Введение к работе
Актуальность проблемы. Меляоидоз - тяжелое заболевание человека и животных, относящееся к категории особо опасных инфекций. Возбудитель иелиовдоаа Pseudomonas pseudomallei впервые Сил выделен и охарактеризован акгллкским патологоанатомом WhИтоге в 1912-1913 годах. До настоящего времени ряд особенностей биологии возбудителя остается ыало изученным, что затрудняет разработку методов диагностики и профилактики вызываемого им заболевания. К их числу относится и Феномен лнзогенин. фактически отмеченный несколькими исследователями как облигаткыи видовой признак. Первое сообщение о иелиокдозных фагах сделано R. Legrcux и К. Djemil в 1631г. Последующие исследования зарубежных и отечественных авторов заявили феномен лкзогенки у этого микроорганизма (Томов с со-ант., 1970; Адимов Л.Б.» 1936).
До настоящего времени работы по изучению явления лизогении у"возбудителя иелиоидога и особенностей мелиоидозных бактериофагов немногочисленны. Предпринимались погштки использования мелиоидозных фагоз для диагностики и фаготипирования, но они кг были достаточно эффективными, так как предложенные схемы не являлись универсальными и основывались на результатах анализа небольшого числа штатов. Электронно-микроскопическое изучение фаговых частиц обнаружило неоднородность юг структуры, на основан/л чего келиоидозные бактериофаги были распределены по отдельным группам (Денисов с соавт., 1991; 1995). Исследование траксдуцирующих способностей показало, что мелиоидоаные фаги осуществляют перекос отдельных маокеров, при этом трансдукция
косила межвидовой характер и имела низкую частоту (Манзекш с соавт., 1993).
В настоящее время неяскш остается вопрос о том, в какой мере собственные фаги возбудителя мелиоидоза участвуют в процесса): изменчивости н формировании вирулентности бактериального хозяина, в то время как подобные явления, обусловленные ди-зогенной конверсией, достаточно хорошо изучены у других, в* том числе родственных микроорганизмов (Freeman et al., 1951; Gds-horh et al., 1589; Hayoshi et al., 19S3).
Участие фагов в процессах изменчивости не ограничивается приданием бактериальной клетке новых свойств вследствие присутствия фагов или их влиянием на механизмы регуляции генома бактериального хозяина. Фаги можно рассматривать как перемещающиеся генетические элементы, спссобкь'е осуществлять обмен наследственным материалом в природной клеточной популяции. В практике лабораторных исследований широко используют метод трансдукции - перенос участков хромосому иди плазмиды фагами. Он дополняет и уточняет картину взаиморасположения генов, полученную с помощь» трансформации к конъюгации. Некоторые авторы склонны расценивать значение рекомбинациоккых процессов, включая к траксдукцию, в более скроком смысле, а именно, как взаимодействие различных форм оргакизмоз, результатом которого является повышение уровня биологической организации, то есго осуществление прогрессивной эволюции видов (Суходолец, 19S4; 1988), Возможность использования мелиоидозных бактериофагов для выполнения исследований по указанным визе направлениям оценить довольно сложно, так как в настоящее время объем знаний в этой области крайне ограничен, а отсутствие единой кол-
лекции и обозначения фагоз затрудняют анализ имеющихся в литературе Данных.
Таким образом, изучение феномена лиаогении у P. pseudomallel, степени его распространения среди штаммов данного вида, а также исследование особенностей выделенных бактериофагов определяет актуальность настоящей работы. Исследования проводились в рамках двух плановых государственных тем (11-038-89, 11-023-92).
Цель, работы заключалась в получении экспериментальных дачных, необходимых для систематизации представлений о явлении лизогении у P. pseudomallel и проведении сравнительной характеристики мелиоидозных бактериофагов.
Задачи исследования
-
Изучение распространения явления лизогении у P.pseudo-nallel.
-
Получение "чистых" линий мелиоидозных бактериофагов.
-
Исследование' основных биологических свойств мелиоидоа-ных фагов.
-
Взделение фаговых ДНК и их изучение методом рострикционно-го аналиєа.
КаучнаяноаизнаВ ходе работы впервые проведено изучение частоты спонтанной фагопродукции у штаммов возбудителя мелиоидоза и разграничение их по данному показателю.
Установлена полклизогенность отдельных штаммов P.pseudo-mallei.
Изучена динамика репродукции фагов и определена их урожай
ность. .
Проведена сравнительная характеристика мелиоидозных бак-
териофагов по биологическим свойствам: круг "хозяев", эффективность адсорбции, индукция под воздействием физических и химических факторов, морфология фаговых частиц.
Определена область локализации профагов на хромосоме P.pseudomallel.
Проведен рестрикционный анализ ДНК мелиоидозных Фагов и
определен размер фаговых геномов.
Практическая ценность получен-
ных результатов.
Выделены 15 "чистых" линий фагов P. pseudanallei из музейных штаммов возбудителя мелиоидоза. Коллекция депонирована в Российском научно-исследовательском противочумной институте "Микроб", г. Саратов.
Разработана методика получения мелиоидозных бактериофагов в высоком титре для препаративной работы.
Материалы диссертационной работы использованы при сфорцле-нии методических рекомендаций "Лабораторная диагностика, лечение и профилактика мелиоидоза", утвержденных 1.11.1994 г. заместителем председателя Госкомсанзпнднадзора России Г.Г.Они-ценко.
Полученные характеристики мелиоидозных бактериофагов позволяют использовать их для создания схем фаготипированкя и изучения биологических особенностей патогенных псевдомонад.
Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены на Российской научной конференции 'Тенетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекции", Волгоград, 21-22 октября 1992 года и на научных институтских и межлабораторных конференциях Волгоградского НИПЧИ в 198S -
1994 годах.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, отражающие основное ее содержание.
Положения, выносимые на защиту.
2. Способность спонтанно продуцировать свободный фаг достаточно широко распространена среди штаммов возбудителя мели-окдоаа. Более 70Z изученных музейных штаммов являются дизоген-ными. Для данного вида характерна полилизогения, ряд штаммов содержит фаги, имеюдие различную структурную организацию частиц.
-
Мелиоидоаиые бактериофаги обладают способностью репродуцироваться на бактериальных штаммах собственного вида, Р. mallei, а также некоторых штаммах P. cepacia. Они относятся к фагам умеренного типа, не индуцируются под воздействием ультрафиолетового облучения, акридинового оранжевого и нктрозогу-анидика. Для осуществления процесса адсорбции данные фаги не требуют присутствия кофакторов.
-
Среди изученных фагов выявлено три типа структурной организации фаговых частиц, сходных по форме (икосаэдр) и размерам (4Q нм по граням) капсида и различающихся по строению хвостовых отростков. Они отнесены к 3-й, 4-й и 5-й морфологическим группам по классификации Тихоненко.
-
На основании данных генетической трансформации установлено, что участок локализации профагов 128(м), 129(м) на хромосоме P. pseudcmallei находится вблизи области мутаций met-i.
-
ДНК фагов имеют сайты рестрикции для зндонуклеаз Eco R 1, Xho 1, Sal і и по данным рестрикционного анализа разделяются на три группы гомологии.
Объем и структура работы.