Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные аспекты патогенеза урогенитального трихомониаза (обзор литературы) 10
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Объект исследования 32
2.2. Исследуемый материал 34
2.3. Предмет исследования 35
2.4. Условия культивирования и хранения микробных культур 35
2.5. Питательные среды 37
2.6. Методы лабораторного исследования 38
2.7. Статистический анализ материала... 47
Глава 3. Изучение внутривидового гетероморфизма TRICHOMONAS VAGINALIS 50
3.1. Изучение внутривидового гетероморфизма T. vaginalis в организме мужчин с хроническим урогенитальным трихомониазом 51
3.2. Изучение гетероморфизма T. vaginalis в зависимости от течения хронического урогенитального трихомониаза у мужчин .62
Глава 4. Изучение влияния антипротозойных препаратов на изменчивость TRICHOMONAS VAGINALIS 79
4.1. Изучение резистентности в популяции T. vaginalis к антипротозойным препаратам, используемым в клинической практике 80
4.2. Изучение влияния антипротозойных препаратов на изменчивость морфотипа T. vaginalis
Глава 5. Изучение изменений в микробиоценозе урогенитального тракта мужчин при хронической трихомонадной инфекции
5.1. Микроэкологические особенности урогенитального тракта здоровых мужчин 96
5.2. Микроэкологические особенности урогенитального тракта мужчин с хронической трихомонадной инфекцией 109
5.3. Сравнительная характеристика микробиоценоза урогенитального тракта здоровых и больных трихомониазом мужчин 122
Заключение .143
Выводы 149
Список литературы 151
Список сокращений 179
Благодарности
- Исследуемый материал
- Изучение гетероморфизма T. vaginalis в зависимости от течения хронического урогенитального трихомониаза у мужчин
- Изучение влияния антипротозойных препаратов на изменчивость морфотипа T. vaginalis
- Сравнительная характеристика микробиоценоза урогенитального тракта здоровых и больных трихомониазом мужчин
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Инфекции, передаваемые половым путем, остаются сложнейшей медико-социальной и экономической проблемой во всем мире (Юнусова Е.И., 2014). Особое внимание среди этих инфекций заслуживает урогенитальный трихомониаз. Сегодня известны эпидемиологические особенности и клинические формы данного заболевания, прослежены иммунные сдвиги в организме больных, активно изучается его патогенез, однако урогенитальный трихомониаз продолжает занимать лидирующее положение среди половых инфекций у людей репродуктивнозначимого возраста (Черешнев В.А., 2011). Прежде всего это обусловлено преобладанием вялотекущих и бессимптомных форм заболевания, поскольку в таких случаях пациенты долгое время не обращаются за медицинской помощью, что увеличивает риск заражения здоровых людей (Прохоренков В.И., 2014). Кроме того, стертость клинических проявлений урогенитального трихомониаза способствует развитию у больных хронического, часто рецидивирующего процесса, ведущего к тяжелым постинфекционным осложнениям. К числу последних относятся воспалительные заболевания органов малого таза и мошонки, нарушение репродуктивной функции у молодых людей, снижение эффективности применения репродукционных технологий и даже онкопатология (Гриценко В.А., 2013). Научную и практическую значимость в проблеме урогенитального трихомониаза определяет и вопрос об изменчивости возбудителя инфекции (Рюмин Д.В., 2011). В связи с этим, большой интерес вызывают его атипичные формы, роль которых в патогенезе заболевания до сих пор не установлена. Кроме того, в научных публикациях есть данные о том, что трихомонады, нарушая равновесие в сбалансированной системе «макроорганизм-микрофлора», становятся причиной дисбиоза, обуславливающего возникновение оппортунистической инфекции (Кулага О.В., 2008).
Все вышеизложенное определило цель диссертационной работы: изучить изменчивость морфотипа T. vaginalis в зависимости от клинических проявлений заболевания и определить ее влияние на формирование патобиоценоза в урогенитальном тракте мужчин с хроническим трихомониазом. Для реализации поставленной цели были определены задачи исследования:
1. Установить взаимосвязь между морфотипом T. vaginalis и степенью
выраженности воспалительного процесса в урогенитальном тракте больных мужчин.
2. Оценить возможность использования морфотипа возбудителя как
диагностического критерия этиологической значимости при развитии хронического
урогенитального трихомониаза.
-
Определить влияние антипротозойных препаратов на уровень изменчивости в структуре популяции T. vaginalis.
-
Изучить влияние T. vaginalis на формирование патобиоценоза в урогенитальном тракте больных мужчин.
Научная новизна исследования. В организме мужчин, страдающих хроническим урогенитальным трихомониазом, встречается выраженный гетероморфизм возбудителя инфекции с преобладанием его атипичных форм. Впервые установлена умеренная ассоциативная взаимосвязь между морфотипом T. vaginalis и степенью активности воспалительного процесса в урогенитальном тракте больных мужчин, а также то, что морфотип возбудителя трихомонадной инфекции зависит от места локализации патогена в мочеполовых путях обследованных пациентов. Впервые показано влияние антипротозойных препаратов на изменчивость простейших, которая носит адаптивный характер. Наличие возбудителя трихомонадной инфекции в урогенитальном тракте больных способствует формированию патобиоценоза, в котором простейшие вступают в ассоциативные взаимоотношения с отдельными видами собственной микрофлоры. Факультативно-патогенные микроорганизмы испытывают индуцирующе-стимулирующее влияние со стороны T. vaginalis и характеризуются выраженным патогенным потенциалом.
Теоретическая и практическая значимость исследования. Выполненный комплекс экспериментальных исследований дополняет картину патогенетических механизмов воздействия T. vaginalis на организм человека. Полученные данные позволяют расставить приоритеты в последовательности выделения трихомонад из клинического материала больных мужчин в зависимости от клинических проявлений заболевания. Морфотип T. vaginalis может использоваться как прогностический критерий для верификации диагноза, оценки течения заболевания и определения эффективности проводимой у больных антипротозойной терапии. Установлена резистентность изолятов T. vaginalis, циркулирующих в организме обследованных пациентов, к широко используемым антипротозойным препаратам, что свидетельствует о необходимости проведения постоянного мониторинга для оценки эффективности лечения таких больных. Выявлены наиболее значимые ассоцианты T. vaginalis и факторы их патогенности среди представителей нормальной микрофлоры урогенитального тракта больных мужчин, что позволяет клиницистам разработать на их основе новые подходы в терапии хронического урогенитального трихомониаза и профилактике его осложнений. Результаты исследований легли в основу разработки способа диагностики урогенитального трихомониаза (Патент Российской Федерации на изобретение № 2552320), а также
методических рекомендаций для последипломной подготовки по специальности бактериология на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии с курсом КЛД ГБОУ ВПО ИГМУ.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
В клиническом материале мужчин с хроническим урогенитальным трихомониазом атипичные формы T. vaginalis преобладают над типичными, их появление – есть результат адаптивной возможности простейших, обеспечивающий длительное пребывание в организме человека.
-
Определение морфолого-функциональных свойств T. vaginalis является необходимым условием достоверной диагностики поражений урогенитального тракта больных мужчин, а также важным показателем эффективности проводимой антипротозойной терапии.
-
Антипротозойные препараты оказывают влияние на морфолого-функциональные свойства возбудителя, которые в свою очередь определяют степень выраженности воспалительной реакции в урогенитальном тракте.
-
Изменения в микробиоценозе урогенитального тракта мужчин с хронической трихомонадной инфекцией свидетельствуют о селекции собственной микрофлоры и увеличению содержания микроорганизмов с выраженными агрессивными свойствами, способствующими развитию осложнений в виде сочетанных инфекций.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на: 75-й научно-практической конференции «Вопросы клинической и экспериментальной медицины» (29 апреля 2008 года, Иркутский государственный медицинский университет, Иркутск); V молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (26 – 28 октября 2010 года, Институт Микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва); областной научно-практической конференции, посвященной теме «Актуальные вопросы дерматовенерологии и косметологии» (13 – 14 апреля 2010 года, Иркутский государственный медицинский университет, Иркутск); Всероссийской конференции молодых ученых «Биоразнообразие: глобальные и региональные процессы» (14 – 17 сентября 2010 года, Институт общей и экспериментальной биологии СО РАМН, Улан-Удэ); научной конференции с международным участием «Этиологические, эпидемиологические и клинические аспекты инфекционных болезней», посвященной 90-летию кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ИГМУ (15 – 17 сентября 2010 года, Иркутск); заседании проблемной комиссии «Инфекционные болезни, эпидемиология и микробиология» ИГМУ (протокол
№ 3 от 17 апреля 2014 года, Иркутск); Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микробиологии и клинической микологии XVII Кашкинские чтения (9 – 11 июня 2014 года, Санкт-Петербург); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Природно-очаговые и другие актуальные инфекции Сибири и Дальнего востока» (16 – 18 сентября 2015 года, Иркутск).
По материалам диссертационной работы опубликовано 11 работ, 7 из которых относятся к изданиям ВАК Минобрнауки РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 180 страницах печатного текста, состоит из введения, 5-ти глав (обзора литературы, главы по описанию материала и методов исследования, 3-х глав собственных исследований и обсуждения результатов), заключения, выводов, списков литературы и сокращений. Библиографический указатель включает 264 источника, в том числе 191 отечественный и 73 зарубежный. Текст диссертации содержит 67 таблиц и 54 рисунка.
Связь работы с научными программами и личный вклад автора.
Диссертационная работа выполнена в рамках научной темы «Этиологические, патогенетические аспекты, региональные особенности эпидемиологии и клиники инфекционных заболеваний, характерных для Восточной Сибири и сопредельных территорий, разработка методов профилактики и лечения этих заболеваний» на базе ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ (№ гос. регистрации 01.2.00304318). Автором лично определена программа, выбраны объекты, методы и объем исследования. Собраны исходные данные, из которых сформирована электронная база данных Excel. Выполнен комплекс микробиологических исследований на основе микроскопического и культурального методов. Проведены экспериментальные исследования по изучению роста культур T. vaginalis в условиях периодического культивирования и определению факторов патогенности у выделенной микрофлоры. Автором выполнен математико-статистический анализ полученных данных. Подготовлена диссертационная работа, в которой в обобщенном виде представлены результаты исследования, сформулированы основные положения и выводы.
Исследуемый материал
Жизненно важными структурными элементами T. vaginalis являются гидрогеносомы (рис. 5/г): паракостальные и паракостилярные. Последние располагаются вдоль аксостиля параллельными рядами и являются отличительной чертой T. vaginalis [65]. Жгутиконосец лишен митохондрий, функцию которой у него осуществляет гидрогеносомы, которые не имеют крист, цитохромов и ДНК. Они обеспечивают клетку энергией. Вследствие ферментативного окисления пирувата конечные протоны и электроны в гидрогеносомах соединяются между собой и образуют молекулярный водород [193]. Энергетически это менее выгодно, чем кислородное дыхание. Однако следует отметить, что отсутствие митохондрий у трихомонады является результатом редукционной эволюции, которая направлена на реализацию «экономически» выгодной стратегии приспособления микроорганизма к специализированным, узким экологическим нишам в организме человека [180]. Кроме того, есть мнение, что гидрогеносомы у T. vaginalis отвечают за развитие ее устойчивости к антипротозойным препаратам [63; 227; 239].
Следует указать, что, несмотря на некоторое сходство энергетического метаболизма Trichomonas с таковым у примитивных прокариот, в отношении углеводородного метаболизма она демонстрирует черты, свойственные высшим эукариотическим организмам. Углеводородный метаболизм у нее контролируется ферментами, работающими как в аэробных, так и в анаэробных условиях, что зависит от среды, в которой находится простейшее. При этом продуктами ее метаболизма являются: ацетат, лактат, малат, глицерол, углекислый газ, а в анаэробных условиях дополнительно выделяется водород [72; 113]. Способность перестраивать свою метаболическую активность у трихомонад в разных условиях среды не случайна, а является дополнительным механизмом адаптации паразита, следствием которого может быть образование в организме человека разных цитоморфологических форм возбудителя.
В передней части клетки простейших расположено ядро (рис. 5/N). В нем содержится наследственный аппарат, представленный тремя парами хромосом [95]. Известно, что генетический материал паразита на 65,0 % состоит из повторяющихся участков, которые образовались за счет дупликации групп функционирующих генов [247]. Прочитав геном трихомонад, ученые пришли к выводу, что некоторые его участки обеспечивают паразиту способность длительно выживать в организме человека. Так, были найдены гены, отвечающие за способность паразита заглатывать отдельные белковые молекулы или цельные клетки эпителия и бактерий, являющихся дополнительным питательным субстратом для возбудителя [259]. Как выяснилось, в структуре генома T. vaginalis содержатся генетические элементы бактериального происхождения [13; 264]. Есть данные, свидетельствующие о том, что она заимствовала эти гены у бактерий группы Bacteroidetes. Основная часть этих генов кодирует адгезивные белки (АР 6, АР 23, АР 33, АР 51), обеспечивающие прикрепление паразита к чувствительным клеткам уроэпителия человека [263]. Кроме того, детально проведенный анализ генома T. vaginalis показал присутствие в его структуре генетического материала человека. Благодаря его наличию трихомонада оказывается способной экскретировать вещества, антигенно-идентичные тканям человека [47]. Подобный механизм, выработанный в ходе эволюции, является более совершенной защитой паразита от повреждающего действия факторов неспецифической защиты, включая систему HLA. В геноме трихомонады найдено уже более 165 подобных генов [222]. Следует отметить, что присутствие в генетической структуре трихомонад чужеродного материала обеспечивает им адаптивное преимущество, вследствие чего они могут приспосабливаться к изменяющимся условиям среды и длительно персистировать в организме человека.
Таким образом, в ходе эволюции по мере увеличения зависимости представителей семейства Trichomonadidae от организма человека происходило совершенствование межвидовых взаимоотношений, результатом которого стала паразитическая форма сожительства. К такой форме симбиоза относят взаимоотношения, складывающиеся между организмом человека и T. vaginalis, которая относится к классическим патогенам, передающимся преимущественно половым путем и поражающим урогенитальный тракт человека [138]. Патогенный вид использует человека не только как место обитания, но и как источник питания – что, по мнению Е.Н. Павловского: «хозяин не есть один из компонентов сожительства двух животных организмов, а та среда, в которой живет и к которой приспосабливается паразит» [191].
Данные о структуре трихомонад, накопленные со времен их первого описания и подтвержденные современными методами исследования, дают подробную информацию о морфолого-функциональных особенностях паразитического вида простейших [5; 156; 157]. Основываясь на них, следует отметить, что переход Trichomonadideae к паразитизму не был связан с морфофизиологическим регрессом, а наоборот, является переходом на новый этап развития простейших и сопровождается появлением дополнительных свойств и механизмов адаптации к организму хозяина.
Входными воротами при урогенитальном трихомониазе у мужчин является слизистая оболочка уретры, на которую возбудитель попадает преимущественно после прямого контакта с больным или выделителем патогенных трихомонад [39]. При этом важным условием для развития инфекционного процесса является возможность преодоления паразитом факторов неспецифической резистентности макроорганизма [22].
Изучение гетероморфизма T. vaginalis в зависимости от течения хронического урогенитального трихомониаза у мужчин
Для выделения факультативно-патогенной микрофлоры используется метод секторного посева по Голду [127]. Идентификация выделенных микроорганизмов проводится в соответствии с Приказом МЗ СССР № 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений» от 22.04.85 года и методическими рекомендациями «Бактериологические исследования на условно-патогенные микроорганизмы» от 19.12.91 года (рис. 13).
Для определения факторов патогенности нормальной микрофлоры из чистых культур микроорганизмов готовится суспензия. Для этого отбираются только однотипные колонии, выросшие на твердом агаре. С помощью бактериальной петли (d = 2,0 мм) они переносятся в пробирку со стерильным изотоническим раствором (0,9 % NaCl) так, чтобы плотность инокулюма соответствовала 0,5 по стандарту Мак-Фарланда (1,5 х 108 КОЕ/мл) [128].
Для определения патогенного потенциала собственной микрофлоры, исследуются наиболее значимые факторы ее патогенности (рис. 14).
Для определения адгезивно-колонизационных свойств микроорганизмов 1-й этап исследования:
Первичный посев исследуемого материала: соскоба из уретры, секрета простаты и эякулята (1,0 мл) на питательные среды: Кровяной 5,0 %, Шадлер 5,0 %, Актиномицет, Шоколадныйагар, Сабуро, МакКонки, Левенштейн-Йенсена Посев проводился в течение 2 часов с момента забора биоматериала 2-й этап исследования: Выделение и накопление чистых культур: мазок по Граму, Романовскому-Гимзе, Циль-Нильсену. Отбор и отсев подозрительных колоний на скошенный агар Просмотр посевов и отсев подозрительных колоний 3-й этап исследования: Работа с чистыми культурами: проведение биохимических тестов Посев на селективные и дифференциально-диагностические среды 4-й этап исследования: Окончательная идентификация культур и определение факторов патогенности Учет результатов биохимических тестов и факторов патогенности Рис. 13.Культуральный метод исследования биоматериала на собственную микрофлору Факторы патогенности собственной микрофлоры 1 1 II. Собственно-болезнетворные:-фибринолизин- гемолизины-лецитовителаза-ДНКаза- секреция протеаз ir I. Адгезивно-колонизационные : - адгезия на эритроцитах III. Защитные:– плазмокоагулаза– щелочнаяфосфатаза
Используется методика В.И. Брилис [15]. Согласно ей, клеточным субстратом служат формалинизированные эритроциты человека 0(I) Rh + группы, предварительно дважды отмытые буферным раствором (0,1 М раствор фосфата Na, приготовленного на изотоническом растворе 0,9 % NaCl, рН 7,2 – 7,3) путем центрифугирования (300 – 500 g). На указанном буфере готовится взвесь эритроцитов концентрацией 100 млн кл/мл. Вносят равные объемы (0,5 мл) взвесей эритроцитов и бактерий. Смесь инкубируют при + 37 С в течение 30 мин на шуттель-аппарате. Затем на тщательно обезжиренном стекле готовятся мазки, они фиксируются смесью Никифорова, затем подсушиваются при комнатной температуре и окрашиваются синькой Мансона. Учитываются показатели адгезии:
– средний показатель адгезии (СПА) – среднее количество бактерий, прикрепившихся к одному эритроциту, при подсчете не менее 25 эритроцитов в поле зрения;
– коэффициент участия эритроцитов (КУЭ) – % эритроцитов, имеющих на своей поверхности адгезированные микроорганизмы;
– индекс адгезивности микроорганизмов (ИАМ) – среднее количество микробных клеток на одном участвующем в адгезивном процессе эритроците.
Неадгезивными считаются микроорганизмы с ИАМ 1,75,
низкоадгезивными с ИАМ = 1,76 – 2,50; среднеадгезивными с ИАМ = 2,51 – 3,99 и высокоадгезивными с ИАМ 4,0 бак/эр.
Спектр действия плазмокоагулазы неоднороден, в работе выработка этого энзима рассматривается как фактор защиты микроорганизмов, обеспечивающий образование вокруг микробной клетки дополнительной фибриновой оболочки. Для ее оценки используется цитратная кроличья плазма, предварительно разведенная 1:5 в стерильном изотоническом растворе NaCl. Петлю суточной агаровой культуры суспендируют в 0,5 мл разведенной цитратной кроличьей плазме. Пробирки инкубируют в термостате при + 37 С. Учет результатов проводится через 1, 2, 4 и 18 ч. Появление на дне пробирки хлопьев и студнеобразного сгустка свидетельствует о наличии у исследуемого штамма плазмокоагулазы.
Щелочная фосфатаза – фермент, относящийся к классу гидролаз, катализирует реакцию расщепления сложноэфирных связей в моноэфирах фосфорной кислоты с образованием свободного ортофосфата. Данный энзим играет важную роль в клеточном метаболизме, участвуя в обмене углеводов, нуклеотидов и фосфолипидов. По литературным данным, этот фермент обеспечивает повышенную стабильность микробной клетки к разным критическим факторам внешней среды [185]. Для постановки теста на щелочную фосфатазу используется набор реактивов с фенолфталеин–фосфатом натрия НИЦФ (СПб). На питательной среде, содержащей фенолфталеин фосфат натрия, делается точечный посев 10 – 15 культур. После инкубации в термостате при + 37 С в течение 24 ч, на выросшие колонии пипеткой наносится 1 – 2 капли 10,0 %-ного раствора аммиака. Через 10 – 15 мин учитывается цвет колоний: при положительной реакции под действием аммиака колонии окрашиваются в розовый цвет, при отсутствии фосфатазы колонии не изменяются. Отмечается интенсивность окрашивания колоний: выраженное, умеренное, слабое.
Фибринолизин – экзофермент, который активирует плазминоген, что приводит к появлению плазмина и растворению фибриновых волокон. Он способствует распространению микроорганизмов в тканях организма человека. Реакция на фибринолитическую активность оценивается с помощью кроличьей плазмы. Если в пробах, где образовался сгусток, отмечается вновь его растворение, то это говорит о наличии у микроорганизмов фибринолитической активности, если сгусток сохраняется – о ее отсутствии, учет результатов проводится ежечасно. Окончательный результат выдается на 2 сутки.
Лецитин – фосфатид, содержащийся в каждой клетке эукариотов в виде фосфолипидного слоя клеточных мембран и отдельных структурных образований в составе митохондрий. Отдельные виды патогенных и условно патогенных микроорганизмов способны вырабатывать фермент– лецитовителазу, катализирующий расщепление сложноэфирных связей в фосфолипидах. Микроорганизмы, продуцирующие этот фермент, способны повреждать клетки и длительно персистировать в организме человека. Определение лецитовителазной активности проводится на яичной среде, состав среды (мл): мясо-пептонныйагар 1000, желточная взвесь 200: желток куриного яйца, разведенный в 200 мл физ. раствора. Посев производится «бляшками», инкубация осуществляется при + 37 С, в течение 24 ч. В положительном случае вокруг «бляшек» образуется зона просветления. При учете результатов оценивается диаметр зоны просветления (мм) [19; 163].
Гемолизины – внеклеточно секретируемые белковые токсины с мембраноповреждающей способностью. Микроорганизмы, синтезирующие эти токсины, обладают гемолитической активностью, в результате чего происходит лизис эритроцитов с последующим освобождением гемоглобина. Для реализации и усиления патогенных свойств многие микроорганизмы нуждаются в определенном количестве железа, которое они должны утилизировать в организме хозяина при развитии инфекционного процесса. В гемоглобине концентрация железа составляет 0,335 %. Сорбируя из среды железо, бактерии приобретают способность лучше противостоять неблагоприятным факторам, а также получают преимущества в конкурентной борьбе [165]. Определение гемолитической активности проводится на кровяном агаре, состав среды (мл): мясо-пептонныйагар 1000, эритроциты барана 50. Посев проводится «бляшками». Результаты учитываются через 24 ч инкубации в термостате при + 37 С, в условиях эксикатора: – частичный гемолиз, – полныйгемолиз, – визуально не обнаруживаемый гемолиз.
Изучение влияния антипротозойных препаратов на изменчивость морфотипа T. vaginalis
Оценить адаптационные возможности культуры возбудителя в присутствии антимикробных препаратов можно на основе рассчитанной константы скорости ее гибели для каждого анализируемого варианта. Установлено, что величина определяемого показателя не только отличается от контрольного уровня, но также имеет разные значения в опытных вариантах. Так, если константа скорости гибели паразита под влиянием макмирора при CL25 превышает аналогичный показатель в контроле в 5,1 раза, то в пробе с метронидазолом эта разница составляет 2,7 раза. В тоже время константа гибели простейших в опытных вариантах при CL50 отличается от контроля в 2,1 раза. Однако при действии макмирора этот показатель возрастает, а под влиянием метронидазола, наоборот, снижается. Это указывает на то, что используемые лекарственные препараты по-разному влияют на процесс гибели T. vaginalis. Поскольку константа скорости отмирания в опыте с макмирором выше контрольного значения, это свидетельствует о том, что лечебная доза препарата полностью инактивирует культуру возбудителя трихомонадной инфекции. В отличие от него, присутствие метронидазола в питательной среде создает условия для отмирания культуры T. vaginalis только в течение первых 27 ч, а в дальнейшем возбудитель успевает адаптироваться и становится способным к росту и развитию в малоблагоприятных условиях. Отличительной особенностью стадии отмирания культуры в сравниваемых образцах является гетерогенность возбудителя трихомонадной инфекции. Вариабельность морфотипа в стадию отмирания выражена как в контроле, так и в опытных вариантах и, прежде всего, затрагивает форму их клетки. Выявлено, что 33,3 – 42,0 % особей возбудителя типичного морфотипа теряют исходную грушевидную форму. Однако образующиеся разновидности морфологических форм в контроле и опытных вариантах значительно отличаются (рис. 36). Так, если в контроле на фоне типичных трихомонад
Изменение формы T. vaginalis в фазу отмирания в контроле и под влиянием антипротозойных препаратов можно обнаружить только особей с амебоидной формой, то в опытных вариантах такие клетки вовсе не регистрируются (2 = 8,4, р = 0,004). Под действием антимикробных препаратов в структуре популяции появляются трихомонады округлой и овальной форм, но частота их обнаружения разная. При этом под влиянием метронидазола в 3,5 раза чаще встречаются простейшие с округлой формой (2 = 3,5, р = 0,060), тогда как в опыте с макмирором в 3,9 раза чаще диагностируются простейшие с овальным фенотипом (2 = 4,3, р = 0,038). % 100 На рис. 37 представлены данные, характеризующие изменение двигательной активности T. vaginalis в контроле и под влиянием лекарственных препаратов. Установлено, что во всех образцах эта изменчивость носит однотипный характер и ведет к обездвиживанию простейших (2 = 21,4 – 42,0, р 0,001). Вместе с тем, сравнивая вариабельность подвижности трихомонад в контроле и опытных вариантах, следует отметить, что все изоляты типичной T. vaginalis в присутствии макмирора или метронидазола полностью лишаются движения, в то время как в контроле в популяции возбудителя наблюдается ярко выраженный гетероморфизм. При этом наряду с обездвиженными клетками встречаются простейшие с маятникообразным типом движения. Небольшое число особей сохраняют волнообразную подвижность.
Под влиянием антипротозойных препаратов в популяции типичной T. vaginalis наблюдается выраженный кариолизис (рис. 38). Установлено, что 71,4 % трихомонад в опытных вариантах в стадию отмирания имеют безъядерную форму клетки (р 0,001 – 0,005). Такие формы простейших обнаруживаются и в контроле, что связано с естественным процессом старения культуры. Однако частота их встречаемости в контроле в 1,5 – 1,6 раза ниже
Изменение ядерного аппарата T. vaginalis в фазу отмирания в контроле и под влиянием антипротозойных препаратов чем в опыте (2 = 3,6, р = 0,056). Из вышеизложенного следует, что лекарственные препараты, используемые для инактивации T. vaginalis, по-разному влияют на нее. Так, если макмирор проявляет только микробоцидный эффект, то метронидазол наряду с микробоцидным эффектом дополнительно оказывает микробостатическое действие. Вследствие этого у культуры возбудителя замедляется метаболическая активность, но трихомонады при этом длительное время остаются жизнеспособными. В отличие от него, макмирор полностью инактивирует активность возбудителя типичного морфотипа, повышая скорость отмирания культуры в 3,8 раза по сравнению с ее естественной гибелью в контроле. Этот факт также подтверждают данные, полученные в ходе изучения изменчивости морфотипа возбудителя трихомонадной инфекции в ответ на внешние раздражители. Так, лидирующей формой паразита в исследованиях с метронидазолом обнаружена округлая – более адаптированная к неблагоприятным условиям форма жизни трихомонад, в то время как с макмирором повышается концентрация овальных клеток, которые рассматриваются как неактивная форма простейших.
Выполненные экспериментальные исследования представляют научно-практический интерес, поскольку имеют непосредственное отношение к определению механизмов адаптации T. vaginalis в организме человека, которые до сих пор носят дискуссионный характер. Решение данного вопроса связано с определением изменчивости морфотипа в процессе развития культуры возбудителя трихомонадной инфекции. Моделью, отражающей развитие трихомонад в условиях in vivo, является периодическая культура, поскольку в любой фазе роста она находится в состоянии перестройки процессов метаболизма и зависит от внешних факторов. Результаты исследований по изучению изменчивости морфотипа простейших под действием антипротозойных препаратов указывают на то, что наличие гетероморфов в структуре вида T. vaginalis является результатом ее адаптации к внешним воздействиям. Это определяет необходимость глубоких изменений в стратегии борьбы с возбудителем трихомонадной инфекции.
Кроме того, опираясь на полученные результаты исследований, можно говорить и о том, что широкое бесконтрольное применение антипротозойных препаратов среди населения области оставляет крайне негативные последствия. Это обусловлено тем, что выбор адекватного химиопрепарата сегодня представляет собой сложную лечебную задачу, поскольку инициальная терапия больных с урогенитальным трихомониазом носит эмпирический характер. Появление на отечественном фармакологическом рынке большого количества новых мощных антимикробных препаратов приводит к их назначению и применению у данных пациентов без должного показания. В связи с этим важным профилактическим компонентом в предупреждении развития резистентности у возбудителя трихомонадной инфекции является рациональная антимикробная терапия, основанная на строгой ориентации в выборе лечебного препарата, опираясь на микробиологические исследования. На пути совершенствования микробиологической диагностики урогенитального трихомониаза должна лежать клональная концепция структуры микробной популяции. Это позволит не только выявлять возбудителя трихомонадной инфекции как такового, но определять его морфотип и чувствительность к антипротозойным препаратам, что создаст основу для адекватного лечения пациентов с урогенитальным трихомониазом.
Сравнительная характеристика микробиоценоза урогенитального тракта здоровых и больных трихомониазом мужчин
Следует отметить, что сок простаты больных с трихомонадной инфекцией является благоприятной питательной средой для микроорганизмов рода Escherichia. Обсемененность материала этими грамнегативными палочковидными бактериями составляет 5,4 lg КОЕ/мл, что существенно выше их содержания в эякуляте и в соскобе из уретры (р = 0,008). Кроме них в клиническом материале больных мужчин регистрируются и другие палочковидные бактерии, среди них представители рода Proteus. Они выделяются из соскоба уретры и сока простаты в почти одинаковой концентрации, а из эякулята реже. Представители рода Klebsiella чаще обнаруживаются в эякуляте, незначительно реже в соскобе слизистой оболочки и секрете простаты. Представители рода Enterobacter, а также грамположительные бактерии Lactobacillus spp. и Corynebacteria spp. встречаются не во всех исследуемых образцах обследуемых пациентов. Их lg КОЕ/мл статистически не различается. Неферментирующие грамотрицательные палочки рода Pseudomonas обнаруживаются у больных мужчин исключительно в секрете простаты. Их КОЕ составляет 0,2 lg КОЕ/мл.
Эукариотические грибы рода Candida у больных в значительной концентрации диагностируются в соскобе из уретры и в эякуляте, в меньшем количестве они выделяются из секрета простаты (р = 0,014).
Особое значение при характеристике патогенетической опасности факультативно-патогенной микрофлоры на фоне хронической трихомонадной инфекции имеют факторы персистенции. Из них большую роль играют адгезивные свойства микроорганизмов, представленные в табл. 43 и являющиеся пусковым механизмом любого инфекционного процесса. Обращает на себя внимание тот факт, что 94,2 ± 1,3 % выделенных микроорганизмов обладают способностью прикрепляться к чувствительным клеткам человека (2 = 512,8, р 0,001). При этом основная часть изолятов проявляет умеренно- и высокоадгезивные свойства (p 0,001). Частота встречаемости низко- и неадгезивных культур в структуре микробиоценоза больных с трихомониазом существенно меньше и составляет 11,9 ± 1,8 % и 5,8 ± 1,3 % соответственно (p 0,001 – 0,006). Индекс адгезивности микроорганизмов, выделенных у
Из инвазивных факторов болезнетворности у культур, выделенных из микробиоценоза больных мужчин, особое значение имеют ферменты, к числу которых относятся фибринолизин и лецитовителаза. При этом показатель соотношения микроорганизмов, обладающих фибринолитической активностью (64,0 ± 3,2 %) и не секретирующих его, в опытном варианте составляет 2:1 (ТМФ: р 0,001). Время появления этого признака у исследуемых культур в среднем составляет 2,7 ± 2,6 ч.
Лецитовителазу продуцирует 65,2 ± 2,6 % изолятов, выделенных из микробиоценоза мужчин с трихомонадной инфекцией (2 = 60,9, р 0,001). По степени выраженности признака, представленной в табл. 44, наиболее часто регистрируются изоляты с выраженной активностью, в 1,5 раза реже среди них отмечается умеренная активность. Культуры со слабо проявляющейся лецитовителазой составляют 6,7 ± 1,4 %.
Микрофлора, изолированная из урогенитального тракта больных мужчин, характеризуется наличием факторов агрессии – мембранотоксинов. Гемолизины определяются у 80,2 ± 2,2 % (2 = 239,1, р 0,001) микроорганизмов из разных таксонов (табл. 45). Каждая вторая из них продуцирует -гемолизины (р 0,001), в 1,8 раза реже встречается -гемолиз.
В ходе исследования ДНКазной активности собственной микрофлоры у обследуемых пациентов установлено, что деполимеризацию клеточной ДНК вызывает 91,8 ± 1,5 % изолятов (2 = 457,8, р 0,001). Степень выраженности этого признака показана в табл. 46. Как видно, в урогенитальном тракте мужчин с трихомониазом превалируют микроорганизмы с умеренным проявлением признака (р 0,001). В 2,0 раза реже встречаются особи, продуцирующие ДНКазу выраженной активности. Малочисленной оказывается группа культур, проявляющая слабую ферментативную активность – 10,1 ± 1,7 % (р 0,001).
Протеолитической активностью обладает 96,3 ± 1,0 % изолятов, выделенных от больных мужчин (2 = 563,5, р 0,001). Характеристика способности микроорганизмов расщеплять белки представлена в табл. 47. Как видно, значительно чаще микроорганизмы вызывают кислую коагуляцию молока и образование казеинового творога с газом (38,4 ± 2,7 %), в 1,3 раза реже встречается пептонизация белковых продуктов, в 4,4 раза реже их щелочная коагуляция. Крайне редко реакция протекает слабовыраженно и сопровождается образованием аминов и секрецией молочной кислоты (1,5 ± 0,7 % и 0,3 ± 0,3 %).