Изучение функционирования фитобактериальных ассоциаций в условиях in vitro на примере зеленных культур Овод Артём Артурович

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1 Роль зеленных культур в распространении пищевых инфекций 11

1.1. Значение фитобактериальных ассоциаций в природе 11

1.2 Патогенность и паразитизм микроорганизмов 17

1.3 Зеленные культуры как фактор передачи пищевых инфекций 25

1.4 Биологические и экологические особенности псевдомонад 34

1.5 Использование биологических моделей в экспериментах in vitro 39

Глава 2 Механизмы устойчивости растений при взаимодействии с микроорганизмами 42

2.1 Клеточные механизмы защиты растений 42

2.2 Биосинтез фитоалексинов и вторичных метаболитов 45

2.3 Гормональная регуляция и использование регуляторов роста и развития растений в защите от микроорганизмов 48

Глава 3 Объекты и методы исследований 55

3.1 Общая характеристика объектов исследования 55

3.1.1 Бактерии рода Pseudomonas 56

3.1.2 Растения и культура каллусных тканей листового салата (Lactuca sativa L.) и базилика красного (Ocimum basilicum L.) 58

3.1.3 Инфузории Paramecium caudatum 59

3.1.4 Характеристика регуляторов роста и развития растений 60

3.2 Методы исследования 61

3.2.1 Методика стерильного модельного опыта по изучению динамики численности бактерий Ps.aeruginosa и Ps.fluorescens в ассоциации с каллусами зеленных культур 61

3.2.2 Методика выделения бактерий рода Pseudomonas из зараженных растительных объектов 3.2.4 Определение биохимических свойств псевдомонад 67

3.2.5 Определение суммарного содержания водорастворимых форм фенольных соединений 69

3.2.6 Методика стерильного модельного опыта по изучению динамики численности бактерий Ps.aeruginosa и Ps.fluorescens в ассоциации с зеленными культурами в условиях in vitro 69

3.2.7 Гистологические исследования каллусных культур и растений, полученных в условиях in vitro 70

3.2.8 Определение вирулентности Ps. aeruginosa при инфицировании зеленных культур с использованием простейших P.caudatum 72

3.2.9 Методика модельного опыта по изучению влияния регуляторов роста и развития растений на функционирование фитобактериальных ассоциаций, изучаемых псевдомонад и зеленных культур в условиях in vitro 73

3.2.10 Статистическая обработка данных 75

Глава 4 Исследование взаимодействия бактерий рода Pseudomonas с каллусами зеленных культур 76

4.1 Изучение динамики численности Ps.aeruginosa и Ps.fluorescens в ассоциации с каллусами зеленных культур 76

4.2 Гистологические исследования контаминированных каллусных культур и определение в них суммарного содержания водорастворимых фенольных соединений 82

Глава 5 Исследование взаимодействия бактерий рода Pseudomonas с зеленными культурами в условиях in vitro 90

5.1 Изучение динамики численности бактерий Ps.aeruginosa и Ps.fluorescens в ассоциации с зеленными культурами и определение в них суммарного содержания растворимых фенольных соединений 90

5.2 Гистологические исследования инфицированных растений, полученных в условиях in vitro 101

5.3 Определение вирулентности Ps. aeruginosa при инфицировании зеленных культур с использованием простейших P.caudatum 113

5.4 Изучение влияния регуляторов роста и развития растений на функционирование исследуемых фитобактериальных ассоциаций в условиях in vitro 121

Заключение 132

Список литературы 135

• Патогенность и паразитизм микроорганизмов
• Методика стерильного модельного опыта по изучению динамики численности бактерий Ps.aeruginosa и Ps.fluorescens в ассоциации с каллусами зеленных культур
• Гистологические исследования контаминированных каллусных культур и определение в них суммарного содержания водорастворимых фенольных соединений
• Изучение влияния регуляторов роста и развития растений на функционирование исследуемых фитобактериальных ассоциаций в условиях in vitro

Введение к работе

Актуальность и степень разработанности темы исследования.

Одной из приоритетных задач, направленных на охрану здоровья населения, является обеспечение микробиологической безопасности пищевых продуктов, поскольку увеличение числа инфекционных заболеваний, связанных с употреблением недоброкачественного продовольствия, в частности, растительного происхождения, отмечается во многих странах мира. Об этом свидетельствуют массовые эпидемиологические случаи, ярким примером которых служит вспышка, охватившая Европу в 2011 году, вызвавшая острое кишечное заболевание более чем у 4000 человек, и повлекшая фатальные последствия более чем для 50-ти заболевших (Кафтырева Л.А., Егорова С.А. и др., 2011).

Многочисленными исследованиями в нашей стране (Пушкарева В.И., Литвин В.Ю. и др., 2012; Маркова Ю.А., Турская А.Л., 2012) и за рубежом (Heaton J.C., Jones K., 2008; Brandl M.T., Amundson R., 2008) установлено, что в растительных продуктах обнаруживаются патогенные и условно - патогенные микроорганизмы, локализованные не только на поверхности овощных растений, но и внутри них. В отношении зеленных культур, употребляемых в свежем виде, дезинфицирующие меры невозможны, поскольку источник инфекции находится внутри съедобной части растения. Потенциально патогенные для человека бактерии, способные к эндотрофному способу существования, находят благоприятные условия внутри растительной ткани.

Но не только истинные патогены – паразиты человека и животных
являются возбудителями инфекционных заболеваний современного человека.
Сегодня на первые места стремительно выходят условно-патогенные
микроорганизмы – вчерашние сапротрофы, а завтра, можно полагать, на арену
инфекционной патологии выйдут сегодняшние свободноживущие

микроорганизмы, чья эпидемиологическая роль – вопрос скорее не возможности, а времени (Литвин и др., 1998; Сомов Г.П., 2004).

Торговые отношения между Россией и другими странами способствуют регулярному перемещению значительных объемов овощной и другой пищевой продукции различными путями сообщения, что создает потенциальную угрозу распространения возбудителей пищевых инфекций не только в страны третьего мира, но и в государства с высокотехнологичной пищевой индустрией.

В современном мире активно развиваются новые технологии производства продуктов, которые оказывают непосредственное влияние на выбор населения в пользу биогенного питания, вегетарианства, фаст-фуда, введение в рацион проростков зеленных культур, не подвергающихся тепловой обработке. Следствием таких изменений рациона питания является возникновение вспышек пищевых токсикоинфекций (Пушкарева В.И., Литвин В.Ю. и др.,2012).

В эру антибиотиков кишечные инфекции бактериальной природы по-прежнему остаются глобальной проблемой для всего человечества. Таким образом, проблема выявления новых источников инфекций человека и животных, связанной с циркуляцией во внешней среде сапротрофных и условно-патогенных бактерий остается неизученной или слабоизученной.

Целью данной работы является изучение формирования и

функционирования фитобактериальных ассоциаций в условиях in vitro на примере зеленных культур.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить динамику численности бактерий рода Pseudomonas в ассоциации с каллусами листового салата (Lactuca sativa L.) и базилика красного (Ocimum basilicum L.) на протяжении 7 суток после заражения.

2. В ходе гистологических исследований проанализировать морфологические изменения инфицированных каллусных клеток изучаемых растений и определить в них суммарное содержание фенольных соединений.

3. Выявить основные зоны локализации псевдомонад и их распределение в инфицированных растениях на протяжении всего периода наблюдений.

4. Изучить динамику численности бактерий Ps.aeruginosa и Ps.fluorescens в ассоциации с зеленными культурами в условиях in vitro и определить в них суммарное содержание растворимых фенольных соединений.

5. В ходе электронно-микроскопических исследований выявить различия в ультраструктуре инфицированных растительных клеток и клеток растений без заражения.

6. Определить вирулентность Ps.aeruginosa до и после заражения зеленных культур в условиях in vitro с использованием клеток простейших P.caudatum.

7. Оценить влияние регуляторов роста и развития растений на формирование и функционирование фитобактериальных ассоциаций, изучаемых псевдомонад и зеленных культур в условиях in vitro.

Научная новизна. Впервые установлены различия в динамике численности Ps.aeruginosa и Ps.fluorescens в ассоциации с каллусами зеленых культур, характеризующиеся увеличением количества условно-патогенных и сапротрофных бактерий в ассоциации с листовым салатом (Lactuca sativa L.) и сокращением количества Ps.aeruginosa в каллусных тканях базилика красного (Ocimum basilicum L.) практически до исходного уровня заражения (10⁶ КОЕ/г) на протяжении 7 суток после заражения.

Впервые в ходе гистологических исследований выявлено цитотоксическое действие при проникновении Ps. aeruginosa в каллусные клетки листового салата и базилика, проявляющееся в деформации или разрушении клеточных стенок. Присутствие Ps.fluorescens в каллусных клетках не вызывало их повреждений и гибели.

Впервые при проведении опытов с зеленными культурами в условиях in vitro установлено, что Ps.aeruginosa и Ps.fluorescens мигрировали во все надземные части растений с неравномерным распределением: наибольшая концентрация наблюдалась в нижних листьях базилика (до 10⁷ КОЕ/г) и во внешних листьях листового салата (до 10⁸ КОЕ/г).

Впервые экспериментальным путем было доказано, что увеличение численности проникающих в растения бактерий Ps.aeruginosa и Ps.fluorescens сопровождалось возрастанием концентрации фенольных соединений при взаимодействии c листовым салатом - в 1,5 раза, а в ассоциации с базиликом - в 3 раза по отношению к контролю.

Впервые в результате электронно-микроскопических исследований выявлены ультраструктурные изменения растительных клеток листового салата и базилика при инфицировании бактериями Ps.aeruginosa, сопровождающиеся деформацией и нарушением целостности клеточной стенки, увеличением размера хлоропластов, иногда полной их деструкцией с увеличением числа пластоглобул. Ps.fluorescens локализовались в цитоплазме и хлоропластах клеток без цитотоксического воздействия с увеличением количества митохондрий и липидных капель.

Впервые при взаимодействии Ps.aeruginosa с листовым салатом и базиликом на моделях простейших Paramecium caudatum было доказано сохранение вирулентности бактерий после их выделения из растений. Цитотоксическое действие Ps.aeruginosa на эукариотические клетки инфузорий сопровождалось морфологическими изменениями и гибелью парамеций: при инфицировании изолятами из базилика - в течение 25 мин, а изолятами из листового салата – 20 мин.

Впервые установлено, что использование салициловой кислоты (0,69 мг/л) и кремнийорганического препарата Черказ (75 мг/л) способствовало снижению зараженности листового салата и базилика бактериями Ps.aeruginоsa и Ps. fluorescens до 100%.

Теоретическая и практическая значимость. Экспериментальные
данные настоящей работы, определяющие сущность экологической

пластичности и поведения псевдомонад, могут быть использованы при коррекции санитарно-гигиенических требований и нормативов, разработке принципиально новых подходов к контролю овощной зеленной продукции, особенно той, которая не подвергается тепловой обработке. Результаты исследований можно также использовать в учебном процессе в курсе лекций и проведении лабораторного практикума по микробиологическим дисциплинам для студентов бакалавриата и магистратуры.

Методология и методы диссертационного исследования.

Диссертационная работа выполнена с использованием классических и
современных методов микробиологических и биотехнологических

исследований, микроскопирования, ПЦР, биохимических тестов на современном оборудовании. Более подробное описание методов исследования отображено в разделе «Объекты и методы исследований».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Впервые установлено, что взаимодействие бактерий рода Pseudomonas (Ps.aeruginоsa и Ps. fluorescens) и каллусных тканей листового салата и базилика в условиях in vitro способствует формированию положительных симбиотических отношений без цитотоксического эффекта при заражении Ps.fluorescens, а при взаимодействии с Ps.aeruginosa возникают взаимоотношения по типу «паразит-хозяин» с последующим некрозом и гибелью модельных растений.

2. Основными зонами локализации Ps.aeruginоsa и Ps.fluorescens в инфицированных зеленных культурах являются внешние листья листового салата и листья нижнего яруса базилика. Взаимодействие листового салата и базилика с бактериями Ps.aeruginosa сопровождается ультраструктурными изменениями растительных клеток, а Ps.fluorescens локализуются в цитоплазме и хлоропластах клеток без цитотоксического воздействия.

3. Бактерии Ps.aeruginosa B 3994 сохраняют свою вирулентность после инфицирования ими растений листового салата и красного базилика.

4. Впервые установлено, что регуляторы роста и развития растений: салициловая кислота (0,69 мг/л) и Черказ (75,0 мг/л) снижают зараженность листового салата и базилика бактериями Ps.aeruginоsa и Ps.fluorescens до 100% в течение двух недель in vitro.

Степень достоверности и апробация результатов. Результаты диссертационной работы были представлены на 2-м Международном симпозиуме «Вторичные метаболиты: химия, биология и биотехнология» (Москва, 19-23 2014); 4-м Международном конгрессе «Микробиология и инфекции» (Дрезден, Германия, 4-8 октября 2014); 1-м Международном симпозиуме «Биоразнообразие в Евразии» (SEAB-2015) (Баку, Азербайджан, 9-12 июня, 2015); Международной научной конференции молодых учёных и специалистов, посвящённой 150-летию РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (Москва, 3-4 июня, 2015); Международном научном форуме молодых ученых «Наука будущего – наука молодых» (Севастополь, 29 сентября -2 октября, 2015); X Московской научно-практической конференции "Студенческая наука" (Москва, 11 ноября, 2015); XVII Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов в г. Нерюнгри, с международным участием, посвященной 60-летию со дня образования Якутского государственного университета (СВФУ) (Нерюнгри, 31 марта - 2 апреля, 2016); 2-м Международном симпозиуме «Биоразнообразие в Евразии» (SEAB-2016) (Анталия, Турция, 23-27 мая, 2016); Международной конференции "Современные аспекты сельскохозяйственной микробиологии", приуроченной к

120-летию создания кафедры микробиологии и посвященной юбилейной дате -150-летию со дня рождения основателя кафедры и ее первого заведующего профессора Н.Н. Худякова (Москва, 7-8 декабря, 2016); XXIV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 12 апреля, 2017); 3-м Международном симпозиуме «Биоразнообразие в Евразии» (SEAB-2017) (Минск, Беларусь, 5-8 июля, 2017); Всероссийской научной конференции с международным участием IV чтения, посвященные памяти профессора Ефремова Степана Ивановича «Современные аспекты структурно-функциональной биологии растений: от молекул до экосистем» (Орел, 28-30 сентября, 2017).

Личный вклад автора. Работа является результатом исследований, проведенных лично автором, включая проведение экспериментов, обработку и анализ полученных данных, подготовку публикаций.

Публикации. По материалам диссертации было опубликовано 19 работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора (глава 1 и 2), главы «Объекты и методы исследований» (глава 3), экспериментальной части (главы 4 и 5), заключения, списка используемой литературы. Работа изложена на 165 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц, 44 рисунка. Список используемой литературы включает 276 источников, из которых 125 на иностранном языке.

Патогенность и паразитизм микроорганизмов

Патогенность — полидетерминантная, генотипическая характеристика определенного организма, ответственная за создание специфических структур (капсул, экзотоксинов) или отвечающая за поведение, нарушающее целостность тканей организма животных или человека (Борисов Л.Б., 2005).

Патогенность, которая не является обязательным свойством паразитов или конкретно определенных видов, широко распространена в природе и может проявляться постоянно и регулярно, периодически или случайно у различных микроорганизмов, может быть временной и легкообратимой. Все эти различные определения отражаются в таких терминах, как «условно-патогенные» или «потенциально-патогенные» микроорганизмы, патогенность данных видов не является для человека и теплокровных необходимым условием существования (Фролов А.Ф., Зарицкий А.М. и др.,1995).

Свойство патогенности, как известно, представляет собой видовой признак микроорганизма, а ее степень определяется вирулентностью штаммов внутри одного вида (Akira S. et al, 2006). Патогенность из-за генетических изменений может колебаться в широких пределах: сапротрофные бактерии могут стать носителями вирулентных генов, а для опасных возбудителей инфекционных заболеваний можно получить авирулентные штаммы (Кунилова Е.С., Краева Л.А., 2012). Помимо генетических особенностей, большое значение имеют факторы, влияющие на культивирование микроорганизмов.

Среди основных факторов патогенности микроорганизмов выделяют адгезию, обеспечивающую прикрепление к клеткам-мишеням; инвазивность, способствующую проникновению внутрь клеток и распространению в межклеточном пространстве; токсигенность, способность к персистенции (Hall-Stoodley L., Costerton J.W. et al, 2004). Адгезия – это способность микроорганизмов адсорбироваться на восприимчивых клетках с дальнейшей их колонизацией, являющаяся основным механизмом инфекционного процесса (Шамрай С.Н., 2003). У грамотрицательных бактерий основную роль в процессе адгезии играют жгутики, фимбрии и пили (особенно IV типа), а у грамположительных – адгезины выступают в роли белков и тейхоевых кислот клеточной стенки. Но не только эти органеллы способствуют прикреплению к субстрату. Так, например, бактерии Ps. aeruginosa располагают также и специальными адгезивными молекулами (липид А, белки, ассоциированные с поверхностной мембраной, поверхностные протеины Opr (OprQ, OprF), адгезивные лектины PA-IL и PA-IIL) (Azghani A.O. et al, 2002; Pier G.B., 2007; Arhin A., Boucher C., 2010).

Способность бактерий просачиваться во внутреннюю среду организма, распространяясь по его тканям и органам, называется инвазией. Инвазия бактерий обеспечивается группой экзоферментов, воздействующих на определенные компоненты в составе клеточных стенок, мембран, межклеточного вещества и т.д. Синегнойная палочка для этих целей использует апоптоз-индуцирующие белки, сидерофоры, ряд протеолитических ферментов (эластазы LasA и LasB, щелочную протеазу (AprA), протеазу IV (PrpL)) вызывая гидролиз эластина, деструкцию соединительных тканей, фибрина, коллагена, разрушение иммуноглобулинов, интерферонов; липазу (LipA, LipB, LipC), фосфолипазу С, воздействующих на клеточные мембраны любых типов клеток (Caballero A.R., Moreau J.M. et al, 2001). Энтеробактерии используют нейраминидазу, для преодоления слизистого слоя, гиалуронидазу для гидролитического разложения гиалуроновой кислоты для увеличения проницаемости различных тканей (Булгаков А.К., 2000).

Наиболее широко среди всех факторов патогенности представлена способность микроорганизмов синтезировать токсины (Вертиев, Ю.В., 1996). Все токсины по биологическим признакам разделяют на два вида: экзотоксины и эндотоксины (McDowell J., Dangl J. 2000). Экзотоксины, в свою очередь, продуцируют как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии, а по химической структуре представляют белковую природу. По механизму действия различают: цитотоксины, мембранотоксины, функциональные блокаторы, эксфолианты и эритрогемины (Smitt С. в соавт., 1999; Моррисон А.В., Попович В.И., Моррисон В.В., 2014).

Так, грамположительные бактерии Listeria monocytogenes способны к синтезу тиолзависимого гемолизина листериолизина О, который характеризуется выраженным токсикологическим действием по отношению к эукариотическим клеткам, вызывая лизис клеточных структур (Тартаковский И.С., 2000). Энтерогеморрагические E. coli (EHEC) O157: H7, вызывающие тяжелые кишечные заболевания, вырабатывают шигаподобные токсины (веротоксины I и II типа - VT1 и VT2) (Иванова Е.И., Попкова С.М. и др., 2014).

Синегнойная палочка способна синтезировать два класса экзотоксинов, отличающихся главным образом системой высвобождения токсинов (системой секреции). Первый класс экзотоксинов выделяется через систему I и II типа и к нему относится экзотоксин А (ExoA), состоящий из трех субъединиц, одна из которых фиксируется рецепторами клеток-мишеней, вторая обеспечивает проникновение через цитоплазматическую мембрану, а третья - блокирует синтез белка, что приводит к апоптозу (Моррисон А. В., Попович В.И. и др., 2014). Вторая группа токсинов, именуемые контактными (ExoS и ExoT), секретируется системой III типа (т.н. «макромолекулярный шприц»), при помощи поверхностного молекулярного комплекса вводится в цитоплазму адгезированной клетки, не затрагивая при этом соседние клетки. Продуцируемый Ps.aeruginosa цитотоксин увеличивает проницаемость мембран и вызывает цитопатогенное действие на клетки, а ЛПС (эндотоксин) оказывает общий токсический эффект (Pseudomonas aeruginosa: патогенность, патогенез и патология, 2015).

Условно-патогенные и патогенные микроорганизмы вследствие эволюционного развития выработали факторы, обеспечивающие длительное выживание в организме-хозяине (персистенцию). Известно, что синегнойная палочка, имея в своем арсенале ряд пигментов, оксидазу противостоит повреждению от кислородных радикалов. Благодаря синтезу альгината, Ps.aeruginosa увеличивает вязкость секретов и экссудатов, тем самым защищая себя от клеточных и гуморальных механизмов иммунитета (May T.B., Shinabarger D. et al,1991).

Одним из самых совершенных механизмов персистенции бактерий является образование биопленок — особой формы существования микроорганизмов, представляющей организованное структурное и уникальное сообщество, причем микроорганизмы – это 35% массы биопленки, а все остальное – экзополисахаридный матрикс, защищающий бактерии от воздействия неблагоприятных факторов внешней среды и организма хозяина (Мальцев С.В., Мансурова Г.Ш., 2013). В структуру матрикса возбудителя синегнойной инфекции входит рамнолипиды, альгинат, протеины (CdrA), ДНК, Psl- и Pel-полисахариды. Для образования биопленочного матрикса бактерии также использует биополимерные соединения клеток хозяина (Кузнецова М.В., Николаева Н.В. и др., 2011; Чеботарь И.В., 2012).

По словам P. Watnick и R. Kolter (2000) биопленки с уверенностью можно называть целыми городами микробов, т.к. они могут включать в себя не только один вид, род или даже группу бактерий, но и множество различных типов микроорганизмов (бактерии, простейшие, грибы, водоросли).

Методы микробной биотехнологии позволяют успешно накапливать биомассу микроорганизмов (ту же самую биопленку) в специальных ферментерах и использовать их в производстве продуктов, лекарств, пищевых добавок, утилизации отходов, нейтрализации загрязнений воды и почвы нефтепродуктами и т.д. (Промышленная микробиология, 2006).

Способность бактерий, в том числе патогенных, адгезировать (прикрепляться) к различным поверхностям и субстратам (частицам почвы, ризоплане растений и т.д.) известна очень давно. Данное свойство универсально и проявляется также на «неживых» поверхностях – стекле, пластике, тефлоне и т.д., а также на пищевых частицах и кормах для животных (Houdt R.V., Michiels C.W., 2010).

Многие возбудители пищевых инфекций, такие как Salmonella, Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes, способны формировать биопленку на поверхности пищевых продуктов (Годова Г.В., Туманова О.В., 2007; Пушкарева В.И., Юрова М.А. и др., 2013).

В экспериментальных условиях in vitro установлены стадии развития биопленок, включающие переход от планктонного образа жизни «к сидячему», прикрепляясь к различным поверхностям (адгезию), фиксацию к поверхности и образование экзополисахаридного матрикса, накопление биомассы и формирование микроколоний (созревании биопленки), деструкцию поздних биопленок и выход бактерий, вновь приобретающих подвижность, в окружающую среду (Пушкарева В.И., Литвин В.Ю. и др., 2011).

Одним из условий прикрепления бактерий является наличие органической «подложки». После контакта водопроводных труб с водой начинается отложение органических веществ. Этот слой представляет собой и источник питания для роста и развития бактерий, и специфический нейтрализатор электрического поверхностного заряда, препятствующий адгезии бактерий к поверхности (Conway В.А., Speert D., 2002; Hazan Z, Zumeris J., 2006; Доброхотский О.Н., Хомяков Ю.Н. и др., 2009).

Научными исследованиями в мире доказана роль микробных биопленок в возникновении и распространении инфекционных заболеваний, вызванных Staphylococcus aureus (Gazzola S., Cocconcelli P.S., 2008; Joan A., 2010;); Е. coli (Hancock V., Ferrieres L., Klemm P., 2007), Ps. аeruginosa (Балко А.Б., Балко О.И. и др., 2013) и многими другими. Так, исследователями из США (Drenkard E., Ausubel F.M., 2002) было доказано формирование антибиотикоустойчивых биопленок штаммами Ps. aeruginosa на легких пациентов. По словам Zhaobin Xu и др. (2013), занимающихся изучением и оценкой метаболических моделей Ps.aeruginosa, устойчивость бактерий к антибиотикам, находящихся в состоянии биопленки, возрастает от 10 до 1000 раз. Работами некоторых ученых (Baum M.M., Kainoviс A. et al, 2009), на примере выделенных из почвы изолятов Ps.aeruginosa, была показана сложная архитектоника зрелых биопленок, которая может давать определенное преимущество в естественной среде.

Методика стерильного модельного опыта по изучению динамики численности бактерий Ps.aeruginosa и Ps.fluorescens в ассоциации с каллусами зеленных культур

Для получения изучаемых зеленных культур in vitro семена листового салата и базилика стерилизовали 0,1% раствором дихлорида ртути (сулемы). Время стерилизации семян у салата и базилика составило 5 и 8 мин соответственно. После чего семена промывали стерильной водой и высевали на предварительно простерилизованную в автоклаве при давлении 1 атм. в течение 20 мин питательную среду Mурасиге Скуга (MS) (рН 5,7) в стеклянные емкости объемом 500 мл. После получения растений в фазе 3-5 листьев (рис.2) их использовали для выращивания каллусных культур (Калашникова Е.А., Чередниченко М.Ю. и др., 2014).

Для этого каждое из растений разрезали на кусочки длиной около 1 см в стерильных условиях в ламинар-боксе и помещали в чашки Петри со средой MS (рН 5,8) с добавлением фитогормонов 2,4-D (2,0 мг/л) и БАП (0,5 мг/л). Растения и впоследствии полученные из них каллусы (рис.3) выращивали в световой комнате при влажности воздуха 70%, освещенности 5000 люкс и температуре 25С по общепринятой методике (Калашникова Е.А., Чередниченко М.Ю. и др., 2014).

Для учета микроорганизмов использовался метод определения количества жизнеспособных клеток путем высева на питательные среды (чашечный метод Коха). Сущность такого метода заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии микроорганизмов на агаризованную питательную среду в чашках Петри и подсчете формирующихся колоний (Скворцова И.Н., 1981; Практикум по микробиологии, 1993).

В экспериментах был использован метод посева на агаризованную среду МПА. Для проведения микробиологического посева в микропробирки типа эппендорф переносили по 900 мкл стерильной воды. Далее из суспензии зараженных гомогенезированных каллусов и растений методом последовательных разведений приливали по 100 мкл из пробирки в пробирку. В 1 мл стерильной воды измельчали исследуемые образцы каллусов и растений (верхние и внешние листья листового салата; верхние, средние, нижние листья и стебель базилика) и приготавливали разведение до 10-4. Затем 100 мкл суспензии из каждого разведения помещали в стерильную чашку Петри и заливали расплавленной и охлажденной до 45оС средой МПА. Инкубировали в термостате при температуре 28оС в течении 2-х суток, а после чего производили подсчет колоний.

Выделенные из инфицированных каллусов и растений в ходе бактериологических исследований колонии идентифицировали с помощью окраски по Граму, определения подвижности, естественной флуоресценции. Для подтверждения результатов посева использовался метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Особенностью окраски по Граму является неодинаковое отношение различных бактерий к красителям трифенилметановой группы, что является важным дифференциально-диагностическим признаком. Клетки, входящие в группу грамположительных, дают прочное соединение с красителями (генцианвиолетом, метилвиолетом и т.д.) и йодом. Грамположительные бактерии при обесцвечивании спиртом не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет. Грамотрицательные генцианвиолетом не окрашиваются, розово-красную окраску приобретают при окрашивании фуксином. В данных исследованиях использовался экспресс-метод окраски по Граму. На обезжиренное стекло наносили петлей каплю физиологического раствора, в которую вносили небольшое количество микробных клеток из анализируемой колонии. Затем петлей вносили 1 каплю 0,5 %-го спиртового раствора кристаллического фиолетового, распределяли смесь по стеклу и подсушивали мазок при комнатной температуре. Далее фиксировали на пламени горелки, промывали водой, просушивали фильтровальной бумагой и наносили спиртовой раствор йода, йодистого калия и фуксина, покрывая им всю поверхность стекла на 5 мин., тщательно и быстро прополаскивали водой, просушивали фильтровальной бумагой, затем микроскопировали (Годова Г.В., 1997).

Определение подвижности. Для определения подвижности клеток использовали суточную культуру. Для этого на предметное стекло наносили каплю исследуемой культуры и добавляли каплю 5 % водного раствора фенола. Подвижность наблюдали в режиме фазового контраста с использованием микроскопа Axio Imager М1 (Zeiss, Германия), при максимальном увеличении х2000. Микрофотоснимки сделаны цифровой камерой AxioCam MRm и обработаны с использованием программы Axio Vision Rel. 4.8. (Скворцова И.Н., 1981; Фитопатогенные микроорганизмы, 2006).

Определение естественной флуоресценции. Для определения естественной флюоресценции готовили препарат в «раздавленной капле» (Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И., 1993) и микроскопировали с использованием микроскопа Axio Imager М1 (Zeiss, Германия) в ультрафиолетовом свете с длиной волны 210-275 нм и применением стандартного светофильтра UV-Natural.

Постановка полимеразной цепной реакции. ПЦР – это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллионов других молекул. Суть метода заключается в многократном копировании (амплификации) в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение количества специфических фрагментов ДНК, что значительно упрощает дальнейший анализ (Лопухов Л.В., Эйдельштейн М.В., 2000).

Молекулярно-генетические исследования изолятов псевдомонад проводили с использованием родо- (Ps-for/Ps-rev) и видоспецифичных (PA-SS-F/PA-SS-R) праймеров для выявления Ps. aeruginosa (для детекции toxA-гена, кодирующего синтез экзотоксина А) (табл. 8).

Гистологические исследования контаминированных каллусных культур и определение в них суммарного содержания водорастворимых фенольных соединений

На следующем этапе исследований, инфицированных каллусных культур было необходимо выявить способность псевдомонад проникать внутрь каллусных тканей и оценить возможные морфологические изменения растительных клеток при внедрении изучаемых бактерий на 3-и сутки после заражения. Этот период наблюдений был выбран с учетом результатов предыдущего эксперимента, который показал морфологические изменения самих каллусов, а также начало активного роста бактерий при взаимодействии с ними.

При анализе полученных гистологических срезов «модельных растений», зараженных бактериями рода Pseudomonas, выявлено их проникновение в растительные клетки. Как в случае с каллусами листового салата, так и с каллусами базилика, синегнойная палочка проникала в клетки, вызывая нарушение целостности клеточных структур: деформацию c приобретением волнообразной формы или разрушение клеточной стенки, отслоение цитоплазмы и в некоторых случаях выход содержимого клеток в межклеточное пространство (рис.12).

При значительной концентрации бактерий наблюдалось полное разрушение каллусных клеток. Такой цитопатогенный эффект может быть вызван воздействием основного фактора патогенности Ps.aeruginosa – экзотоксином А, который, согласно современным представлениям, приводит к ингибированию белкового синтеза и апоптозу (Моррисон А.В. и др., 2014; Овод А.А., Годова Г.В., Калашникова Е.А., 2018).

Так, в работе Моррисона А.В. (2015) на белых мышах установлено, что экзотоксин А воздействует на эукариотические клетки, повышая проницаемость мембран, а также вызывая набухание митохондрий и нарушение в электрон-транспортной цитохромной системе.

При исследовании взаимоотношений Ps.fluorescens с каллусными клетками листового салата и базилика выявлена локализация бактерий как в межклеточном пространстве, так и внутри клеток без видимого цитопатогенного воздействия (рис.13). Клетки «модельных растений» имели овальную форму и неповрежденные клеточные стенки.

Несмотря на отсутствие токсинов и иных факторов патогенности, сапротрофные псевдомонады все же проникали внутрь клеток, причем как показывает популяционная динамика, их численность возрастала, следовательно, внутри каллусных клеток создавались благоприятные условия для их размножения. Контрольный вариант (каллусы зеленных культур без заражения) был представлен на микрофотоснимках гетерогенными клетками (разного размера), с четко выраженной цельной клеточной стенкой толщиной около 1 мкм. Большую часть клетки занимала цитоплазма, в которой полностью отсутствовали хлоропласты (рис.14), которые, по-видимому, были утрачены в процессе каллусообразования.

Мурашкина И. А. и др. (2015) утверждают, что процесс образования каллусов сопровождается потерей запасных веществ (липидов, крахмала, белков), а затем деструкцией комплекса Гольджи и специализированных клеточных органелл, например, хлоропластов, что приводит к росту числа амилопластов, перестройки ЭПС и элементов цитоскелета.

В ранее проведенных нами исследованиях (Пушкарева В.И. и др., 2013) при изучении взаимодействия листерий с каллусами листового салата и пекинской капусты, бактерии также проникали в межклеточное пространство по истечению 48 ч после заражения. В этот период повреждений клеточных структур зафиксировано не было, однако в более поздний период наблюдений при взаимодействии с L. monocytogenes EGD клетки каллусов претерпевали значительные изменения в форме и размерах, происходила деформация клеточных стенок (истончение, изменение формы, приобретение выпячиваний и т.д.).

Возможно, у попавших в межклеточное пространство патогенных бактерий активировался процесс адгезии, сопровождавшийся синтезом листериолизина О, что приводило к повреждению клеточных стенок клеток-хозяев, а при значительном скоплении микроорганизмов и к лизису каллусных клеток.

В работе Годовой Г.В., Пушкаревой В.И. и др. (2009) при проведении электронно-микроскопических исследований ассоциаций L.monocytogenes с каллусами моркови было зафиксировано также и отслоение цитоплазмы у отдельных клеток (рис.15).

Местом локализации авирулентных листерий (без гена hly, кодирующего синтез листериолизина) и L.innocua внутри каллусных клеток являлось межклеточное пространство, за пределы которого проникновение бактерий выявлено не было, что доказывает в данном случае полное отсутствие цитопатогенного воздействия.

В экспериментах (Пушкарева В.И. и др., 2014) по изучению взаимодействия E. coli штамма O157:H7 с каллусами пекинской капусты и листового салата были получены аналогичные результаты. Кишечные палочки проникали в толщу каллусных тканей, а их негативное воздействие было подтверждено с помощью ПЦР, с парой синтетических праймеров, направляющими амплификацию фрагмента гена шига-токсина 1 (stx1). Анализируя отдельные микроснимки срезов каллусных тканей, можно заметить, что некоторые клетки каллусов в ответ на действие бактерий (как псевдомонад (Овод А.А., Годова Г.В., Калашникова Е.А., 2018), так и листерий (Пушкарева В.И. и др., 2013) формировали электронно-плотные участки цитоплазмы, по-видимому, за счет синтеза веществ липидной и/или фенольной природы в ответ на стрессовое воздействие, возникающее при взаимодействии с «чужеродными» организмами.

Защитная реакция каллусных клеток при проникновении в них псевдомонад заключалась в синтезе фенольных соединений, образуемых растительными клетками в стрессовых ситуациях, в данном случае при вторжении Ps. aeruginosa и Ps.fluorescens.

Изучение суммарного содержания растворимых форм фенольных соединений проводилось в той же динамике, что и при определении численности высеваемых из каллусов бактерий (Овод А.А., Годова Г.В., Калашникова Е.А., 2018).

Экспериментальное определение фенольных комплексов, образующихся в результате взаимодействия растительных клеток с псевдомонадами, выявило их наличие во всех вариантах опыта, причем, максимальное их количество наблюдалось в каллусах базилика. При взаимодействии синегнойной палочки с данным растением концентрация фенолов на протяжении периода наблюдений возрастала и достигала максимума на 7-и сутки после заражения, что превышало содержание в контроле (каллусы базилика без заражения) в 2,5 раза (рис. 16).

При взаимодействии Ps.aeruginosa с каллусами листового салата содержание фенольных соединений также возрастало в течение недели до 32 мг/г сырой массы, что больше чем их концентрация в контрольных образцах в 2,7 раза (рис. 16).

Таким образом, можно заключить, что с увеличением стрессовой нагрузки в виде вторжения в каллусные клетки условно-патогенных псевдомонад, «модельные растения» запускали защитные механизмы синтеза вторичных метаболитов – фенольных соединений.

Стоит отметить, что колебание в содержании веществ фенольной природы в контрольных образцах было незначительным и лежало в пределах ошибки метода измерений.

Содержание фенольных соединений в каллусах листового салата и базилика, инфицированных Ps.fluorescens в течение недели практически не изменялось, что говорит о том, каллусные клетки находились в нормальном состоянии и не подвергались каким-либо отрицательным воздействиям со стороны бактерий (рис. 16).

При анализе полученных данных была обнаружена обратная пропорциональная зависимость между численностью высеваемых бактерий и содержанием в каллусах базилика фенольных соединений, о чем свидетельствует значение коэффициента корреляции (табл.13).

Изучение влияния регуляторов роста и развития растений на функционирование исследуемых фитобактериальных ассоциаций в условиях in vitro

Исследования проникновения бактерий в растительные клетки с выявленным цитотоксическим воздействием на них, распространение бактерий по органам и тканям растений, увеличение численности и сохранение вирулентности бактериями в зеленных культурах привели нас к попытке выработать профилактические меры борьбы с инфекционными агентами, чтобы снизить возможный риск распространения инфекций.

При постановке данного опыта предполагалось установить уровень воздействия регуляторов роста и развития растений (РРР): салициловой кислоты (0,69 мг/л) и Черказа (75,0 мг/л) на инфицированные псевдомонадами растения. Данные препараты были выбраны нами для проведения экспериментов исходя из эффективности и направленного действия защитных свойств. Салициловая кислота биологический природный регулятор численности патогенных микроорганизмов, вызывающий коагуляцию белков в их протоплазме, подающий сигнал в растении для запуска каскада иммунных реакций. Черказ – перспективный кремнийорганический биостимулятор группы этилсилатранов, повышающий синтез фитогормонов в клетках растений, обладающий высокой биологической активностью, а благодаря наличию кремния, увеличивающий сопротивляемость растений к биотическим факторам воздействия, укрепляя стенки эпидермальных клеток. Для этого в экспериментах была определена динамика численности Ps. aeruginosa и Ps. fluorescens в ассоциации с листовым салатом и базиликом при обработке их семян РРР (салициловой кислотой (СК) и Черказом) на протяжении 13 суток после заражения. Для оценки эффективности препаратов были определены биометрические показатели изучаемых растений: длина и масса вегетативной части.

Динамика численности бактерий Ps.aeruginosa и Ps.fluorescens в ассоциации с листовым салатом без обработки РРР на протяжении всего опыта возрастала и достигла своего максимума – 108 и 107 КОЕ/г соответственно на 13 сутки после заражения, что согласовывалось с данными по предыдущему эксперименту с использованием растений in vitro.

При обработке семян листового салата салициловой кислотой количество высеваемых бактерий Ps.aeruginosa в ходе эксперимента изменялось несущественно и составляло около 106 КОЕ/г, что соответствовало количеству условно-патогенных псевдомонад, высеваемых в варианте опыта без обработки РРР. Взаимодействие Ps.fluorescens c растениями листового салата, обработанного салициловой кислотой также выявило наличие бактерий на 3 сутки после заражения в количестве примерно 105 КОЕ/г, численность которых к завершению опыта снижалась до 104 КОЕ/г (рис.39). Анализируя полученные данные, можно заметить, что обработка семян листового салата салициловой кислотой способна снижать численность изучаемых псевдомонад незначительно, а ее антимикробное действие проявляется лишь на вторую неделю наблюдений.

При обработке семян листового салата препаратом Черказ снижение численности синегнойной палочки отмечалось уже на 3-и сутки после заражения до 104 КОЕ/г, что в 100 раз меньше по сравнению с вариантами «Листовой салат + Ps.aeruginosa» и «Листовой салат + Ps.aeruginosa + СК». Далее через каждые 2-3 дня количество бактерий уменьшалось в 10 раз, пока не достигло нулевой отметки. Интересно отметить, что используемый препарат не только сократил проникновение условно-патогенных псевдомонад в растения (на 25,7 %), но и, возможно, усилил защитные функции растений, способствуя сокращению численности изучаемых бактерий. При взаимодействии бактерий Ps.fluorescens с растениями листового салата с применением Черказа, исследуемые бактерии не высевались в течение всего периода наблюдений (совпадение линии варианта на графике (рис.39) с осью абсцисс), что говорит о способности кремнийорганического препарата снижать проникновение сапротрофных бактерий до 100%.

Сокультивирование бактерий Ps.aeruginosa c растениями базилика без обработки РРР выявило увеличение численности микроорганизмов в течение двух недель в 100 раз: от 105 до107 КОЕ/г. Динамика численности Ps. fluorescens в ассоциации с базиликом без применения РРР развивалась по типу параболической кривой, сначала характеризуясь значительным ростом количества клеток бактерий примерно до 107 КОЕ/г, а после наступления второй недели наблюдений - его снижением до 103 КОЕ/г (рис.40). Полученные данные свидетельствуют о проявлении защитных свойств базилика по отношению лишь к сапротрофным бактериям.

Обработка салициловой кислотой семян базилика, инфицированного синегнойной палочкой, позволила добиться сокращения числа проникающих бактерий в растения в 10 раз по сравнению с вариантом без использования препаратов. Впоследствии численность условно-патогенных псевдомонад стремительно сокращалась до нулевой отметки. Вариант опыта «Базилик + Ps.fluorescens + СК» также показал снижение количества высеваемых бактерий, но в отличие от варианта с Ps.aeruginosa, оно происходило на протяжении всего опыта и завершалось полным отсутствием псевдомонад в исследуемых посевах на 10 сутки после заражения (рис.40). Видимо, действие салициловой кислоты способствовало усилению защитных механизмов самого базилика, что проявлялось в снижении численности высеваемых бактерий.

Использование Черказа показало максимальную эффективность по снижению проникновения изучаемых бактерий в растения базилика. Так, количество проникающих Ps.aeruginosa снизилось на 71,8 %, а Ps.fluorescens – на 100 %. Несмотря на то, что в начале эксперимента все еще обнаруживалось небольшое число клеток условно-патогенных псевдомонад, их количество уже на первой неделе резко уменьшалось, благодаря действию препарата, стимулирующего защитные механизмы, становилось равным 0 (рис.40).

При высевах из контрольных и обработанных РРР растениях листового салата и базилика, не подвергавшихся инфицированию псевдомонадами, искомые бактерии отмечены не были.

Методы идентификации высеваемых из инфицированных растений бактерий подтвердили их родовую и видовую принадлежность к используемым для заражения псевдомонадам. Изменений в морфологических и биохимических особенностях бактерий в ходе эксперимента отмечено не было.

Для оценки влияния изучаемых бактерий, а также эффективности используемых препаратов на зеленные культуры в экспериментах параллельно определялись биометрические показатели растений в той же динамике, что и при определении численности высеваемых бактерий.

Использование регуляторов роста и развития растений способствовало увеличению длины листового салата (без заражения бактериями) по сравнению с контролем: салициловая кислота стимулировала его рост на 16,1 %, а Черказ – на 36,4 %. Рост растений в течение периода наблюдений был равномерным (рис.41).

Инфицирование растений листового салата бактериями Ps.aeruginosa без обработки РРР постепенно снижало длину растений на 13,6 % по сравнению с контролем, вследствие их полегания из-за токсического воздействия условно-патогенных псевдомонад. Взаимодействие листового салата без обработки РРР с бактериями Ps.fluorescens не выявило внешних изменений в развитии исследуемых растений. Длина растений в течение опыта возрастала и незначительно уступала контрольному варианту (рис.41).