Введение к работе
Актуальность, Метанокисляющие бактерии в течение последних 20-30 лет являются предметом изучения широкого круга исследователей в СССР и за рубежом. Это объясняется их биотехнологичес-ким потенциалом, а также рядом теоретических проблем их биологии; облигатной зависимостью от метана как источника углерода и энергии, подавлением роста экзогенными органическими веществами, которые являются нормальными метаболитами клетки, способностью расти на смеси неростовых субстратов, широкой субстратной специфичностью ключевых ферментов окисления метана и т.д. В последние годы установлена большая роль метанокислящих бактерий в круговороте углерода биосферы, поскольку значительная часть органического вещества, синтезируемого фототрефными организмами, разлагается в анаэробных аконитах с образованием метана. Поэтому метанокисляющие бактерии, наряду с автотрофами, замыкают цикл превращений углерода биосферы.
Метанокисляющие бактерии привлекают внимание также в связи с возможность» ях применения для синтеза белка, экзополиса-харидов и биологически активных веществ из метана природного газа, использования их клеток в качестве каталитических систем для окисления целого ряда сложных органических соединений в химической промышленности.
Использование в прикладных целях любого микроорганизма тем эффективнее, чем глубже мы знаем его биологию, пути метаболизма и их регуляцию. За последние 10-15 лет в изучении конструктивно го метаболизма метанокисляющих бактерий достигнуты существенные успехи. В то же время процессы окисления интермедиатов окисления метана, а также механизмы генерации энергии, реализуемые
отде>іЙ^:ной
ЦРНТРА/ЫЙЙ
К. А;Т
Ин*№
НАУЧНАЯ 6И6ЛИОТВ4А Моск. сальскехо». акідмм*
-г -
этими микроорганизмами, наследованы недостаточно полно*
Цель и задачи исследования» Целы» настоящей работы было выяснение локализации процессов окисления метана, метанола н формальдегида относительно ЩЛ метанокисляшщих бактерий Но. themmphilue и изучение механизмов генерации внерпга, сопряженных с окислением восстановленных Cj-СОЄДИНЄНИЙ. В задачу исследований входило;
щучить механизмы генерации электрохимического градиента протонов, сопряженные с процессами окисления метанола к формальдегида;
изучить механизм поглощения клетками метана и интерме-диатов его окисления;
выяснить роль "WQ и ЦЦГ в окисления Метанола и формальдегида;
Список сокращение.
АР - альдегндредуктаза; ОПР - оксипируватредуктаэа; ЧДГ -метанолдегидрогенаэа; МОК - метанолоксидаэный комплекс; ШО -метанмоноокснгеназа; ФДГ - формц&тдегидрогеназа; *дДГ - фориаль-дегиддегидрогенаэа; AT - активный транспорт; ТО - терминальная оксидаза.
ФА - фориамид; Ф< - фенаэкнметосульфат; ТИ'*' -тетрафенкл-фосфонии; СССР - карбоюмцианвд-м-хлорфеюипдфазон; FCCP -кар-боннлцианид-П'Трифторметоксифеннлгмдраэон.
КС - клеточная стенка; №( - наружная Мембрана; ЦПМ - цито-плазматичесхал мембрана.
_ з-
Научная новизна. Впервые показано» что метанокисляицие бактерии поглощают метан к формальдегид путем энергозависимого транспорта.
Установлено» что окисление экзогенного метанола в клетках этих бактерий катализируют два фермента - ОД) и ЦЦГ, при этом ЦЦГ локализована в периплазме. Этот фермент не катализирует в клетке окисление формальдегида при росте на метане, как считалось ранее, однако участвует в детоксикации высоких концентраций этого соединения. Установлено также, что окисление одного моля формальдегида в клетках Uc.themophilus сопровождается восстановлением двух молей НАД*.
В клетках lie. thaxmophilue обнаружен неизвестный ранее для метанокисляищих бактерий фермент - альдегидредуктаза, исследованы условия, в которых происходит экспрессия активности этого фермента. Показано, что клетки, обладающие активностью АР, способны генерировать протондвижущув силу на ЦГЫ за счет окисления НАДН без участия НАДН-дегидрогеназы и протонных насосов.
Практическая ценность. Наличие энергоэависимого транспорта метана к формальдегида в клетки метанокисляшщих бактерий следует учитывать при построении моделей круговорота метана в биосфере, в экологических исследованиях, в расчетах эффективности процессов биосинтеза на метане, в дальнейшем изучении регуляции окисления метана. Полученные закономерности окисления метанола и формальдегида являются основой для разработки способа синтеза формальдегида.
Установленная нами чувствительность к осмотическому шоку реакции монооксигенирования метана и активного транспорта формальдегида в клетки может быть причиной нестабильности процесса
- 4 -получения белка на природном газе, так как при крупномасштабной культивировании метанокисляющих бактерии в ферментер регулярно подается большой объем концентрированного раствора питательных солей. Вследствие этого, некоторая часть клеток продуцента периодически подвергается осмотическому шоку.
Апробация работы.'Датериалы диссертационной работы доложены на конференциях Молодых ученых Института микробиологии и вирусологии АН УССР (Киев,1986,1987,1988,Канев,1986),17-й научной конференции молодых ученых, #ПГ Ц986),19-й конференции молодых ученых ИЕМ (Пущино,і9В8),6-м международном симпозиуме "Аікроб-ный рост на Cj-соединениях* (&РГ,Геттинген,1989),7-м съезде Украинского микробиологического общества (Черноваы,1969>.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано б работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит иэ введения, списка сокращений, одной главы обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы {209 источников). Работа изложена на 46$ страницах Машинописи, включая 26 рисунков и 7 таблиц.