Изыскание и разработка высокоэффективных диагностических препаратов для ускоренной индикации патогенных микроорганизмов Морару, Николай Николаевич

Введение к работе

Актуальность проблемы и темы диссертации. Эффективность борьбы с инфекционной заболеваемостью во многом зависит от своевременной расшифровки лабораториями этиологического диагноза и принятия соответствующих санитарно-гигиенических и противоэпидемических мероприятии. В спою очередь своевременная и точная постановка микробиологического диагноза напрямую зависит от имеющегося в арсенале лаборатории набора средств для быстрой и эффективной диагностики.

Развитые страны благодаря интенсивному развитию за последние десятилетия методов эксспрес-индикации добились ощутимых результатоп и этом направлении. Диагностический арсенал практических лабораторий этих стран постоянно пополняется новыми современными средствами диагностики, что способствует постоянному снижению или сдерживанию роста заболеваемости.

Однако выпускаемые за рубежом диагностические препараты и тест-системы для ускоренной идентификации микроорганизмов остаются по-прежнему недоступными для отечественных лабораторий. Ситуация с инфекционной заболеваемостью в Республике Молдова далека от благополучной. В особенности она усугубилась в последние годы на фоне заметного экономического спада народного хозяйства. Отчасти, это являє гея прямым следствием того, что микробиологическая диагностика большинства инфекционных заболеваний и ГВП в лабораториях среднего и нижнего звена проводится рутинными методами, которые характеризуются трудоемкостью, длительностью и относительной дороговизной.

Исходя из того, что данная ситуация не удовлетворяет современные требования клиницистов, вопросы скорейшего совершенствования методов лабораторной диагностики обретают все большую актуальность.

В ('еснублике Молдова и в ряде стран СНГ на протяжении ряда лет ведутся интенсивные научные исследования по разработке новых ускоренных и экономичных методов лабораторной диагностики. Уместно отметин, вклад в развитие данной отрасли прикладной микробиологии Адамова А.К., Азаренкжа К.С, Акатова А.К., Блохиной И.Н., Генералова И.П., Георіица Ф.И., Гольдина Р.Б., Дьякова СИ., Каральника Б.В., Королюка A.M., Кочеровеца В.И., Меджндова М.М., Никитина В.М., Плугару СВ., Сиволодского Т.П., СичинскогоЛ.А., Соколовой К.Я., Шамардина В.А., Яфаева Р.Х. и др.

Однако, не умалил достойне ти внушительного Числа диагностических препара і on и методов исследования, разработанных указанными и другими

авторами, следует все же сказать, что из-за определенных недостатков далеко не все получили широкое практическое применение.

Таким образом, проблема разработки ускоренных методов индикации патогенных микроорганизмов и особенности простых и доступных для лабораторий среднего и нижнего звена остается по-прежнему актуальной и требует своего дальнейшего решения.

Целью настоящей работы япилось изыскание и разработка высокоэффективных и доступных диагностических препаратов, тест-систем и методов для ускоренной и экономичной индикации патогенных микроорганизмов, в частности, стафилококков.

Задачи исследования:

1. Изыскать, изучить и обосновать научные принципы, технологические приемы и параметры конструирования оригинальных диагностических препаратов, обладающих достаточной чувствительностью и специфичностью для ускоренного и экономичного определения основных ферментов патогенности микроорганизмов.

2. Изыскать новый универсальный носитель для ускоренной биохимической и иммунологической индикации микроорганизмов.

3. Разработать новый энзимосусиензнонный принцип определения ферментативной активности микроорганизмов и создать на его основе серию принципиально новых, высокоэффективных диагностических препаратов.

4. Разработать и сконструировать на основе созданных автономных фунгис-реагентов пластинчатые бумажные диагностические тест-системы для ускоренной и экономичной индикации и идентификации S. aureus.

5. Разработать набор энзимодиагностических препаратов и форме пишущих карандашей многократного применения для ускоренной и экономичной индикации основных маркеров патогенных стафилококков и других микроорганизмов.

6. Испытать и внедрить разработанные диагностические препараты и тест-системы, а также методы их применения для ускоренной индикации и идентификации золотис- ых стафилококков в лабораторную практику.

Научная новизна работы. В результате проведенных экспериментально-поисковых исследований получен универсальный носитель — бисорбент МН и открыт новый энзимосуспензионный принцип определения биохимической активности микроорганизмов, на основе которых разработаны новые высокоэффективные диагностические препараты, тест-системы и методы их применения для ускоренной и экономичной энзимоиндикации микроорганизмов:

7. Изысканы и определены основные параметры и технология получения нового универсального сорбента для определения ферментативной активности микроорганизмов. "Способ получения агента-индикатора для определения ферментативной активности микроорганизмов". (Пол. реш. на выдачу патента № 1430, 1998 г.).

8. Разработан и научно аргументирован новый энзимосуспензионный принцип определения ферментов, основанный на использовании в качестве носшеля и одновременно индикатора энзнматической активности микроорганизмов-суспензий частиц ММ, полученной из хламндоспор пузырчатой головни кукурузы Ustilago maydis. Данный принцип был положен в основу нового направления ускоренной энзиминдикации микроорганизмов, названного нами "энзимосуспензионным".

Нл основе этого принципа были впервые разработаны следующие диагностические препараты и методы:

— метол определения дезоксирибонуюгеазной активности мик
роорганизмов, признанный изобретением (ПоЛ.реш. на выдачу
патента № 1276. 1998);

- способ получения реагента для определения дезоксирибонук-
леазной активности микроорганизмов, признанный изобретением
(Пол.реш. па выдачу патента № 1453. 1998);

метод определения дезоксирибануклеазной активности микроорганизмов, признанный изобретением (Пол.реш. на выдачу патента № 1454, 1998);

метод определения плазмокоагулирующей активности стафилококков, признанный изобретением (Пол.реш. на выдачу патента jVo 1277, 1998);

способ получения реагента для определений плазмокоагули-руюшгй активности микроорганизмов, признанный изобретением (Пол.реш. на выдачу патента № 1455, 1998);

метод определения леиитиназной активности микроорганизмов, признанный изобретением (Пол.реш. на выдачу патента № 1278, 1998):

метод определения гиалуронидазной активности микроорганизмов, признанный изобретением (Пол.реш. на выдачу патента № 1451, 1998);

3. (^}азработана технология и получены новые высокоэффективные пре-
парлты Для оіі(юделения белка Л и фибриноген-аффинитета стафилококков:

- реагент для определения стафилококкового белка А, признанный изобретением (Пол.реш. на выдачу патента № 1319, 1998);

способ получения реагента для определения белка А стафилококков — подана заявка на изобретение (Депозитный № 980190,1998);

реагент для определения фибриноген-аффинитета стафилококков, признанный изобретением (Пол.реш. па выдачу патента № 1320,1998);

способ полунения реагента для определения фибриноген-аффинитета стафилококков — поданм заявка на изобретение (Депозитный № 980189 1998).

комплексный суспензионныый диагностикум для одновременного определения белка А и фибриноген-аффинитета стафилококков;

твердофазный микрореагсНт для одновременного определения белка А и фибриноген-аффинитета стафилококков.

4. Изысканы и разработаны научные принципы, технологические
приемы и на их основе созданы принципиально новые, оригинальные
диагностические препараты в форме пишущих карандашей многократного
применения:

индикаторный карандаш для ускоренного определения фосфатаэнои активности микроорганизмов, признанный изобретением: "Способ определения фосфатаэнои активности микроорганизмов" (А.с. СССР № 1726516,1990);

индикаторный карандаш для определения фибриноген-аффинитета стафилококков, признанный изобретением: "Способ определения хлопьеобразующего фактора стафилококков" (Патент MD № 728,1997);

индикаторный карандаш для комплексного определения фибриноген-аффинитета и фосфатаэнои активности стафилококков (Удостоверение на рацпредложение № 2511, 1991);

индикаторный карандаш для определения теллурит-редукта-зы микроорганизмов (Удостоверение на рацпредложение № 2439.1991);

индикаторный карандаш для определения каталазы микроорганизмов, признанный изобретением: "Препарат для определения каталазы микроорганизмов" (Патент MD № 287, 1995).

5. Изучены варианты оптимальной интеграции основных маркеров
патогенности стафилококков, которые были реализованы при создании
высокоэффективных пластинчатых диагностических тест-систем,
позволяющие быстро, экономично и с высокой степенью достоверности
проводить индикацию и идентификацию золотистых стафилококков.

Практическое значение работы. Разработаны и предложены для практического Применения принципиально новые автономные высоко-

эффективные диагностические препараты многократного и одноразового использования, а также комплексные тест-системы, которые отличаются высокой эффективностью и доступностью для практических лабораторий всех уровней.

Суспензионные диапюстикумы и твердофазные микрореагенты, разработанные на основе нового принципа определения ферментов микробов с использованием в качестве индикаторного агента биохимической активности сенсибилизированных механических частиц, значительно упрощают, удешевляют и ускоряют процедуру идентификации микроорганизмов. Их отличает также широкая доступность, так как носитель (хлами-досиоры пузырчатой головни кукурузы) весьма распространен и имеет очень нпзкуют себестоимость.

Разработанные и предложенные энзймодиагностические препараты в виде пишущих карандашей многократного применения являются весьма удобными в работе и позволяют быстро, точно и экономично, без использования питательных сред и других стерильных материалов определить наиболее важные ферменты микроорганизмов.

Сконструированные и предложенные тест-системы для ускоренного скрининга золотистых стафилококков позволяют существенно упростить, удешевить и, главное, значительно ускорить получение результатов анализа. Следовательно, расширяются диагностические возможности лабораторий, что позволяет своевременно и оперативно осуществлять необходимые противоэпидемические и санитарно-гигиенические мероприятия. Это особенно актуально в настоящее время, когда резко обострилась проблема впутрибольничных инфекций, среди возбудителей которых одно из лидирующих мест занимает золотистый стафилококк.

Основные положения, выносимые на защиту:

9. Научно обоснованные технологические приемы получения нового универсального суспензионного бисорбента МИ из хламидоспор пузырчатой головни кукурузы Ustilago maydis.

10. Новый энзимосуспензиомный принцип определения ферментативной активности микроорганизмов с использованием в качестве Носителя и одновременно индикатора биохимической активности универсального суспензионного сорбента Ml I с учетом результатов реакций по феноменам агрегации или дезагрегации частиц носителя.

11. Разработанный впервые комплекс новых высокоэффективных эн-зимодиапюстических препаратов для ускоренного И экономичного определения ДНКазной, плазмокоагулаэной, лецнтинаэной и гиалуронидаз-ной активности микроорганизмов.

4. Разработанный впервые на основе нового универсального носителя-бисорбента 1\$Н комплекс диагностических препаратов для определения белка А и фибриноген-аффинитета стафилококков.

5. Разработанный набор принципиально новых автономных энзимо-диагностических препаратов в виде пишущих карандашей многократного применения для ускоренной индикации ферментов микроорганизмов без использования питательных сред.

6. Разработанные и сконструированные на основе использования ключевых признаков патогенности золотистых стафилококков, новые оригинальные пластинчатые диагностические тест-системы, позволяющие провести быстрый и экономичный скрининг этих микроорганизмов, играющих в настоящий момент доминирующую роль в гнойно-воспалительной патологии человека.

Апробация работы. Основные результаты исследований были доложены и обсуждены на следующих научных форумах:

научно-практических конференциях ГУМФ им. Тсстемииану (1992, 1993, 1994);

научно-практических конференциях МНУМ (1997, 1998);

всесоюзная конференция "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии" (Махачкала, 1990, 1992);

/// конференция инфекционистов Республики Молдова (Кишинев, 1991);

Ill Съезд Гигиенистов Микробиологов и Эпидемиологов РМ (Кишинев, 1992);

Съезд медико-биологі'ческих обществ Мод<іовьі (Кишинев, 1993);

XVIII Съезд Румынско-Американской Академии Науки и Искусств (Кишинев, 1993);

/// Национальная конференция с международным участием "Микроорганизмы и их метаболиты в национальной экономике" (Кишинев, 1996);

— Национальная конференция с международным участием
"Актуальные проблемы железнодорожной медицины" (Кишинев, 1996);

IV Съезд Гигиенистов, Микробиологов и Эпидемиологов РМ (Кишинев, 1997);

Национальный симпозиум паразитологов Румынии (Крайова, 19^Q8);

IIнаучно-практическая конференции "Актуальные проблемы акушерского стационара" (Тольятти, 1998);

— Национальный Симпозиум "Вклад научных исследований в
прогрессе ветеринарной медицины" (Бухарест, 1998);

специализированная вставка "Know-how Exc hange 1998" (Кишинев, 1998);

Национальная конференция молодых микробиологов и биотехнологов "Микробиологические достижения и перспективы" (Кишинев, 1998) и на расширенном заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии МИУМ совместно с микробиологическим отделом НИИ ОЗМиР МЗ РМ.

Разработаннные в результате исследования методы и диагностические препараты положены п основу законченной научно-исследовательской работы по теме "Разработка методов и средств ускоренного определения патогенности микроорганизмов регенерированных вод", выполненной для Института медико-биологических проблем Мо СССР по Хоздоговору № 27 от 25.12.1988 (1988—1993), в которой соискатель являлся ведущим научным сотрудником. Составлены "Методические рекомендации по применению диагностических тестов для экспресс-индикации патогенных стафилококков, выделенных из лекарственных средств фармацевтической промышленности" (утверждены Уч. Советом Центра Патологии АН РМ, 1992 год) и "Методические указания по проведению анализов с помощью диагностической тест-системы для экспресс-индикации стафилококков в средствах фармацевтической промышленности (утверждены Уч. Советом Центра Патологии АН РМ, 1993 год).

По теме диссертации опубликовано свыше 40 научных работ. Получены 3 авторских свидетельства на изобретения и 10 положительных решений на выдачу патента; 22 удостоверения на рационализаторские предложения и подано 2 заявки на изобретение в AGEPI Республики Молдова.

Результаты исследовании используются в микробиологической лаборатории НИИ ОЗМ и РМЗ РМ и в ряде лабораторий ЦРБ.

Теоретические положения и практические рекомендации диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре микробиологии МНУМ, ГУМФ им. Тестемицану и Университета "Ovidius" (Констанца, Румыния).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы и приложения. Список литературы включает 479 источников. Работа изложена на 201 странице машинописного текста, содержит 30 таблиц, 12 рисунков, и 25 фотографий.