Экспериментальное обоснование подходов к этиотропной терапии чумы, вызванной антигенизмененными штаммами возбудителя Люкшина, Елена Юрьевна

Введение к работе

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Yersinia pestis - возбудитель чумы -является этиологическим фактором природно-очагового заболевания, к которому чувствительны более чем 200 видов грызунов. Нозоареалы этой инфекции распространены по всем странам и континентам (исключая Австралию) и при обширных эпизоотиях инфекция может передаваться синантропным грызунам» (мышам, крысам), кошкам, верблюдам и др. Заражение человека происходит при укусах инфицированных блох, разделке туш больных животных, через пищу. От человека к человеку заболевание передается контактным путем при язвенно-бубонных формах инфекции и, что самое опасное, воздушно-капельным путем при чумной пневмонии.

Заболеваемость чумой среди людей за последние десятилетия неуклонно растет. Поданным ВОЗ (цит. по Guiyoule A. etal., 2001), в течение 15 лет (1982-1996) в 24 странах зарегистрировано 23904 случаев чумы (Африка, Азия, Америка), из которых 2105 (8,8%) закончились летально. Имеются регионы, где заболевание чумой отмечается ежегодно с 1969 г. (WER, 2000) и наблюдается четкое нарастание числа больных. Так, за 14 лет (1969-1983) на О.Мадагаскар зарегистрировано 527 случаев, в период с 1984-1997 гг. (15 лет) - 5869; в Перу -за период 1969-1983 гг. (14 лет) - 379 случаев, с 1984 по 1997 гг. (15 лет) - 1826 случаев чумы. За последнее десятилетие увеличилось число сообщений об обнаружении антибиотикорезистентных штаммов чумного микроба (Атшабар Б.Б. и др., 2000; Rasoamanana В. et al, 1989; Lyamuya E.F. et al, 1992; Galimand M. etal, 1997; Guiyoule A. etal, 1998,2001; WongG.D. etal, 2000).

Большую тревогу вызывают вспышки легочной чумы, которые не регистрировались в течение нескольких десятилетий, в Танзании и Китае в 1991 г. (Ткачев А.В. и др., Л994; Lyamuya E.F. et al, 1992), Индии - в 1994 и 2002 гг. (Butler Т., 1994; Gayaraman К., 1994; WER; 2002). В связи с усилением в настоящее время миграции населения, коммерческим туризмом, военными конфликтами существует не только потенциальная, но и реальная опасность завоза этой инфекции в любую страну мира (Мишанькин Б.Н. и др., 1995; Иннокенть-еваТ.И., 2001; БрюхановаГ.Д., 2002). В России известны 12 активных природных очагов чумы, из которых 6 расположены на Северном Кавказе (Грижебов-ский Г.М. и др., 1997). В последние годы отмечены изменения в клинике и течении чумы, стали чаще регистрироваться затяжные формы заболевания, осложняющиеся менингоэнцефалитом, кишечные, ангинозные и другие формы инфекции (Покровский В.И., 1995; Дмитровский AM., 1997). Авторы отмечают, что увеличение клинических проявлений чумы может быть связано с изменчивостью возбудителя, хотя прямых свидетельств этому положению не приводят.

В то же время давно зарегистрировано (Кочкарева А.Ф., 1972; Топорков В.П., 1987; Захаров А.Н., 1989; Баканурская Т.Л., 1991; Meka-Mechenko TV., 2002), что к концу эпизоотии на территории природных очагов увеличивается число случаев выделения от грызунов антигенизмененных форм возбудителя и, прежде всего, утративших способность к продукции, капсульного антигена фракции I (Fra* фенотип), которые могут реверсировать к Fra⁺ фенотипу при сохранении плазмиды pFra. Некоторые авторы связывают такую изменчивость со способностью возбудителя переживать межэпизоотический период в популяции хозяев. Проведя анализ антигенного состава штаммов из разных очагов бывшего СССР, А.М. Кокушкин (1995) приходит к выводу, что число измененных штаммов с разным фено - и генотипом достигает 34%. В.В. Кутырев (1992) описывает выделение природных высоковирулентных штаммов возбудителя, уг-

ГОСИАЦИОНАЛЫМЯ БИБЛИОТЕКА СПс«рб|ТГ j_n

і шиш — і і і ті і чт*Ф

ративших плазмиду pFra (фенотип FraTox"). Целенаправленных исследований по изучению эпидемиологической значимости антигенизмененных штаммов возбудителя чумы не проводилось, хотя описаны заболевания людей с летальным исходом, вызванные возбудителем чумы с Fra* и Fra фенотипом (Lawton W.D., 1960; Winter С.С. et al, 1960; Williams I.E. et al., 1983; 1984). При детальном изучении 52 штаммов чумного микроба, выделенных от людей в разных очагах мира, наряду с типичными выявляли вирулентные штаммы возбудителя чумы, не продуцирующие антиген FI (с плазмидой pFra или без неё) (Лебедева С.А. и др., 2002).

Обнаружение антигена и антител с помощью применяемых в настоящее время коммерческих диагностикумов, основанных на детекции фракции I и антител к ней, оказывается в этих случаях невозможным. Регистрация таких фактов может быть осуществлена только при прямом выделении культуры чумного микроба от больного или умершего, что само по себе весьма сложно даже при неконтролируемом и неадекватном лечении антибиотиками (Терентьев А.Н. и др., 1987). В связи с этим не исключено, что случаи инфекции, вызванные возбудителем с Fra* фенотипом, могут оказаться не диагностированными. Это вызывает настоятельную необходимость внедрения в практику лабораторных исследований коммерческих диагностикумов, способных выявлять Fra" варианты возбудителя (Щербаков А.А. и др., 1990; Орлова Г.М. и др., 1992; Phillips et al., 1988). Важность своевременной детекции антигенизмененных форм чумного микроба обусловлена и тем, что еще в 1965 году В.В. Акимович и Л.Н. Шанина, доказали способность Fra* культур чумного микроба преодолевать противочумный иммунитет.

До последнего времени разработка подходов к этиотропной терапии чумы проводилась только с использованием высоковирулентных, типичных по плазмидному и антигенному составу штаммов чумного микроба. Доказана эффективность препаратов группы аминогликозидов, тетрациклинов, беталакта-мов (включая цефалоспорины III поколения), хинолонов (включая фторхино-лоны), рифампицина. Набор препаратов и схемы их применения представлены в новых «Методических указаниях» (МУ 3.4.1030 - 01, 2001). Исследования, проведенные в нашей лаборатории, показали, что некоторые препараты снижают свою эффективность при инфекции, вызванной природными и экспериментально полученным штаммами чумного микроба с полноценным плазмидным профилем, но утратившими способность к продукции капсульного антигена фракции I (Fra* фенотип). Однако для окончательного решения вопроса о рациональных подходах к экстренной профилактике и лечению инфекции, вызванной антигенизмененными штаммами не только с Fra* фенотипом, но и с FraTox", FraTox*Pst* фенотипом и разным генотипом (полноценный плазмид-ный профиль, генетически измененная pFra плазмида, продукция серологически атипичной фракции I, утрата плазмид pFra, pPst), требуются дополнительные исследования, которые позволили бы обобщить большой экспериментальный материал с последующим отбором эффективных препаратов и разработкой оптимальных схем их применения.

В настоящее время весьма остро стоит вопрос о возможности совершения актов биотерроризма (Онищенко Г.Г. и др., 2000). По критериям, разработанным отечественными учеными (Воробьев А.А., 2001, 2003), позволяющим оценивать степень опасности и вероятности применения биоагентов в качестве бактериологического оружия, чума занимает второе место после оспы; по данным зарубежных специалистов — третье место после оспы и сибирской язвы (Jezek Z.,2000; Leggiadro R.J., 2000; Broussard LA., 2001; Heddurshetti R. et al.,

2001; Klietmann W.F., RuofFK.L. 2001; Martin G.J., Marty A.M., 2001; Polgreen P.M., Helms С 2001; Casadevall A, 2002). Биоагенты должны характеризоваться способностью вызывать инфекцию с атипичной клинической картиной, не поддающуюся лечению антибактериальными препаратами, иметь трудности в диагностике, преодолевать иммунитет. Варианты чумного микроба с Fra', FraTox", Fra" Тох" Pst" фенотипом полностью вписываются в эти требования. По мнению Т.А Гремяковой (2004), в качестве агента биотерроризма наиболее вероятным является использование природных Fra" штаммов возбудителя чумы. Не исключена возможность применения в качестве биоагентов и антибиотикоустойчивых форм возбудителя. Медицинская служба России должна быть готова к адекватному осуществлению полномасштабных противоэпидемических мероприятий на случай чрезвычайной ситуации.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: провести отбор наиболее перспективных для профилактики и лечения чумы антибактериальных препаратов различных групп на основе изучения их активности in vitro и эффективности in vivo на модели чумы, вызванной антигенизмененными (Fra', FraTox", FraTox'Pst") формами возбудителя с различным генотипом и фенотипом.

1. .Провести сравнительное изучение антибиотикограмм штаммов чумного микроба, полноценных в антигенном отношении, и их изогенных вариантов с различным генотипом и фенотипом.

2. .Изучить вирулентность и иммунитетпреодолевающие свойства антигениз-мененных штаммов возбудителя чумы.

3. .Дать сравнительную оценку эффективности различных антибактериальных препаратов в профилактике и лечении экспериментальной чумы белых мышей, обусловленной полноценными и антигенизмененными штаммами чумного микроба.

4. .Изучить возможность возникновения устойчивости к рифампицину и хино-лонам у антигенизмененных вариантов возбудителя чумы с сохранением фенотипа, высокой степени вирулентности и иммунитетпреодолевающих свойств.

5. .Оценить перспективы комбинированной терапии чумной инфекции, вызванной штаммом чумного микроба с Fra" фенотипом.

6. .Разработать ориентировочные схемы применения антибактериальных препаратов и их комбинаций для экстренной профилактики и лечения чумы, обусловленной антигенизмененными штаммами возбудителя.

Впервые в экспериментах использована большая коллекция антигенизмененных штаммов чумного микроба с разным генотипом и фенотипом, уклоняющихся от индикации коммерческими препаратами. Это: изогенные варианты штаммов 231 (от сурка) и 358 (от человека) с типичным плазмидным профилем, но утратившие способность продуцировать фракцию I; штаммы с генетически сконструированной плазмидой pFra, не продуцирующие фракцию I или продуцирующие серологически атипичную фракцию I; штаммы, полностью утратившие плазмиду pFra (фенотип Fra" Тох" ) или обе плазмиды - pFra и pPst (фенотип Fra" Тох" Pst"); природный штамм К-16 (от полуденной песчанки) с фенотипом Fra".

В ходе исследования впервые доказано: -штаммы чумного микроба, утратившие способность продуцировать антиген

FI (независимо от механизмов утраты), "мышиный" токсин, а также лишенные плазмиды pPst, вызывают в экспериментах на мышах затяжной инфекционный процесс, при котором снижается эффективность большинства препаратов, рекомендованных для профилактики и лечения чумы;

-при экспериментальной чуме, обусловленной антигенизмененными штаммами чумного микроба, доксициклин и ампициллин снижают свою эффективность, не обеспечивая эрадикацию возбудителя из макроорганизма, что приводит к рецидиву инфекции при использовании дополнительного контроля эффективности лечения введением животным гидрокортизона;

-фторхинолоны и аминогликозиды обеспечивают высокий профилактический и лечебный эффект в максимальных терапевтических дозах и курсом не менее 7 суток;

-рифампицин не может быть рекомендован как средство монотерапии, так как возникающие с частотой п 10"⁹-n*10^s Rif мутанты возбудителя чумы могут сохранять высокую вирулентность и вызывать инфекцию на фоне лечения этим препаратом;

-устойчивые к налидиксовой кислоте (NaT) мутанты антигенизмененных штаммов чумного микроба обладают перекрестной резистентностью к фторхи-нолонам (МПК=0,4-10,0 мг/л) и при сохранении высокой степени вирулентности способны вызывать инфекцию на фоне интенсивной терапии фторхиноло-нами даже при значениях МПК=0,8-1,6 мг/л;

-при чуме, вызванной Fra" штаммом возбудителя, перспективно использование комбинаций фторхинолонов с рифампицином, цефалоспоринами III поколения или аминогликозидами.

Проведенная оценка эффективности представителей разных групп антибактериальных препаратов в профилактике и лечении экспериментальной чумы у беспородных белых мышей, обусловленной типичными по антигенному составу и антигенизмененными штаммами возбудителя, позволила предложить ориентировочные схемы их применения для экстренной профилактики и лечения чумы. Согласно результатам наших экспериментов доказана:

- нецелесообразность применения доксициклина и ампициллина и их комби-

наций с фторхинолонами;

- перспективность использования в максимальных дозах и курсах применения

аминогликозидов (стрептомицин, амикацин, гентамицин и др.);

фторхинолонов (ципрофлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин);

цефалоспоринов III поколения (цефтриаксон, цефотаксим);

комбинаций фторхинолонов с рифампицином, аминогликозидами, цефалоспоринами III поколения;

комбинаций оральных форм ципрофлоксацина (офлоксацина) и рифампи-цина для целей экстренной профилактики в группах лиц с высоким риском заражения.

На основе полученных данных разработаны «Методические рекомендации по использованию антибактериальных препаратов в профилактике и лечении чумы, обусловленной антигенизмененными формами возбудителя ", одобренные Ученым Советом РНИПЧИ и утвержденные директором РНИПЧИ 26.12.2002г., протокол № 7, которые могут быть полезны для специалистов противочумной системы, врачей-инфекционистов системы здравоохранения РФ

и включены в лекционные материалы на курсах специализации бактериологов по ООИ, на семинарах, проводимых на базе РНИПЧИ.