Введение к работе
С другой стороны, отдельные стрептококковые поверхностные белки (Т, М и SOF, а в ряде случаев нейраминилаза и ДНКаза) являются важными эпидемиологическими маркерами и широко используются для типирования и субтипирования штаммов этой бактерии. Поэтому анализ последовательностей генов данных типоспецифических маркеров позволит получить новую информацию, которая может быть использована для создании молекулярно-диагностических методик.
В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы является детальная характеристика генов поверхностных факторов патогеиности стреіггококков группы А и кодируемых ими белков, а также генетический анализ взаимоотношений между одноименными и аналогичными генами различных серотипов стрептококков. Дію достижения поставленной цели запланированы следующие задачи:
-
Определить организацию vir регулона в штамме стрептококка группы А М15 ссротипа. Данный тип выбран для изучения, поскольку в предыдущих работах он был использован для изучения патогеиности и выделения натиккого i^^j рецепторного оелкд.
-
Определить полную нуклеотидную последовательность генов, составляющих центральную часть vir регулона этого серотипа, а тик же последовательность фланкирующих генов, входящих в состав регулона.
3. Провести сравнительный анализ нуклеотидных
последовательностей ряда клонированных генов.
4. Экспрессировать рекомбинантные гены в E.coli.
-
Выделить рекомбинантные белки, кодируемые генами vir регулона и определить их связывающие свойства.
-
Клонировать в E.coli ген нового фибриноген связывающего белка (белка F) стрептококка группы А.
7. Определить нуклеотидную последовательность гена,
кодирующего данный белок и провести ее анализ.
-
Экспрессировать ген этого бслока в E.coli.
-
Провести очистку белка F с последующим исследованием его свойств. Научная новизна работы состоит в том, что:
1. Впервые определена организация vir регулона в штамме М15
серотипа стрептококка группы А.
-
Впервые показано, что М15 серотип должен быть отнесен к SOF положительным типам.
-
Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генов, составляющих центральную часть vir регулона штамма М15 серотипа,
4. Впервые показано, что M-like (М-подобные) белки SOF
положительных серотипов стрептококков группы А отличаются по своей
организации, и возможно, по функции от настоящих М белков из SOF
негативных штаммов.
5. Детально изучены связывающие свойства всех белков,
кодируемых генами vir регулона.
6. Впервые показано, что фибронектнн-связывающий белок F
также обладает аффинностью к фибриногену, хотя и с менее выраженной
активностью.
7. Впервые показано, на примере гена белка F, что горизонтальный
перенос генетического материала, по-видимому является одним из
основных механизмов формирования изменчивости стрептококковых
факторов патогенносте.
Теоретическая ценность.
Данная работа носит теоретический характер. Полученные результаты позволяют ответить на вопрос о механизмах образования изменчивости генов стрептококковых факторов патогенности. Анализ свойств различных поверхностных белков стрептококка в сопоставлении с вызываемыми ими заболеваниями должен помочь в установлении реальных путей, по которым бактерия атакует организм хозяина, а также вычленить наиболее важное звено в патогенезе стрептококковых инфекций. В дополнение к сказанному следует отметить, что полное понимание "образа действия" стрептококка позволит определять группы людей наиболее подверженных этой инфекции (или отдельным её формам) и, тем самым, значительно снизить риск развития заболевания.
Практическая ценность.
С практической точки зрения, исследование основного фактора адгезии стрептококка, фибронектин/фибриноген связывающего белка F, как возможного кандидата на создание вакцины, предотвращающей адгезию стрептококка к клеткам хозяина может оказаться ключевым моментом в предотвращении рятчития стрептококковах заболеваний. Информация, полученная при анализе последовательности гена M-likel5 белка может оказаться полезной при типировапии клинических изолятов стрептококков методом ДНК-ДНК гибридизации.
Положения, выносимые на защиту:
1. M1S ссротип стрептококков группы А принадлежит к SOF
положительному типу, что согласуется с организацией vir регулона в этом
серотипе и с последовательностью С-терминальной части EmmLl5 белка.
2. Связывание иммуноглобулинов является характерным свойством
белков, кодируемых в vir регулоне SOF положительных типов
стрептококков группы А.
-
Фибронектин связывающий белок F обладает способностью связывать фибриноген, что может подтверждать важность связывания фибриногена стрептококком, как одного из основных механизмов, обуславливующем патогегшость стрептококков группы А.
-
Точечные мутации и горизонтальный генетический перенос играют основную роль в формировании изменчивости генов факторов
патогенносте стрептококка, как показано на примере анализа последовательностей гена белка F из различных серогипоп.
Достоверность полученных результатов подтверждается следующим:
1. Высокой специфичностью использованных молекулярных
методов ( полимеразная цепная реакция, секвенирование, ДНК-ДНК
гибридизация, иммунологические методы анализа и т.д.), которые в
совокупности позволяют однозначно трактовать полученные данные.
2. Применением наиболее современных способов компьютерного
анализа данных секвенирования ДНК с привлечением таких банков
данных как GcnBank, EMBL и SwissProt.
Апробация работы.
Материалы диссертации опубликованы в четырех научных статьях, и доложены на "XII Лансфильдовском Международном симпозиуме по стрептококкам и стрептококковым заболевашшм", С-Петербург, 1993 г. и на Международной научной встрече "Лунд-Мальмё-Копенгаген" в 1995 году. Материалы работы докладывались на заседании Отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН (1993, 1994 гг.) и на конференции Отдела микробиологии Университета Луида (Швеция) (1994, 1995 гг.). Объем и структура диссертации.
Материалы диссертации изложены на 123 страницах машинописного текста и включают: введение, обзор литературы, описание материалов и методов, пять глав собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 2 таблицами и 16 рисунками. Указатель литературы содержит 85 иностранных источников.