Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы во многих странах отмечается рост заболеваемости коклюшем (Пигаева JI.A. и соавт., IS86;Lawrence a.j. et ai*, 1987). Это связано с сокращением национальных программ иммунизации из-за высокой реактогенноств АКЦС вакцины (нт j.c. et ai., 1979; Литвинов O.K. и соавт., 1988). В нашей стране все больше детей остаются'невакцинярован-ными благодаря медицинским отводам (Сергиев В.П. и соавт. ,1984). Кроме того, отмечаются случаи заболевания коклюшем привитых детей и взрослых, у которых инфекция протекает в легкой или атипичной формах (Петрова M.G., 1978; Hansman D.J. , 1987). В таких случаях коклюш монет оставаться нераспознанным, что способствует его распространению вследствие высокой контагяоз-ности. По этой причине, а также для рационального лечения больных, необходима ранняя и точная диагностика коклюша.
Бактериологический метод, хотя и является наиболее доказательным, трудоемок, длителен и малоэффективен (Мамаева Е.А., 1983; Ross P.w. et al., 1987).
Из серологических методов для выявления прогивококлюшных антител в сыворотке крови применяются реакция агглютинации, иммуноферментный анализ (viljanen м.к. et al., 1982;' Цветкова Н.В. и соавт., 1983) и непрямой иммунофлюоресцентный метод (Bertrand J.L. et al, І975;йарр І. et al., 1988). Эти способы используются для поздней диагностики коклюша, так как антитела к возбудителям инфекционных болезней выявляются в крови только со второй недели болезни, а у привитых необходимо 2-3 кратное исследование образцов сыворотки крови с интервалом в 1-2 недели. К тому'же эти способы имеют недостатки, 'связанные с негативными моментами при заборе крови.
В связи с этим разработка высокочувствительных и специфичных методов ранней диагностики коклюша весьма актуальна.
Поскольку при коклюше наряду с системным иммунным ответом проявляется и местный иммунитет, отдельными исследователями с помощью иммуноферментного метода были обнаружены в слюне больных КОКЛЮШеМ IgA К КОКЛЮШНЫМ бактериям (Goodman Y.E.et al. ,
[981). Поэтому представляет интерес разработка различных методов выявления секреторных противококлюшных антител в слюне и эценка их диагностической значимости.
Ранняя диагностика коклюша может быть также осуществлена
іутем выявления коклюшных микробов или их антигенов в мате-
риале из носоглотки обследуемых или в первичных посевах этого материала. С этой целью разрабатываются методы генных проб (ДНК-проба) и выявления аденилат циклазы коклюшного микроба в
НОСОГЛОТОЧНЫХ секретах ( Onorato I.M.et al., 1987).
Наиболее перспективными и доступными являются методы имму-ноферментного анализа и реакции'иммунофлюоресценции (Захарова М.С, I982;Hoppe j.e. et al., 1986). Для обнаружения коклюшных микробов предложена прямая иммунофлюоресцеятная реакция (Захарова М.С. а соавт., I968;Hakansson S. et al., I984;Larchet M.
et al. , 1986). Находится в стадии разработки метод иммунофер-ментного анализа (Борисенко Ю.В., 1986; Титова Е.И. и соавт., 1987; Смирнов В.Д. и соавт., 1988). Однако эти методы, как отмечают авторы, характеризуются недостаточно высокой чувствительностью и специфичностью. Вследствие этого необходима разработка высокочувствительного и специфичного непрямого иммуно-флюоресцвнтного метода выявления возбудителя коклюша.
Целью настоящего исследования явилось усовершенствование лабораторной диагностики коклюша для более полного выявления больных.
В з а д а ч и исследования входило :
-
Разработать метод выявления противококлюшных антител в слюне по реакции агглютинации.
-
Изучить возможность использования диагностической тест-системы, разработанной с целью выявления антител к B.pertussi в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа, для обнаружения противококлюшных антител в слюне обследуемых.
-
Разработать высокочувствительный непрямой иммунофлкь оресцентный метод выявления коклюшных микробов в патологическом материале для экспресс-диагностики коклюша.
-
Изучить эффективность выявления больных коклюшем при использовании вновь разработанных методов в сравнения с традиционными методами диагностики коклюша.
-
Разработать оптимальный комплекс методов и схему обсле дования,обеспечивающих наиболее эффективную диагностику коклюша.
Научная новизна исследований. Впервые разработан метод выявления противококлюшных антител в слюне по реакции агглютинации. Установлено, что поствакцинальные антитела обнаружи-
заются б слюне в течение 2 месяцев после завершения иммунизации. У больных коклюшем секреторные антитела.по реакции агглютинации обнаруживаются с I по 14 недели болезни. Показана еоз-монность использования иммуноферментной диагностической тест-системы для выявления противококлюшных антител в слюне. При исследовании методом пммуноферментного анализа слюны детей, больных коклюшем, наиболее информативным является выявление антител и липополисахаридному антигену коклкшного микроба.Впервые разработан непряг.юй иммунофлюоресцентный метод обнаружения коклюшных микробов в материале от больных для экспресс-диагностики "коклюша.
Практическая значимость. Разработанные методы определения противококлюшных антител по реакции агглютинации и с помощью яммуноферментной диагностической тест-системы предлагаются в качестве дополнительных способов диагностики коклюша, как на ранних, так и на поздних сроках болезни. Разработанный непрямой иммунофлюоресцентный метод рекомендуется для экспресс-диагностики коклюша по выявлению коклшных .микробов в материале с задней стенки глотки обследуемых. Он может использоваться также для идентификации выделенных культур в процессе бактериологического анализа и для исследования смывов 5-7 суточных первичных посевов материала от обследуемых при отрицательных результатах бактериологического обследования. Непрямой иммунофлюоресцентный метод позволяет выявить возбудителя коклюша с измененными биологическими свойствами у лиц, лечившихся антибиотиками, привитых и на поздних сроках болезни. По результатам исследований была разработана схема эффективного комплексного обследования на коклюш, включающая непрямой иммунофлюоресцентный и бактериологический методы выявления коклюшных микробов в материале с задней стенки глотки обследуемых и способы обнаружения антител в слюне по реакции агглютинации и с помощью иммуноферментного анализа.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту :
-
Разработанный непрямой иммунофлюоресцентный метод выявления коклюшных микробов, в материале с задней стенки глотки обследуемых позволяет проводить экспресс-диагностику коклюша и является более эффективным по сравнению с бактериологическим.
-
Выявление противококлюшных антител в слюне по реакции
агглютинации является дополнительным методом лабораторной диагностики коклюша.
3. Диагностическая тест-система для определения антител к в.pertussis методом иммуноферментного анализа позволяет выявить антитела не только в крови, но и в слюне обследуемых с подозрением на коклюш.
Внедрение результатов работы. Подготовлены и направлены для утверждения в МЗ РСФСР методические рекомендации "Новые метода ранней и экспресс-диагностики коклюша". Непрямой имму-нофлюоресцентный метод выявления коклюшных микробов был использован при диагностических исследованиях на коклюш в бактериологической лаборатории ГорСЭС г.Казани; в инфекционной больнице № I г.Казани и в работе предприятия МНИЛ и кафедры микробиологии Владивостокского медицинского института. Предложения, касающиеся ранних методов диагностики коклюша, использованы в преподавании на кафедре микробиологии Казанского медицинского института, кафедре эпидемиологии Казанского медицинского института , кафедре детских инфекций- Казанского медицинского института, кафедре микробиологии Горьковского медицинского института. Подана заявка на изобретение "Способ диагностики коклюша" J6 4736011/14 «получено положительное решение о выдаче авторского свидетельства от 28.03.91. Признаны и внедрены 4 рационализаторских предложения: "Способ хранения культуры коклюшного микроба" И 667/28 от 20.05.88 ; "Непрямой метод иммунофлгаорес-ценции для определения коклюшного антигена" № 669/30 от 20.05.88; "Усовершенствованный метод непрямой иммунофлюорес-ценции для определения коклюшного антигена" № 668/29 от 4.II.88; "Метод определения противококлюшных агглютининов в слюне" » 781/39 от 20.11.89 .
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых Казанского государственного медицинского института (1984 г.); УШ научно-практической конференции молодых специалистов НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Пасгера (Ленинград, 1986 г.); республиканской научной конференции "Биология возбудителей инфекционных заболеваний и их экспресс-диагностика" (Горький, 1986 г.); заседании Казанского филиала Всесоюзного общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов им.И.И.Мечникова (Казань, 1987 г.); заседании предметно-
проблемной комиссии по научным основам профилактики и методов диагностики инфекционных заболеваний при Казанском медицинском институте (1991 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 статьи.
Структура и объем диссертации.. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 8 глав собственных исследований, заключения, выводов, рекомендаций в практику и указателя литературы, включающего 237 источников, из которых 139 иностранных. Работа изложена на 217 страницах, содержит 14 рисунков и 63 таблицы.