Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Существование крупных природных ігов чумы на территории ряда государств (в том числе СНГ) сохраняет вероятность пространения одной из наиболее опасных инфекций. Во время вспышки чумы в дии (Kumar К. et al., 1997) и на Мадагаскаре (Chanteau S. et al., 1998) выделены {родные штаммы с множественной лекарственной устойчивостью (Galimand М. et 1997), установлена резистентность блох к инсектицидам (Chanteau S. et ah, 1998). ; это свидетельствует об ухудшении экологической обстановки и снижении целения типичных штаммов чумного микроба.
Паразитоценозы природных очагов чумы являются целостными системами, ранение и поддержание которых обеспечивается межвидовыми экологическими зями между их сочленами (Апарин Г.П, 1989, Perry R.D., 1997). И хотя входящие в тав этих биоценозов организмы в свою очередь - единые системы, все шоненты и функции которых взаимосвязаны, межвидовые взаимодействия и их :од, в первую очередь, определяются особенностями поверхностных структур ієльньіх клеток взаимодействующих организмов.
Поверхностные структуры бактерий в значительной степени определяют эаженность их вирулентных и иммуногенных свойств в связи с тем, что именно і определяют возможность и характер взаимодействия с макроорганизмом, спечивают развитие инфекционного или иммунного процессов, антигенную никрию. Роль отдельных клеточных структур определяет характер ответа анизма на микроорганизмы. В связи с этим в последние годы повысился интерес к чению поверхностных структур бактерий - капсул, пилей и фимбрий, юполисахаридов, а также мембранных белков и молекул с ярко выраженной циализированной функцией (ферментов, рецепторов, поринов и т.д.), в том числе іеделяющей иммунореактивность.
Сведения о механизмах реализации патогенности и иммуногенности фоорганизмов и, в первую очередь, факторах, определяющих способность іживаться в тканях организма хозяина, а также размножаться в них, лежат в основе работки эффективных средств профилактики и лечения инфекционных олеваний.
Штаммы, циркулирующие в природных очагах чумы, различаются по свои\ свойствам. Внутривидовое разнообразие штаммов чумного микроба, выделенных і разных природных очагах, проявляется в отличиях по степени вирулентности дл) различных видов диких и лабораторных животных (Апарин Г.П., Голубинский Е.П. 1989, Кокушкин A.M., 1995, Perry, 1997), плазмидному составу (Балахонов СВ. 1989 Балахонов СВ. и др., 1991; Филиппов А.А. и др.,1992; Filippov А.А. et al, 1990) питательным потребностям и ферментативной активности (Апарин Г.П., 1989, Perrj R.D., 1997).
Вопрос о роли в эпизоотологии и эпидемиологии чумы "атипичных" штаммов отличающихся по ряду признаков от характерного для данного очага вариантг возбудителя чумы, до настоящего времени остается открытым (Кондрашкина, К.И 1971, Степанов В.М., 1981, Топорков В.П., 1987, 1999).
Атипичные штаммы по капсульному антигену рассматриваются как Fra* и Fra" В то же время, направленный мутагенез структурного гена cafl оперона fra приводит к образованию "бесфракционных" вариантов Y.pestis, сохраняющих вирулентность для лабораторных животных на уровне исходных штаммов (Drozdov I.G. et al, 1995, Friedlander А.М. etal, 1995).
Более того, Fra" штаммы периодически выделяются от больных животных и людей (Кудинова Т.П., 1968, Топорков В.П. и др., 1987, Burrows T.W., 1963). Былс показано, что нарушение структуры гена caflМfra-опероиа приводит к образовании вариантов Y.pestis с серологически "атипичными" капсулами (Анисимов А.П.. Захарова Н.М., 1992).
Изучению капсульного антигена посвящено большое число исследований. Капсула Y.pestis признана одним из "классических" факторов патогенности и основным иммуногеном, чумного микроба (Вейнблат В.И.,1974; Вейнблат В.И. и др., 1980, 1983, Домарадский И.В., 1993, 1998; Жуков-Вережников Н.Н., 1940; Perry R.D., 1997).
FI является главным иммуногеном, на котором основаны все иммуно-серологические методы диагностки и вакцины, используемые для создания противочумного иммунитета. Иммунодиагностика чумы построена на выявлении капсульного антигена FI или антител к нему. Кроме того, он является основным
сомпонентом большинства коммерческих и экспериментальных чумных препаратов Наумов А.В. и др., 1992, Perry R.D., 1997).
Иммуно-серологическая диагностка чумы, в том числе и эпизоотологическое (бследования осуществляются иммуно-биологическими препаратами на основе FI гумного микроба. Поэтому изучение штаммов с "атипичными" капсулами іредставляет интерес с точки зрения рассмотрения специализированных механизмов г систем, обеспечивающих существование чумного микроба на отдельных этапах его кизненного цикла при различных путях передачи возбудителя, и возможности лецифической защиты макроорганизма от заражения такими штаммами.
До настоящего времени не проводились широкие исследования штаммов [умного микроба с "атипичной" капсулой методами световой, флюоресцентной и, собенно, иммунноэлектронной микроскопии. Поэтому изучение таких штаммов и юобенно определение эффективности их выявления с помощью различных методов абораторной диагностики являются важными и актуальными.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ- изучить функциональную и диагностическую начимость капсулы штаммов Y. pestis с фенотипами Fra* и Fra'.
-
Изучить поверхностную структуру природных и экспериментальных ггаммов с нарушенным синтезом капсульного антигена и капсулообразования с омощью иммунологических и иммунохимических методов, различных вариантов [икроскопии и охарактеризовать основной компонент "атипичной" капсулы.
-
Найти возможности методических подходов идентификации штаммов '. pestis с Fra* и Fra', невыявляемые коммерческими диагностическими препаратами, снованными на антигене FI.
-
Установить значение различных продуктов гена fra-оперока Y. pestis на рансмиссивный и алиментарный пути передачи чумы.
-
На модели иммунизированных и интактных лабораторных животных пределить роль штаммов Y. pestis с фенотипом Fra* в развитии экспериментальной умы.
5. Изучить эффективность выявления штаммов возбудителя чумы с
ггипичной" капсулой методом полимеразной цепной реакции
Получены новые данные о морфологии, функциональной и диагностической значимости капсулы Fra* и Fra" штаммов возбудителя чумы. Впервые с помощью комплекса .иммунологических и иммунохимических методов, световой, флюоресцентной и иммуноэлектронной микроскопии получены доказательства образования капсулы, сформированной из компонентов, отличных от капсульного антигена FI.
С помощью сканирующего оптического микроскопа ближнего поля получены новые данные о поверхностной структуре штаммов Y. pestis, с фенотипом Fra+, Fra* и Fra" на ультраструктурном уровне.
Предложены методические приемы по идентификации штаммов Y. pestis с "атипичными" капсулами. На основании результатов наших исследований с помощью световой микроскопии с окраской по Гинсу-Бурри, флюоресцентной и иммуноэлектронной микроскопии, методов электрофореза и иммуноблоттинга секретируемых белков из штаммов, выращенных при различных значениях рН, дополнены паспортные данные 31 штамма Y. pestis характеристиками капсулы.
Впервые показана способность штаммов Y. pestis с фенотипами Fra*Tox+ и FraTox+, отличающихся по экспрессии генов ,/га-оперона, вызывать с низкой частотой, по сравнению с типичными штаммами, формирование блоков преджелудка у блох Xenopsylla cheopis Roths, и Nosopsyllus lacviceps Wagn., обеспечивать трансмиссивный путь передачи чумы белым мышам.
На модели белых мышей показано, что штаммы, содержащие "атипичные" капсулы, преодолевают иммунитет, индуцированный вакцинным штаммом Y. pestis EV НИИЭГ. Впервые установлено, что у переболевших чумой морских свинок, вызванной штаммом с "атипичной" капсулой, патоморфологические изменения внутренних органов принципиально не отличались от таковых у животных, погибших в результате их заражения типичным природным штаммом Y. pestis.
Проведена детекция штаммов Y. pestis с фенотипами Fra* и Fra" с помощью ПЦР-анализа с праймерами, комплементарными нуклеотидной последовательности генов cafl и pla.
По результатам работы составлены "Методические рекомендации по идентификации штаммов Yersinia pestis с атипичными капсулами", которые одобрены Ученым Советом Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб" (протокол №11 от 28.12.2000 г.) и утверждены директором РосНИПЧИ "Микроб".
Материалы диссертации используются при чтении лекций на курсах первичной специализации и повышения квалификации врачей по особо опасным инфекциям при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб".