Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Увеличение в 1990-1993г. заболеваемости дифтерией, наряду с проблемой охвата населения иммунизацией (Зимина Л.Г., Зайцева О.Н., 1993; Маркина C.C.,1996; Farizo К.М. et ,31.,1993: Simonson О., 1989), ставят вопрос и о качестве используемого для профилактики препарата -дифтерийного анатоксина (ДАТ).
Для решения этой задачи исследования проводятся в двух направлениях: во-первых, разрабатываются новые препараты вакцин для создания не только антитоксического, но и антибактериального иммунитета (Мац АН., Булк В.Ф., 1969; Шмелева Е.А., 1991) и, во-вторых, совершенствуется процесс получения дифтерийного токсина-анатоксина (Сиротинский А.В. с соавт., 1995).
В биотехнологической цепочке получения ДАТ, наряду с другими этапами, особо важными являются процесс культивирования C.diphtheriae и оценка накопления ДТ. Однако, действующая в настоящее время система контроля промышленных процессов биосинтеза ДТ включает только некоторые периодически измеряемые параметры (рН, t) и величины, характеризующие состояние культуры (концентрация биомассы - OD/мл, накопление антигенного материала - Lf/мл и биологические свойства - DLM/мл).
В то же время данные о различной иммуногенности ДАТ при
одинаковом содержании антигенного материала, определяемого в
реакции флокуляции (РФ) (Валдохина И. Ф., 1972; Чеботарева
СВ., Черткова Ф.Н, 1973 и др.) ставят вопрос о стандартизации
ДТ, в том числе на основе выбора более чувствительных и
специфических тестов его оценки. Имеющиеся сведения о
взаимосвязи токсинообразования с активностью дыхания (Эссель
Е.А. 1960; Наумов Л.С.. 1967; Pappenheimer L., 1977; Машилова
Г.М. с соавт., 1977) являются предпосылкой к расширению спектра
используемых контрольных параметров, отличающихся
информативностью и оперативностью.
Поэтому целесообразно, говоря о подходах к стандартизации
ДТ, обратить особое внимание на изучение различных физико-
химических условий культивирования (окислительно-
восстановительного потенциала, состава отходящей из ферментера
газовой смеси и др.) и оценку накопления ДТ, с использованием,
наряду с традиционными таких современных методов, как тесты
микроцитотоксичности на культурах клеток и ИФА с
моноклональными антителами (МкАт) (к протективному С-концевому
участку ДТ) и поликлональными (ПкАт). Такой подход может способствовать разностороннему изучению процессов получения нативного токсина с постоянным фракционным составом и избежать значительной вариабельности иммунобиологических свойств серий
ДАТ.
ЦЕЛЬ НАСТОЯЩЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ заключается в изучении физиолога - биохимических особенностей C.diphtheriae PW8 на основе использования различных физико-химических параметров процесса периодического глубинного культивирования и современных тестов оценки активности токсина in vitro.
Для осуществления поставленной цели предполагалось решение следующих конкретных задач:
-
Изучение влияния окислительно-восстановительного потенциала на биосинтетические свойства C.diphtheriae PW8 при глубинном периодическом культивировании.
-
Анализ динамики потребления кислорода и выделения диоксида углерода в отходящей из ферментера газовой смеси в сравнении с накоплением биомассы и антигенного материала.
-
Определение влияния содержания углеводного субстрата (глюкозы) на рост и накопление антигенного материала в динамике глубинного периодического выращивания C.diphtheriae PW8.
-
Сравнительное изучение динамики накопления антигенного материала в РФ и токсина в ИФА с использованием МкАт и ПкАт в процессе глубинного периодического культивирования C.diphtheriae PW8.
-
Изучение взаимосвязи биологической (токсической) активности ДТ, определяемой in vivo (по DLM на морских свинках) и in vitro (по МЦТД в культуре клеток СНО.
I НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Показана информативность и
целесообразность включения в систему контроля процессов
культивирования C.diphtheriae PW8, таких параметров, как
окислительно-восстановительный потенциал, концентрации кислорода
и диоксида углерода в отходящей из ферментера газовой смеси, и
тестов оценки накопления ДТ по, данным ИФА с МкАт и
микроцитотоксичности в культуре клеток СНО.
Отмечено, что увеличение, j окислительно - восстановительного
потенциала исходной питательной среды сказывается на
биосинтетических свойствах микроорганизмов, в частности, на
увеличении скорости накопления антигенного материала.
На основании профиля : изменений окислительно восстановительного потенциала и концентраций кислорода и диоксида углерода можно судить о фазах роста и дать ориентировочную оценку накопления антигенного материала.
Отмечено, что стабилизация уровня высокой интенсивности дыхания C.diphtheriae совпадает с периодом высокой удельной скорости накопления антигенного материала.
В процессе глубинного периодического культивирования C.diphtheriae изучено накопление токсина в ИФА с МкАт и ПкАт и его токсичности по МЦТД в культуре клеток СНО и показана большая информативность этих тестов по сравнению с реакцией флокуляции, как методов контроля за процессом получения стандартных препаратов. Выявлена прямая корреляция (г=0,98) при сравнительном изучении токсической активности ДТ in vivo на морских свинках и in vitro в культуре клеток СНО. При этом показано, что динамика накопления токсина в вышеуказанных тестах совпадает с данными, полученными в ИФА с МкАт.
На основании литературных и экспериментальных данных составлена комплексная система оценки процесса культивирования C.diphtheriae и накопления ДТ, расширяющая спектр общепринятых показателей.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Впервые показана целесообразность включения в систему обязательных критериев характеристики питательных сред их окислительно-восстановительного потенциала, влияющего на качество целевого продукта микробного синтеза.
Дано научное обоснование расширения существующей схемы оценки ДТ в условиях производства, заключающееся в возможности быстрой и точной биологической активности препаратов in vitro в культуре клеток СНО (по МЦТД) и ИФА с МкАт.