Введение к работе
Актуальность проблеми
Всестороннее исследование холерных вибрионов 0-139 серовара имеет особое значение в связи с эпидемической опасностью, которую они представляют. До недавнего времени считали, что только вибрионы 01 группы способны вызывать эпидемии холеры, тогда как штаммы, не агглютинирующиеся 01-холерной диагностической сывороткой, могут быть причиной лишь спорадических гастроэнтеритов, раневой инфекции, септицемии (Safrin S.J. et al. 1987).
Однако, в ноябре 1992 года на юге Индии (Мадрас) была заре-гестрирована вспышка тяжелого диаррейного заболевания, клинически сходного с холерой, которая достаточно быстро распространилась на ряд других районов этой страны (Калькутта, Мадурай, Веллоре), а также,Бангладеш и Таиланд (Albert M.J. et al. 1993, Swerdiow P. L. , Ries A. 1993).В одной только Калькутте было выявлено более 15 тысяч случаев заболевания, из которых 230 привели к смерти больных (Sarkar В. L. et al. 1993). К середине января 1993 года вспышка на юге Бангладеш охватила около 10 тысяч человек, среди них было за-регестрировано 500 летальных исходов (Albert М. J. 1993). В феврале 1993 года был зафиксирован заЕоз этой инфекции из Индии в США (Altman L. К. 1993), а в мае того же года - в Россию (Ломов Ю. М. с соавт. 1995). За период 1993-1994 годов о местных случаях данного заболевания сообщили органы здравоохранения Пакистана, Китая, Малайзии, Непала; о завозных - Германия, США, Эстония, Киргизия.
Причиной этих вспышек явился токсигенный, ранее не идентифицированный серовар V. cholerae 0-139 (Bengal). Данный возбудитель не агглютинировался как моно- и поликлональными холерными сыворотками 01, так и не одной из 137 ранее описанных сывороток не 01 (Yohnson Y. А. 1994).
Первые предварительные исследования показали, что вибрионы нового серовара содержат гены вирулентности 01 серогруппы, обычно не обнаруживаемые у штаммов не 01 серогрупп, в том числе - ген холерного токсина (Calia К. Е. et al. 1994).
Несмотря на ряд опубликованных в 1993-1996 годах работ,преимущественно зарубежных авторов, посвященных проблемам изучения энтеротоксина V. cholerae 0-139 (Albert М. J. 1993, Islam MS. 1993, Waldor M. K. , Mekalanos J. J. 1994 и др.), в литературе не отражены вопросы об условиях и факторах, влияющих на токсинопродукцию холерных вибрионов 0-139 серовара in vitro, о токсинопродуцирующей
активности штаммов V. cholerae 0-139, выделенных из различных источников, о существовании среди них гиперпродуцентов энтеротокси-на,о разработке технологии получения препаратов холерогена нового серовара и их очистки. Нет сравнительной характеристики удельной активности токсинов 0-139 и 01 серогрупп при тестировании на биологических и цитологических моделях. Наконец, отсутствие эффективной антитоксической сыворотки затрудняет постановку любых иммунологических тестов по индикации и количественной оценке знте-ротоксина V. cholerae 0-139, а также выявление его иммунологического родства с токсинами вибрионов 01 серогруппы. Необходимостью досконального изучения указанных проблем и обусловлена актуальность данной диссертационной работы.
Цель работы.
Исследование продукции, факторов, влияющих на нее, биологических и иммунологических свойств энтеротоксина холерных вибрионов 0-139 серовара.
Задачи исследования.
-
Изучить гоксинопродущрующую активность in vitro штампов V. cholerae 0-139 различного происхождения и выявить среди них потенциальные гиперпродуценты холерного токсина.
-
Изучить влияние серии пассажей через кишечник кроликов-сосунков на токсинопродукцию штаммов холерных вибрионов 0-139 серовара in vitro.
-
Исследовать влияние различных условий культивирования на токсинопродукцию штаммов V. cholerae 0-139 in vitro .
-
Сравнить токсинопродукцию Гем+ и Гем- субкультур штаммов V. cholerae 0-139 .
-
Получить препараты неочищенного и очищенного токсина V. cholerae 0-139 и исследовать их биологические свойства и удельную активность на моделях лабораторных животных и в культуре клеток в сравнении с токсинами классического и эльтор вибрионов.
-
Получить сыворотку к токсину нового серовара "Bengal", исследовать ее активность.
-
Установить, имеет ли место иммунологическое родство между токсинами холерных вибрионов 0-139-ой и 01-ой серогрупп.
Научная новизна.
-
Впервые проведено исследование токсинопродуцирутощей активности in vitro штаммов нового эпидемически значимого серовара V. cholerae 0-139, имеющих различные источники и места выделения.
-
Найдены потенциальные гиперпродуценты холерного токсина среди штаммов V. cholerae 0-139.
-
Установлено положительное влияние серии пассажей через кишечник кроликов-сосунков на токсинопродукцию ряда штаммов V. cholerae 0-139 in vitro.
-
Подобрана оптимальная питательная среда, добавки к ней, температурный режим и уровень аэрации, способствующие повышению продукции холерного токсина вибрионами 0-139 серовара.
-
Показано, что отрицательные по гемолитической активности субкультуры штаммов V. cholerae 0-139, полученные на агаре Мартена рН 7,6 с 2% эритроцитов барана, обладают более высокой токси-нопродукцией in vitro, чем гемолизположительные.
-
Впервые получены препараты очищенного и неочищенного знтеротоксина V. cholerae 0-139.
-
Установлена термолабильность знтеротоксина вибрионов серовара "Bengal".
-
Установлено, что энтеротоксин V. cholerae 0-139 серовара идентичен по биологическому действию токсинам классического и зль-тор вибрионов, однако обладает более высокой удельной активностью во всех общепринятых тестах.
-
Впервые метод сорбционной хроматографии с галактозой, ранее применявшийся, преимущественно, для получения очищенного термолабильного токсина Е. col і, был успешно использован с целью очистки холерного токсина как 0-139-ой, так и 01-ой серогрупп.
-
Получены антисыворотки к очищенному и неочищенному токсинам V. cholerae 0-139, обладающие высокой гомо- и гетерологичной токсиннейтрализуюшей активностью.
10) Установлено, что токсины холерных вибрионов 0-139 и 01 серо
групп иммунологически идентичны.
Практическая значимость.
-
В качестве потенциальных токсинопродуцентов предложены 2 штамма холерных вибрионов 0-139 серовара - Р16065 и М045.
-
Обоснован и предложен метод селекции отрицательных по гемоли-
- б -
тической активности субкультур штаммов V.cholerae 0-139 для поиска гиперпродуценгов энтеротоксина.
-
Рекомендовано осуществлять серию последовательных пассажей штаммов V. cholerae 0-139 через кишечник кроликов-сосунков с целью предварительной подготовки культур к получению из них препаратов холерогена.
-
В качестве среды культивирования холерных вибрионов 0-139 серовара для получения из них энтеротоксина рекомендована среда AKI.
-
Разработаны предложения по оптимизации температурного режима, уровня аэрации, использованию возможных добавок к питательным средам для повышения токсинопродукции штаммов V. cholerae 0-139.
-
Разработана методика получения препаратов токсина-сырца из штаммов V. cholerae 0-139.
?) Показана эффективность метода сорбционной хроматографии с использованием D-галакгозы в качестве агента, связывающего молекулы токсина, для очистки препаратов холерогена как 0-139-ой, так и 01-ой серогрупп.
8) Получена эффективная антисыворотка к очищенному токсину V. cholerae 0-139, обладающая высокой нейтрализующей активностью в отношении препаратов холерогена как 0-139-ой, так и 01-ой серогрупп и, при этом, не содержащая антител к соматическому О-антигену, что исключает неспецифические взаимодействия при постановке серологических реакций.
Положения, выносимые на защиту.
-
Штаммы нового эпидемически значимого серовара V. cholerae 0-139 обладают способностью продуцировать термолабильный энтероток-син, идентичный по биологическому действию токсинам холерных вибрионов 01-ой серогруппы, но превосходящий их по удельной активности.
-
Токсины холерных вибрионов 0-139 и 01 сероЕаров иммунологический идентичны.
-
Использование для культивирования штаммов холерных вибрионов 0-139 серовара среды AKI, бульона Мартена рН 7,6 с предварительно добавленным к нему антибиотиком линкомицином в дозе 1 мг/мл, а также, серия последовательных пассажей через кишечник
кроликов-сосунков способствуют повышению токсинопродукции этих штаммов in vitro.
-
Гем- субкультуры штаммов V. cholerae 0-139, полученные на агаре Мартена рН 7,6 с 2% эритроцитов барана, обладают более высокой токсинопродуцирущей активностью, чем Гем-f- варианты.
-
Сыворотка, полученная к токсину V. cholerae 0-139, характеризуется высокой нейтрализующей активностью в отношении гомологичного и гетерологичных препаратов холерогена, и, следовательно, может быть использована для изучения токсинов как 0-139-ой, так и 01-ой серогрупп холерных вибрионов.
Апробация работы.
Основное содержание диссертации отражено в 4 опубликованных работах.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на научных конференциях Ростовского-на-Дону государственного научно-исследовательского противочумного института, а также на конкурсе молодых ученых РЛЧИ (1995).
Структура диссертации.
Монография изложена на 171 странице, состоит иа введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, содержит 14 таблиц и 15 рисунков. Библиография представлена 102 отечественными и 137 зарубежными источниками.