Введение к работе
Актуальность темы. Выяснение молекулярных основ контактных взаимодей-гвий ассоциативных бактерий с растительными партнерами становится одним из ночевых моментов в решении комплекса проблем, связанных с использованием яв-гния ассоциативной азотфиксации для создания современных средств защиты и по-лшения производительности сельскохозяйственно значимых растений. Очевидно, го для изучения механизма, определяющего такие взаимодействия, большой интерес эедставляют данные о структуре и функциях компонентов клеточной поверхности астений и микроорганизмов.
Липополисахариды (ЛПС) грамотрицательных бактерий являются уникальным іассом биополимеров. Располагаясь на внешней поверхности наружной мембраны и эразуя комплексы с белками, ЛПС принимают непосредственное участие во взаимо-:йствии бактерий с окружающей средой. В целом ряде работ, посвященных изучено бобово-ризобиального симбиоза, было показано участие бактериальных ЛПС в ггановлении симбиотических отношений (Kato et al, 1979; Wolpert and Albersheim, )76). Активная роль ЛПС была установлена также и при фитопатогенезе - в экспе-шентах по ингибированию ЛПС процессов образования опухолей у двудольных істений, вызванных патогенными агробактериями (Whatley et al., 1976).
В отличие от ризобий и агробактерий, структура и биологические свойства ЛПС :социативных бактерий, в частности, азоспирилл в литературе отражены слабо. Сво->дноживущие грамотрицательные бактерии рода Azospirillum способны вступать в :социативные взаимоотношения с растениями, но не используют при этом ярко вы-іженньїх атрибутов симбиоза, присущих, например, ризобиям. Большое внимание к юспириллам, особенно заметное по публикациям в отечественной и зарубежной ггературе последних лет, связано с их потенциально высокой азотфиксирующей ггивностью, способностью продуцировать фитогормоны и иные физиологически ггивные вещества, частым обнаружением азоспирилл в ризосфере злаков в самых ізнообразньїх сельскохозяйственных регионах.
Трудности исследований взаимоотношений растений с представителями свобод-шивущей микрофлоры отчасти объясняются отсутствием признанного физиологи-:ского теста, характеризующего результаты взаимодействий таких микроорганизмов растениями. Установление ассоциативных взаимоотношений между партнерами в шном случае не приводит к образованию у растений каких-либо четко определяе-ых морфологических структур, подобных клубенькам, опухолям и пр. Таким обра-ш, при оценке участия ЛПС азоспирилл в их контактных взаимодействиях с расте-іями оказывается существенным выбор информативных физиолого-биохимических жтериев, характеризующих результаты этих взаимодействий.
При выборе метода изучения клеточной поверхности почвенных бактерий мы от-іем предпочтение иммунохимическому анализу, учитывая при этом два.обстоятель-ва. Во-первых, высокую селективность и чувствительность определения разнооб-изных органических соединений в реакциях типа антиген (Аг) + антитело (Ат). Во-орых, достаточную убедительность предположения о том, что антигенные компо-:нты клеточной поверхности исследуемых микроорганизмов могут оказаться доста-
точно активными также и при их взаимодействии с клетками растительных партии ров.
Целью данной работы было получение сведений об особенностях синтеза строения полисахаридной части ЛПС азоспирилл в связи с проблемой микробно диссоциации; анализ гетерогенности фракций бактериальных ЛПС и оценка их во: можного вклада в формирование внеклеточных структур азоспирилл - капсульног полисахарида (КПС) и экзополисахарида (ЭПС); оценка участия бактериальных ЛП( в контактных взаимодействиях азоспирилл с растениями. В соответствии с этим, данной работе были сформулированы следующие основные задачи:
-
Оценить изменения в структуре ЛПС типового штамма A.brasilense Sp7 при R-диссоциации.
-
Исследовать антигенный состав и особенности строения О-антигенной части ЛП< штамма A.brasilense Sp245 и оценить вклад отдельных фракций О-специфически полисахаридов в формирование КПС и ЭПС данных бактерий.
-
Исследовать роль ЛПС азоспирилл при бактериальной адгезии на корнях пшен* цы и в модельных растительных системах.
-
Оценить участие ЛПС азоспирилл в запуске ответных биохимических реакци инокулированных растений.
Научная новизна работы состоит в том, что в ней впервые для азоспирилл ус тановлен нетипичный случай R-S диссоциации для штамма A.brasilense Sp7, при кс торой не происходит качественных изменений в структуре полисахаридных звенье О-специфических полисахаридов (О-ПС), а изменяется лишь степень их антигенне сти. Для объяснения этого феномена предложена схема, иллюстрирующая перерас пределение вкладов двух основных О-антигенов, присущих как исходному бактері альному штамму, так и его S-варианту, в "архитектуру" клеточной поверхности в зг висимости от возраста культур.
Для штамма A.brasilense Sp245 впервые показано, что и капсула, и ЭПС этог штамма состоят из вещества, гомологичного одному из двух выявленных для него С ПС.
Установлено стимулирующее действие предобработки растительного материал препаратами изолированных ЛПС на прикрепление бактерий A.brasilense Sp245 корням пшеницы и на агглютинацию морковных клеток бактериями данного штамм; Выявлено также агглютинирующее действие изолированных ЛПС при их добавлени к суспензиям азоспирилл, что может быть связано с проявлением эффекта стерич( ского исключения клеток, аналогичного известному из литературы действию прот< огликанов на суспензии клеток животных.
Показано, что предобработка корней пшеницы препаратом изолированных Ш1 A.brasilense Sp245 приводит к усилению синтеза белков апопласта, сравнимому аналогичным эффектом при инокуляции растений целыми клетками данного штаммі Это можно считать свидетельством возможной активной роли ЛПС азоспирилл так» и на уровне, обеспечивающем запуск специфических ответных реакций со стороні растений при их взаимодействии с клетками исследуемых нами микроорганизмов.
Практическая значимость работы заключается, в частности, в том, что н примере решения конкретных задач изучения азоспирилл в ней продемонстрирован
:окая эффективность комплексного иммуноанализа как средства, позволяющего і относительно низких затратах на несложном оборудовании получать разнообраз-о информацию о тонких деталях структурной организации клеточной поверхности івенньїх бактерий.
Выполненная в работе идентификация О-специфического полисахарида, гомоло-[ного по составу основным внеклеточным структурам A.brasilense Sp245, может :спечить целенаправленный поиск эффективных биоспецифических зондов при )ведении цитохимических, таксономических и экологических исследований азос-
)ИЛЛ.
Развитая в работе методология и полученные результаты скрининга большого :ла мутантов азоспирилл с измененными свойствами клеточной поверхности ис-іьзованьї при проведении плановых НИР сотрудниками Лаборатории генетики кроорганизмов (ЛГМ) и Лаборатории физической химии клеточных структур Е>ХКС) ИБФРМ РАН, а также при выполнении проекта "Создание эффективной )тест-системы для мониторинга почвенных азотфиксирующих бактерий, ассоции-онных с высшими растениями" в соответствии с Госзаказом от Миннауки РФ в іках ГНТП "Средства обеспечения исследований по физико-химической биологии іиотехнологии" (Распоряжение № 816ф от 15.03.95 г. и последующие, научный :оводитель зав. лаб. к.ф.-м.н. Щеголев С.Ю.).
Результаты диссертационной работы использованы при подготовке курсовых и томных работ студентами биологического факультета СГУ. Основные положення, выносимые автором на защиту:
Нетипичный характер микробной диссоциации типового штамма A.brasilense Sp7 и интерпретация выявленных закономерностей с учетом особенностей О-антигенного строения клеток данного штамма.
Явление иммунохимической гетерогенности О-специфических полисахаридов A.brasilense Sp245 и доказательство антигенной идентичности материала внеклеточных структур (КПС и ЭПС) данного штамма одному из двух исследованных О-ПС.
Агглютинирующее действие ЛПС азоспирилл, способствующее адгезии бактерий на растительном материале.
Доказательство активной роли ЛПС азоспирилл при их контактных взаимодействиях с растениями на уровне, обеспечивающем запуск специфических ответных реакций со стороны партнера.
Работа выполнена в ЛФХКС ИБФРМ РАН в соответствии с плановой темой Р "Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микро-анизмов и растений" (№ гос. per. 01890017743, научный руководитель зав. лаб. к. л. н. Щеголев С.Ю.), а также в соответствии с планом НИР по проекту "Создание зективной биотест-системы для мониторинга почвенных азотфиксирующих бакте-І, ассоциированных с высшими растениями" и проектом INTAS "Физико-іическое исследование бактериальных метаболитов, молекулярных структур и комплексов, вовлеченных в растительно-микробные ассоциативные взаимоотно-шя" (проект 96-1015).
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлені виде устных и стендовых сообщений на: 1-ой Европейской конференции по азотф сации (Сегед, Венгрия, 1994), Рабочем совещании "Azospirillum и родственные м роорганизмы" (Шарвар, Венгрия, 1994), 9-ом Баховском коллоквиуме по азотфю ции (Москва, Россия, 1995), 10-ом Международном конгрессе по азотфиксаі (Санкт-Петербург, Россия, 1995), 8-ом Международном конгрессе по молекулярн микробно-растительным взаимодействиям (Ноксвил, США, 1996), 2-ой Европейсі конференции по азотфиксации (Познань, Польша, 1996), 11-ом Международном к грессе по азотфиксации (Париж, Франция, 1997), а также на отчетных научных к ференциях ИБФРМ РАН.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ в зарубежных и оте ственных научных изданиях.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обз<
литературы, трех глав, включающих описание материалов и методов исследован
изложение полученных результатов с их обсуждением и заключение, выводов и с
ска использованных литературных источников. Работа изложена на страни