный способ получения энантиомерно обогащенных сульфоксидов 19
1.3. Органические сульфиды как экополлютанты. Способы их биодеградации 42
1.4. Актинобактерии – потенциальные биотрансформаторы органических сульфидов в оптически активные сульфоксиды 44
Экспериментальная часть
Глава 2. Материалы и методы исследования 52
2.1. Рабочая коллекция бактериальных культур 52
2.2. Химические реактивы 53
2.3. Условия культивирования гордоний 54
2.4. Получение иммобилизованных бактериальных клеток 54
2.5. Постановка экспериментов по биотрансформации сульфидов 57
2.6. Анализ продуктов биотрансформации сульфидов 59
2.7. Определение респираторной активности гордоний 62
2.8. Определение физико-химических и морфофизиологических характеристик гордоний 62
2.9. Математическое моделирование процесса биотрансформации тиоанизола 65
2.10. Статистическая обработка результатов 65
Глава 3. Сульфидокисляющая активность коллекционных штаммов Gordonia spp . 66
3.1. Поиск штаммов - активных биотрансформаторов сульфидов 66
Глава 4. Сравнительное изучение физико-химических и морфо-физиологических характеристик гордоний 74
4.1. Клеточные приспособления гордоний на воздействие органических сульфидов 74
Глава 5. Биотрансформация органических сульфидов с использованием иммобилизованных гордоний 80
5.1. Разработка стабильного биокатализатора для получения энантиомерно обогащенных сульфоксидов 80
5.2. Математическое моделирование процесса биотрансформации тиоанизола иммобилизованными гордониями 93
5.3. Возможные пути образования (R)-энантиомерных сульфоксидов.. 98
Заключение 102
Выводы 107
Список сокращений 109
Список литературы
- Биотрансформация прохиральных сульфидов – перспективный способ получения энантиомерно обогащенных сульфоксидов
- Условия культивирования гордоний
- Определение физико-химических и морфофизиологических характеристик гордоний
- Математическое моделирование процесса биотрансформации тиоанизола иммобилизованными гордониями
Введение к работе
Актуальность проблемы. Оптически активные сульфоксиды широко
используются в качестве строительных блоков или стереонаправляющих групп в
асимметрическом синтезе и для получения биологически активных соединений
(Fernandez, Khiar, 2003; Raghavan, Rathore, 2009; Wojaczyska, Wojaczyski, 2010).
На их основе разработаны сосудорасширяющие (Padmanabhan et al., 2000;
Kaczorowska et al., 2005; Golchoubian, Hosseinpoor, 2006), противоязвенные
и ноотропные (Olivo et al., 2005; Jung et al., 2012; Gao et al., 2015) лекарственные
препараты. Получение энантиомерно однородных сульфоксидов из прохиральных
сульфидов осуществляется в основном методами химического синтеза,
предусматривающими использование дорогостоящих катализаторов и защиту реакционно-активных функциональных групп, при этом не всегда достигается высокая энантиоселективность реакций (Wojaczyska, Wojaczyski, 2010; O’Mahony et al., 2013).
Использование биокатализа открывает возможность получения сульфоксидов с
высокой степенью регио- и стереоселективности без использования повышенных
температур, давления и в неагрессивной реакции среды (Fernandez, Khiar, 2003;
Matsui et al., 2014). Первые работы по биотрансформации прохиральных сульфидов
проведены с использованием условно-патогенных актинобактерий ‘Corynebacterium
equi’ IFO 3730 (современное название таксона Rhodococcus hoagii) (Ohta, 1985) и
грибов Aspergillus terreus CCT 3320, A. japonicus ICFC 744/11 (Porto et al., 2002;
Mascotti et al., 2012), Helminthosporium sp. NRRL 4671, Mortierella isabellina ATCC
42613 (Holland et al., 1999; 2002), Botrytis cinerea UCA 992, Eutypa lata, Trichoderma
viride (Pinedo-Rivilla et al., 2007), Saccharomyces cerevisiae NCYC 73 (Beecher et al.,
1995). Описанные процессы окислительной биотрансформации сульфидов
характеризуются, как правило, невысоким выходом целевых продуктов при низких (до 0,5 г/л) концентрациях исходного субстрата. Спектр биокатализаторов направленного сульфоксидирования с каждым годом пополняется представителями бактерий родов Pseudomonas (Adam et al., 2005; Chen et al., 2014), Streptomyces (Mascotti et al., 2013) с высокой сульфидокисляющей активностью. При этом химический выход и оптическая чистота полученных сульфоксидов варьируют в зависимости от структуры сульфидов и использованных штаммов.
Важная роль при разработке эффективных биокатализаторов процессов биотрансформации различных органических соединений принадлежит микробным коллекциям, предоставляющим информацию о свойствах и биотехнологической пригодности депонированных штаммов. С использованием генофонда Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним коллекции ИЭГМ, http:/) недавно исследована способность непатогенных штаммов актинобактерий рода Rhodococcus к направленной биотрансформации 0,5 г/л тиоанизола в оптически активный сульфоксид (Елькин, 2011). Показано, что иммобилизованные в криогель на основе поливинилового спирта клетки R. rhodochrous ИЭГМ 66 способны к окислению фенилметил-, бензилметил-, фенилэтил- и п-толилметилсульфидов в концентрации до 1,5 г/л в (S)-энантиомерные сульфоксиды (48–85 % ее). В последние годы наблюдается нарастание фундаментального интереса к углубленному изучению близкородственной группы углеводородокисляющих актинобактерий рода Gordonia (ex Tsukamura 1971) Stackebrandt et al. 1989, обладающих уникальными ферментными системами
и широким спектром катаболических возможностей, что позволяет рассматривать их
в качестве ключевых биоокислителей органических соединений всех известных
классов (Drzyzga, 2012). Однако данные о способности гордоний к биотрансформации
сульфидов ограничиваются немногочисленными примерами (Mohebali et al., 2007;
Wang et al., 2013; Ahmad et al., 2014, 2015), касающимися окислительной
десульфуризации серосодержащих компонентов нефти (бензотиофена,
дибензотиофена, дисульфидов, в частности). В связи с этим поиск новых бактериальных штаммов, способных к биотрансформации арилалкилсульфидов в хиральные сульфоксиды, среди представителей данного таксона является весьма актуальным.
Цель настоящей работы – исследование возможности использования актинобактерий рода Gordonia для направленной биотрансформации органических сульфидов в оптически активные сульфоксиды.
Основные задачи исследования
-
С использованием генофонда Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов исследовать сульфидокисляющую активность коллекционных штаммов гордоний.
-
Оценить возможность использования иммобилизованных гордоний для биотрансформации прохиральных сульфидов.
-
Сравнить каталитическую активность гордоний в отношении арилалкилсульфидов с электронодонорными и электроноакцепторными заместителями в пара- и орто-положении ароматического кольца.
-
Разработать прогнозную модель процесса биотрансформации тиоанизола с использованием методов математического моделирования.
-
Изучить физико-химические и морфофизиологические особенности гордоний под воздействием органических сульфидов.
-
Разработать устойчивый биокатализатор для направленного окисления прохиральных сульфидов в энантиомерно обогащенные сульфоксиды.
Научная новизна. На основе биоресурсов Региональной профилированной
коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним коллекции ИЭГМ,
http:/) впервые показана способность актинобактерий рода Gordonia
к стереоселективной биотрансформации органических сульфидов в оптически
активные сульфоксиды. Установлено, что гордонии в присутствии н-гексадекана
катализируют образование (R)-энантиомерных сульфоксидов. Выявлено, что на
выход и уровень энантиомерного избытка сульфоксидов оказывает влияние
положение заместителей в арильном фрагменте арилалкилсульфидов. Показана
возможность оптимизации процесса биотрансформации органических сульфидов в
оптически активные (R)-сульфоксиды с использованием гордоний,
иммобилизованных в криогель на основе поливинилового спирта. Установлена возможность 4-х-кратного повышения концентрации трансформируемого сульфида при использовании закрепленных в ПВС-криогеле гордоний. Использование приема, предусматривающего дробное внесение тиоанизола в среду ферментации иммобилизованных гордоний, позволило значительно увеличить (до 4,25 г/л) общую нагрузку сульфида. Создана математическая модель, позволяющая оптимизировать планирование исследований по биотрансформации тиоанизола клетками G. terrae ИЭГМ 136, благодаря теоретическому прогнозированию продолжительности процесса биотрансформации и возможного выхода целевого продукта в зависимости от исходной концентрации сульфида и количества гранул биокатализатора. В
условиях воздействия органических сульфидов обнаружены характерные изменения
морфофизиологических параметров (увеличение размеров, степени шероховатости
клеточной поверхности, содержания суммарных клеточных липидов) гордоний.
Определены возможные пути образования (R)-энантиомерных сульфоксидов.
Экспериментально обосновано, что гордонии обладают способностью катализировать
образование энантиомерно обогащенного (R)-сульфоксида путем прямого
асимметрического окисления прохирального сульфида, а также поддерживать энантиомерный избыток целевого (R)-сульфоксида на высоком уровне путем окисления (S)-изомера в сульфон.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о биокаталитическом потенциале актинобактерий рода Gordonia. В результате проведенных исследований отобраны штаммы G. amicalis ИЭГМ 726, ИЭГМ 1274, G. terrae ИЭГМ 130, ИЭГМ 136, катализирующие энантиоселективное окисление фенилметилсульфида в (R)-сульфоксид с 70 % ее. На основе иммобилизованных в ПВС-криогеле гордоний получен высокоэффективный биокатализатор с расширенным субстратным профилем, улучшенной энантио-селективностью и увеличенной каталитической активностью. Разработанный биокатализатор характеризуется функциональной стабильностью после хранения в течение 6 месяцев, а также при многократном использовании на протяжении пяти последовательных циклов. Использование биокатализатора позволяет получать фенилметил-, фенилэтил-, п-бромфенилметил-, п-хлорфенилметил-, п-фторфенил-метил, п-цианофенилметил- и п-толилметил- (R)-сульфоксиды с высоким (77–95 % ее) уровнем энантиомерного избытка. На способ получения (R)-фенилметилсульфоксида путем биоокисления фенилметилсульфида с использованием иммобилизованных клеток G. terrae ИЭГМ 136 получено положительное решение от 30.05.2016 по заявке № 2015151763/10(079724) на выдачу Патента на изобретение Российской Федерации. Информация о наиболее активных штаммах-биотрансформаторах органических сульфидов включена в компьютеризированную базу данных Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов для использования в сети Интернет ().
Основные положения, выносимые на защиту
-
Актинобактерии рода Gordonia способны к биотрансформации органических сульфидов в присутствии н-гексадекана. Выраженной сульфидокисляющей активностью (уровень биоконверсии от 25 до 100 %) характеризуются представители видов G. amicalis и G. terrae, окисляющие тиоанизол (0,5 г/л) в течение 6 сут с образованием (R)-сульфоксидов (до 93 % ее).
-
Использование приемов иммобилизации гордоний в матрицу криогеля на основе поливинилового спирта и дробного внесения сульфида обеспечивает наиболее высокую каталитическую активность бактериальных клеток в отношении тиоанизола.
-
Гордонии наиболее эффективно (уровень биоконверсии от 60 до 100 %; 66–95 % ее) катализируют окисление арилалкилсульфидов с электроноакцепторными (СN, NO2, Cl, Br, F) и электронодонорными (СH3, CH3O) заместителями в пара-положении ароматического кольца по сравнению с таковыми в орто-положении.
-
Адаптивной реакцией гордоний на воздействие тиоанизола является повышение степени гидрофобности клеток, их шероховатости, а также образование клеточных агрегатов.
-
Разработанный на основе иммобилизованных клеток G. terrae ИЭГМ 136 биокатализатор характеризуется высокой функциональной стабильностью при
многократном использовании на протяжении пяти последовательных циклов и хранении в течение 6 месяцев.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной
работы доложены и обсуждены на III, V, VII, IX Всероссийском с международным
участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов “Симбиоз Россия”, Нижний
Новгород, 2010, Тверь, 2012, Екатеринбург, 2014, Пермь, 2016; III Международной
конференции “Техническая химия от теории к практике”, Пермь, 2012; VII, X
Молодежной школе-конференции с международным участием “Актуальные аспекты
современной микробиологии”, Москва, 2011, 2015; II Всероссийской школе-
конференции молодых ученых “Современные проблемы микробиологии,
иммунологии и биотехнологии”, Пермь, 2015; XХ Международной Пущинской
школе-конференции молодых ученых “Биология – наука XXI века”, Пущино, 2016;
Всероссийской научно-практической с международным участием конференции
“Наукоемкие биомедицинские технологии: от фундаментальных исследований до
внедрения”, Пермь, 2016.
По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 4 в изданиях, входящих в утвержденный ВАК перечень рецензируемых научных изданий (Вестник Уральской медицинской академической науки, Российский иммунологический журнал) и международную систему научного цитирования Scopus (Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic). Получено положительное решение от 30.05.2016 по заявке № 2015151763/10(079724) на выдачу Патента на изобретение Российской Федерации “Биотрансформация фенилметилового сульфида в (R)-сульфоксид с помощью иммобилизованных клеток Gordonia terrae ИЭГМ 136”.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу и 23 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 264 наименований работ, в том числе 20 отечественных и 244 зарубежных авторов.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора.
Работа выполнена в соответствии с планами НИР кафедры микробиологии и иммунологии Пермского государственного национального исследовательского университета и Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, является частью исследований, проводимых по Госзаданию 6.1194.2014/К Минобрнауки РФ, поддержана грантами Президента РФ “Ведущие научные школы” (НШ-4607.2014.4) и Комплексной программы Уральского отделения РАН (проект 15-12-4-10). Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора. Математическое моделирование процесса биотрансформации тиоанизола выполнено на базе кафедры теоретической механики Пермского национального исследовательского политехнического университета (зав. кафедрой – профессор Няшин Ю.И.).
Биотрансформация прохиральных сульфидов – перспективный способ получения энантиомерно обогащенных сульфоксидов
Важным свойством вещества, молекула которого хиральна, является его оптическая активность. Все оптически активные вещества встречаются в виде пар оптических антиподов – изомеров (энантиомеров), физические и химические свойства которых в обычных условиях одинаковы, за исключением одного – знака вращения плоскости поляризации поляризованного света. Согласно принятой номенклатуре, изомер, который вращает плоскость поляризации по часовой стрелке, обозначают символом R (от лат. rectus – прямой), – против часовой стрелки – S (от лат. sinister – левый). В органических соединениях в качестве центра хиральности могут выступать атомы углерода, азота, фосфора или серы (Белобородов и др., 2003; Beard, Page, 1998).
Энантиомерно чистые или оптически активные сульфоксиды (R1-SO-R2, где R1R2) относятся к классу органических соединений со стереогенным (асимметрическим) атомом серы. Двойная связь в сульфоксидах обусловлена - и - взаимодействием сера-кислород, реализующимся благодаря перекрыванию заполненных р-орбиталей атома кислорода и соответствующих пустых d орбиталей серы, и обозначается как R1R2S=OR1R2S+O–. Данная связь по свойствам существенно отличается от двойных связей, образуемых элементами второго периода (например, С=О связей), и характеризуется значительным вкладом ионного состояния. С учетом направленности пары свободных электронов молекула сульфоксида представляет собой несколько искаженную пирамиду с атомом серы в вершине и двумя заместителями и кислородом в основании (Bentley, 2005). Поскольку сульфоксиды конформационно стабильны при комнатной температуре, они могут быть разделены на чистые энантиомеры. Специфические свойства сульфоксидов как растворителей и комплексообразователей широкого диапазона обусловлены их способностью к образованию прочных водородных связей с протонодонорными молекулами, а также комплексов со многими неорганическими солями (Прилежаева, 1988). Уникальные свойства сульфоксидов (присутствие хирального атома серы, высокая конфигурационная стабильность и реакционная способность, возможность последующего легкого удаления группировок RS(O)n (n=1, 2), которые уже выполнили функцию медиаторов) обусловливают широкое использование их в асимметрическом синтезе, фармацевтической и агрохимической практике (Толстиков и др., 2003; Legros et al., 2005; O Mahony et al., 2013; Matsui et al., 2014).
Соединения, содержащие сульфоксидную группу, широко распространены в природе. Например, из репчатого лука выделены (+)-S-метил-L-цистеин-сульфоксид, (+)-S-пропил-L-цистеинсульфоксид, из чеснока – S-аллил-L-цистеинсульфоксид (Kubec et al., 2000; Kyung, Lee, 2001). Показано, что при действии ферментов типа аллиназы (содержащихся в природных препаратах) 2-пропенилсульфоксид (производное (+)-(S)-цистеинсульфоксида) превращается в айоен, ответственный за антитромбозное действие чесночных экстрактов (Block et al., 1986). Растение Dipthychjcarpus strictus (двоякоплодник прямой) продуцирует 10 алкалоидов с хиральным атомом серы в метилсульфинильном фрагменте (Толстикова и др., 1989). Из водяной лилии Nuphar lutea выделен новый тип алкалоидов с фрагментом сульфоксида (тиаспиран сульфоксид), обладающих иммуносупрессивной активностью (Yoshikawa et al., 1997). В различных грибковых культурах обнаружены еще более сложные серосодержащие соединения: полифункциональный антибиотик спарсомицин – продукт жизнедеятельности стрептомицетов Streptomyces sparsogenes или ядовитая лентиловая кислота (Прилежаева, 1998; Рубцова и др., 2010; Jogia et al., 1989). Природные сульфоксиды участвуют в биологически важных трансформациях. Так, на основании сравнительной легкости протекания 1,7-миграции сульфинильных групп по полиеновой системе высказано предположение о роли такого процесса в биологической дезактивации (S,R) и (S,S)-лейкотриенов (Corey et al., 1982).
Фундаментальным свойством биологических систем является хиральность. Основополагающие для живых систем молекулы ДНК, РНК, а также углеводы, белки и их фрагменты представлены лишь одним из возможных энантиомеров. Отсюда терапевтические свойства лекарственных препаратов напрямую зависят от степени соответствия строения рецептора и пространственной структуры лекарственного препарата. Основная фармакологическая активность рацемических лекарственных средств обычно связана с действием лишь одного энантиомера. Второй энантиомер обладает менее выраженной активностью или совсем неактивен, или оказывает антагонистическое действие. В связи с этим в настоящее время в фармацевтической практике наблюдается переход от создания рацемических препаратов к энантиомерно чистым (Agranat et al., 2002; Bentley, 2005). Соединения на основе оптически активных сульфоксидов проявляют противовоспалительную (Brodgen et al., 1978), противолепрозную (Levy, 1978), антигельминтную (Merino et al., 2003), противоопухолевую (Khiar, 2000; Ludwig et al., 2013), антибактериальную, антиатеросклеротическую (Adetumjbi, Lau, 2000; Sovova, Sova, 2003; Kumar et al., 2009), антигипертензивную (Kotelanski et al., 1973) и психотоническую (Zifko et al., 2002) активность. На основе оптически активных сульфоксидов разработаны различные сосудорасширяющие (Padmanabhan et al., 2000; Golchoubian, Hosseinpoor, 2006), противоязвенные (эзомепразол) (рисунок 1), ноотропные (армодафинил 1) (Olivo et al., 2005; Jung et al., 2012; Gao et al., 2015), иммуносупрессивные (оксисуран 2), противоопухолевые (сульфорафан 3 и спарсомицин 4) препараты, а также средства для лечения аллергии (Reinholz et al., 1987) и лучевого дерматита (Bryce, Shapiro, 1990). Эффективность действия данных препаратов обусловлена различиями в скорости метаболизма (S)- и (R)-энантиомерных сульфоксидов (Andersson, Weidolf, 2008). /\ О
На основе сульфоксидных производных пиразолотриазина 5 разработан препарат (BOF-4272), ингибирующий биосинтез мочевой кислоты при лечении гиперурикемии (Naito, Nishimura, 2001; Renfrey, Featherstne, 2002). Сульфоксидная группа присутствует в ингибиторах адгезии тромбоцитов (ОРС-29030 6, в частности), препятствующих высвобождению 12(5 гидрокси-эйкозатетраеновой кислоты из тромбоцитов (Matsugi et al, 2001; Carlsson et al, 2002), а также в активаторах калиевых каналов (Априкалим 7).
Показано, что некоторые сульфоксиды цистеина (5-метил--цистеин сульфоксид 8, в частности) участвуют в регуляции катаболизма холестерина, обладают антибиотической и антиканцерогенной активностью (Borges et al, 2009; Edmands et al, 2013). Тетраметиленсульфоксид 9 и его 3-замещенные производные являются сильнодействующими ингибиторами реакции окисления этанола, катализируемой алкогольдегидрогеназой печени, и перспективны в качестве антидотов при алкогольной интоксикации (Chadha et al., 1983).
При разработке новых лекарственных препаратов активно используется “правило пяти” Липинского (или “drug-likeness rule”), согласно которому соединение, чтобы быть похожим на лекарство, должно (1) иметь не менее пяти атомов-доноров водородной связи, (2) обладать молекулярным весом менее 500, (3) иметь липофильность (log P) менее 5, (4) иметь суммарно не более 10 атомов азота и кислорода. Соответствие всем показателям обнаружено для азолсодержащего соединения, несущего сульфоксидную группу 10. Методом теоретических вычислений и in vitro исследований показана перспективность использования данного соединения в качестве антипротозойного средства против амебной дизентерии (Mushtaque et al., 2016). Как видно из приведенных примеров, сульфоксидная группа входит в состав различных лекарственных препаратов и является их фармакологически активным (действующим) началом.
Условия культивирования гордоний
Эксперименты по определению минимальной подавляющей концентрации (МПК) и антимикробной активности тиоанизола и продукта его окисления -фенилметилсульфоксида проводили в круглодонных иммунологических планшетах со 100 мкл МПБ в каждой лунке. Соединения (5–10 мг) растворяли в 100 мкл изопропанола и вносили в лунки с последующим серийным разведением. К полученным растворам добавляли по 10 мкл суспензии (106 кл/мл) тест-культуры: G. terrae ИЭГМ 136, Escherichia coll АТСС 25922, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, Bacillus subtilis АТСС 6633, Staphylococcus aureus АТСС 25923, S. epidermidis ATCC 29887, Micrococcus luteus NCIMB 196. Бактериальные клетки выращивали при 37 С, за исключением G. terrae ИЭГМ 136, М. luteus NCIMB 196, которые инкубировали при 28 С. В качестве референтных препаратов использовали антибиотические вещества (ампициллин, эритромицин). В другом варианте опыта бактериальные клетки (5х106 кл/мл) вносили в минеральную среду, содержащую 0,1 об. % н-гексадекана и фенилметилсульфид, фенилметилсульфоксид или изопропанол в концентрации 0,1-2,0 г/л. После 2-х суток инкубации клетки окрашивали водным раствором ИНТ (Sigma-Aldrich, США), по интенсивности окрашивания оценивали рост.
В экспериментах по исследованию влияния ингибиторов оксигеназ на сульфидокисляющую активность гордоний использовали коммерчески доступные ингибиторы: 1-аминобензотриазол, проадифен, кетоконазол, имидазол, которые вносили в среду ферментации гордоний до конечной концентрации 1 мМ (Yoshida et al., 2001) одновременно с тиоанизолом через 2 сут инкубации бактериальных клеток в минеральной среде. Параллельно использовали следующие варианты опытов: без добавления (1) ингибиторов; (2) тиоанизола; (3) тиоанизола и ингибиторов. Неинокулированная минеральная среда служила в качестве контроля абиотической трансформации сульфидов. О влиянии ингибиторов на активность ферментов судили по уровню конверсии сульфида в сульфоксид.
Органические сульфиды и продукты их биотрансформации экстрагировали с помощью этилацетата. Объединенные этилацетатные экстракты обезвоживали над Na2S04. Растворитель удаляли с помощью роторного испарителя (Heidolph, Германия). Образование продуктов биотрансформации предварительно контролировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах с флуоресцентной добавкой (Sigma-Aldrich, США), фиксируя наличие продуктов окисления в УФ (254 нм) при сравнении с эталонными образцами. В качестве эталонных образцов использовали сульфоксиды и сульфоны, синтезированные из соответствующих сульфидов с помощью метода химического окисления (Гришко и др., 2004).
Качественный и количественный анализ продуктов биотрансформации сульфидов осуществляли методом газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) с помощью хроматографа 6890N Agilent (Agilent Technologies, США) с кварцевой колонкой HP-5MS SN US 15189741-1 и квадрупольным масс-спектрометром MSD 5973N в качестве детектора. Условия хроматографирования: 80 С/2 мин, 7,55 С/мин до 178 С, 280 С/5 мин. Температура испарителя - 280 С, источника ионов - 170 С, интерфейса между газовым хроматографом и масс-спектрометром - 280 С. Ионизация молекул осуществлялась электронами с энергией 70 эв. Скорость потока газа 1 мл/мин. Объем образца 1 мкл.
Арилалкилсульфоксиды выделяли с использованием колоночной хроматографии на силикагеле (Merck, Германия, США) при соотношении вещества и сорбента 1:12. В качестве элюента использовали смесь гексана с градиентом 5-40 % этилацетата. Величину удельного оптического вращения образцов арилалкилсульфоксидов в хлороформе, ацетоне или этаноле измеряли на поляриметре модели 341 (Perkin-Elmer, США) при длине волны 589 нм на базе Института технической химии УрО РАН (Пермь). Конфигурацию асимметрического центра арилалкилсульфоксидов подтверждали путем сравнения экспериментальных значений [осв] с литературными данными (Holland et al, 1985, 1991; Boyd et al, 1998, 2004). Полученные сульфоксиды использовали в качестве стандартов для определения времени удержания (R)- и (S)-сульфоксидов методом хиральной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с помощью хроматографа LC Prominence (Shimadzu, Япония), оборудованного хиральными колонками Knauer или CHIRAL ART Amylose - SA (5ші, 250x4,6 mm ID) и диодноматричным детектором. В качестве элюента использовали смесь н-гексан/изопропанол, % (90:10, 95:5, 98:2) (см. таблица 7). Скорость потока подвижной фазы составляла 1,0-2,0 мл/мин, температура термостата колонки - 40 С. Объем образца 50 мкл. Энантиомерный избыток (ее) полученных сульфоксидов определяли по формуле: [R]-[S]winnD/ ее = х 100% [R] + [S] где [R] и [S] - концентрации (R)- и (5 сульфоксидов соответственно. Химический синтез продуктов окисления органических сульфидов. К раствору (1 мМ) органических сульфидов в 5 мл смеси ацетон: уксусная кислота (9:1), нагретому до 45-50 оС, добавляли 0,9 мл 30 % Н2О2. Смесь выдерживали 2 ч при комнатной температуре. После нейтрализации реакционной смеси насыщенным раствором бикарбоната натрия продукты окисления экстрагировали этилацетатом. Синтезированные сульфоксиды и сульфоны в индивидуальном виде получали с помощью методов препаративной тонкослойной хроматографии на алюминиевых пластинах (Sigma-Aldrich, США) или флеш-хроматографии на приборе Buchi С-601/С-605. В качестве элюента использовали смесь гексана с градиентом 5-20 % этилацетата, скорость потока составляла 5 мл/мин. Качество выделенных продуктов контролировали методом ГХ-ХМС.
Определение физико-химических и морфофизиологических характеристик гордоний
По нашим данным, при внесении модельного прохирального сульфида – тиоанизола (20 мг/л) в качестве единственного источника углерода роста гордоний не наблюдается. Поэтому исследование способности гордоний к окислению органических сульфидов осуществляли в присутствии н-гексадекана (Елькин, 2011) при условии добавления тиоанизола на 2 сут инкубации бактериальных клеток. При одновременном добавлении сульфида и инокулята в среду культивирования гордонии сохраняют жизнеспособность в присутствии фенилметилсульфида в низкой концентрации (до 0,3 г/л). В то время как добавление тиоанизола через 2 сут инкубации клеток позволяет повысить устойчивость бактерий к сульфиду до концентрации 0,5 г/л. Повышение выживаемости бактерий в присутствии токсичных соединений при большей численности клеток согласуется с данными И.О. Коршуновой (2016).
Установлено, что исследованные коллекционные штаммы гордоний обладают различной способностью к биотрансформации тиоанизола. Большинство культур осуществляют асимметрическое окисление сульфида с уровнем биоконверсии от 50 до 80 % и выше, при этом в качестве продуктов регистрируются сульфоксиды только с (R)-конфигурацией асимметрического центра. Представители вида G. amicalis катализируют направленное окисление фенилметилсульфида с уровнем конверсии 25–100 % и энантиомерного избытка (R)-фенилметилсульфоксида 66–80 % (таблица 8). Культуры, принадлежащие к виду G. rubripertincta, осуществляют превращение тиоанизола в (R)-сульфоксиды с выходом 24–74 % и 5–85 % ее. Использование в реакции биотрансформации фенилметилсульфида штаммов, принадлежащих к G. terrae, позволяет получать (R)-сульфоксид с 44–88 % выходом и 8,6–93,2 % ее. Штамм G. alkanivorans ИЭГМ 748 осуществляет полную биоконверсию тиоанизола с образованием рацемического сульфоксида (4,6 % ее). Таким образом, в результате скрининга сульфидокисляющей активности 92 коллекционных культур гордоний отобраны штаммы G. amicalis ИЭГМ 726, ИЭГМ 1274, G. terrae ИЭГМ 130, ИЭГМ 136, наиболее эффективно трансформирующие тиоанизол в концентрации 0,5 г/л в целевой (R)-сульфоксид. В последующих экспериментах использовали штамм G. terrae ИЭГМ 136, осуществляющий более чем 80 % конверсию тиоанизола в соответствующий (R)-сульфоксид с высокой степенью стереоселективности (93 % ее). При этом степень образования побочного сульфона не превышает 5 %.
Биотрансформация тиоанизола штаммом G. terrae ИЭГМ 136 в соокислительных условиях в присутствии глюкозы или глицерина протекает с высокой степенью биоконверсии (88–100 %), однако приводит к образованию (R)-сульфоксидов с низкими значениями энантиомерного избытка 47,8 и 29,8 % соответственно. Наиболее высокая степень стереоселективности ( 98 % ее) процесса биотрансформации тиоанизола отмечается в присутствии в среде культивирования 0,5 и 1,0 об. % н-гексадекана, однако в данных условиях происходит быстрое окисление сульфоксида в сульфон, содержание которого через 4 сут после внесения исходного сульфида достигает 13 и 17 % соответсвенно (таблица 9). Кроме того, высокое содержание остаточного н-алкана в продуктах реакции осложняет стадию очистки и анализ оптически активных (R)-сульфоксидов. Таким образом, наиболее оптимальным является использование 0,1 об. % н-гексадекана (таблица 9).
Известно (Li et al., 2011b; Mascotti et al., 2013; Ramadhan et al., 2013), что гидрофобные свойства окисляемых сульфидных субстратов диктуют необходимость применения в реакциях их биотрансформации органических растворителей, что способствует лучшему растворению сульфидного субстрата, повышению его биодоступности для бактериальных клеток и зачастую увеличению стереоселективности процесса. При использовании дополнительных растворителей в процессе биотрансформации тиоанизола свободными клетками гордоний отмечается увеличение показателей уровня конверсии сульфида в 1,15– 1,35 раза, по сравнению с таковым без использования растворителей. Наибольшая сульфидокисляющая активность гордоний регистрируется при растворении тиоанизола в изобутаноле или диметилсульфоксиде (степень конверсии составляет 95–100 %), при этом энантиомерный избыток полученных сульфоксидов также возрастает (до 90,3 % ее), по сравнению с контрольным вариантом (57,1 % ее). По нашим данным, оптимальным является применение изопропанола, поскольку при этом обеспечивается высокий уровень биоконверсии (93 %) тиоанизола и энантиомерного избытка сульфоксида (93 % ее), по сравнению с другими растворителями (таблица 10).
Влияние использованных растворителей тиоанизола на сульфидокисляющую активность клеток G. terrae ИЭГМ 1 Растворитель Конверсия, % Конфигурация сульфоксида ее, % Без растворителя (контроль) 73,6 R 57,1 Изопропанол 93,0 R 93,2 Этанол 85,0 R 84,0 Диметилсульфоксид 100,0 R 88,6 Диметилформамид 74,0 R 94,8 Изобутанол 95,2 R 90,3 Метанол 35,0 R 86,8 Примечание. Представлены результаты через 4 сут после внесения тиоанизола в среду инкубации гордоний. Данные достоверно отличаются от остальных вариантов опыта, р 0,05. Реакция бактериальных клеток на введение фенилметилсульфида в высоких концентрациях (до 1,5 г/л) проявляется в снижении их биотрансформирующей активности. Как видно из таблицы 11, при внесении фенилметилсульфида в концентрации 1,0 и 1,5 г/л его биоконверсия через 4 сут составляет не более 32 %. При увеличении продолжительности инкубации до 12 сут уровень биоконверсии фенилметилсульфида составляет 35,6–41,2 %. Угнетение процесса высокими концентрациями сульфида подтверждается данными по исследованию респираторной активности. Как видно из рисунка 6, общее количество потребленного кислорода свободными клетками гордоний в процессе биотрансформации тиоанизола в концентрации 1,0 г/л и в присутвии н-гексадекана без внесения сульфида составляет 8888 мкл и 10452 мкл соответственно.
Математическое моделирование процесса биотрансформации тиоанизола иммобилизованными гордониями
В сравнительных экспериментах с использованием приема дробного внесения сульфида первоначальная концентрация фенилметилового сульфида составляла 0,5 г/л, затем каждые 24 ч тиоанизол в среду ферментации гордоний добавляли по 0,5, 0,75 или 1,0 г/л до достижения общей нагрузки сульфида в среде инкубации до 2,0, 4,25 и 5,5 г/л соответсвенно. Как видно из таблицы 17, дробное добавление сульфида в дозах по 0,5 г/л приводит к накоплению в продуктах реакции 18 % нежелательного сульфона уже через 4 сут, вследствие чего продолжение эксперимента было нецелесообразным. Увеличение концентрации дополнительно вносимого сульфида до 0,75 г/л обеспечивает полную биоконверсию 2,0 г/л тиоанизола в (R)-сульфоксид (97,2 % ее) в течение 3 сут. При этом в продуктах реакции сульфон не обнаруживается. При дальнейшем внесении фенилметилсульфида в дозах по 0,75 г/л в постферментационной жидкости присутствует непрореагировавший тиоанизол (3,1 %), (R)-фенилметил-сульфоксид (96,1 % ее) до 89,2 % и сульфон (до 7,7 %). При внесении тиоанизола в дозах по 1,0 г/л его суммарная нагрузка в среде культивирования по окончанию эксперимента составляет 5,5 г/л. Однако через 7 сут содержание (R)-сульфоксида (86,1 % ее) не превышает 70,5 %, а в продуктах биотрансформации регистрируется остаточный сульфид (25,4 %) и сульфон (до 4,1 %) – продукт более глубокого окисления сульфоксида. Дальнейшее продолжение процесса биотрансформации тиоанизола нецелесообразно в виду происходящего разрушения гранул ПВС, что приводит к высвобождению (утечке) бактериальных клеток в среду.
Как видно из таблицы 17, наиболее рациональным является внесение сульфида по 0,75 г/л, при этом химический выход (R)-сульфоксида (96,1 % ее) составляет 85 %. Подобранные условия позволяют осуществлять биоконверсию тиоанизола в условиях минимального содержания углеводородного субстрата (0,1 об. %) и малой концентрации биокатализатора (в перерасчете на сырую биомассу 8,0±0,5 г/л).
Примечание. с, % - содержание сульфида, сульфоксида и сульфона в сумме продуктов реакции. Начальная концентрация сульфида во всех вариантах опыта составляла 0,5 г/л. Каждую новую порцию сульфида (0,5, 0,75 или 1,0 г/л) добавляли каждые 24 ч до достижения общей нагрузки сульфида в среде культивирования 2,0, 4,25 и 5,5 г/л соответственно. Данные достоверно отличаются от результатов, полученных при внесении тиоанизола по 1,0 г/л, p 0,05. Биотрансформация органических сульфидов свободными и иммоблизованными клетками G. terrae ИЭГМ 136. В серии последующих экспериментов исследовали возможность использования клеток G. terrae ИЭГМ 136 для направленного окисления серии прохиральных сульфидов (рисунок 16).
Известно (Matsui et al., 2014), что селективность процессов микробиологической трансформации прохиральных сульфидов в значительной степени зависит от структуры используемого субстрата и типа биокатализатора. В литературе описаны примеры (Holland et al., 1999; Li et al., 2009), когда биотрансформация некоторыми штаммами микроорганизмов приводит к образованию как (R)-, так и (S)-сульфоксидов в зависимости от структуры сульфида.
Как видно из таблицы 18, биотрансформация прохиральных арилалкилсульфидов свободными и иммобилизованными клетками G. terrae ИЭГМ 136 протекает с различной интенсивностью и энантиоселективностью, при этом все полученные сульфоксиды имеют (R)-конфигурацию асимметрического центра. Обнаружено, что на сульфидокисляющую активность как свободных, так и иммобилизованных клеток наиболее значимое влияние оказывает положение заместителей ароматического кольца сульфида. Биотрансформация пара-замещенных арилалкилсульфидов с электроноакцепторными группами (СN, NO2, Cl, Br, F) в ароматическом кольце протекает с высокой степенью биоконверсии (88–100 %) и энантиоселективности (88,6–95,1 % ее). Для сульфидов с электронодонорными группами, п-толил- и п-метоксифенилметилсульфида, отмечается высокий уровень конверсии, который достигает 76,3–92,3 % с использованием свободных и 63,0–86,8 % – иммобилизованных клеток. Наличие атомов хлора, брома, а также донорных метокси- и аминогруппы в орто-положении арилалкилсульфидов приводит к значительному снижению (5–54 %) уровня энантиомерного избытка образующихся сульфоксидов. Ряд авторов (Holland et al., 1984; de Gonzalo et al., 2006, Summers, 2014) отмечают, что подобное влияние на сульфидокисляющую активность бактериальных клеток могут оказывать электронные свойства заместителей в ароматическом кольце сульфида. В случае замены метильной группы на этильную в алкильном радикале фенилэтилсульфида уровень конверсии достигает 88 %, при этом, по сравнению с модельным тиоанизолом, наблюдается снижение энантиоселективности процесса (77–78 % ее).
Примечание СК – свободные клетки, ИК – иммобилизованные клетки. Концентрация сульфидов (г/л): свободными – 0,5, иммобилизованными клетками – 1,5. Исследование операционной и функциональной стабильности биокатализатора на основе иммобилизованных клеток G. terrae ИЭГМ 136. В экспериментах по исследованию возможности многократного применения иммобилизованных клеток для биотрансформации органических сульфидов в оптически активные сульфоксиды в качестве модельного сульфида использовали фенилметилсульфид. Стабильная (84,9–90,5 %) биоконверсия фенилметил сульфида в концентрации 0,5 г/л регистрируется на протяжении восьми циклов использования иммобилизованных клеток G. terrae ИЭГМ 136, что позволяет осуществить в течение 8 сут окисление 4,0 г фенилметилсульфида в целевой (R)-сульфоксид одной порцией биокатализатора (рисунок 17). Энантиомерный избыток (R)-сульфоксида на протяжении первых четырех циклов трансформации достигает 95,6 %. Однако эксплуатация закрепленных в матрице ПВС-криогеля гордоний в последующих циклах трансформации фенилметилсульфида приводит к постепенному снижению энантиомерного избытка образующегося (R)-сульфоксида, уровень которого после восьмого цикла составил 70 %.