Введение к работе
Актуальность темы. Микроорганизмы, способные использовать восстановленные одноуглеродные (С1) соединения в качестве единственного источника углерода и энергии, давно привлекают внимание ученых. Это обьясняется как научным, так и практическим интересом. Представляющие собой таксономически неоднородную группу, эти микроорганизмы обладают рядом преимуществ по сравнению с гетеротрофа-ми. Главным образом это - непатогенность, способность расти на простых средах, используя относительно дешевые субстраты ( метан, метанол), прекрасные ростовые характеристики и качество биомассы. Другой важный аспект применения метилотрофов в промышленности связан с их способностью осуществлять биотрансформации. Наконец, ме-тилотрофы могут служить основой для создания генноинженерных штаммов-продуцентов аминокислот, витаминов, а также гетерологичных белков.
Регуляция синтеза ферментов, участвующих в ассимиляции аммония ранее была изучена у многих бактерий как в стационарных условиях роста, так и при хемостатном культивировании. Среди них есть и работы, посвященные факультативным метилотрофам Hyphomicrobium ZV620 [58], Hyphomicrobium X [47], а так же метилотрофным дрожжам Hansenula polymorpha [48]. Однако до настоящего времени отсутствуют сведения о регуляции ассимиляции аммония у облигатных метилотрофов в условиях хемостатного культивирования. Отсутствует также информация о динамике экспрессии ферментов в переходных условиях роста, которые гораздо чаще встречаются как в природных условиях, так и в периодических и накопительных культурах. Использование переходных условий роста в хемостатной культуре может дать ценную информацию о регуляции ключевых ферментов при изменении внешних условий. К настоящему времени имеются данные по очистке и изучению свойств глутаматдегидрогеназ (GDH) из облигатного метилотрофа Methylophilus methanolovorus [9] и двух факультативных метилотрофов Methylobacterium extorquens AMI [18] и Hyphomicrobium X [46]. Отсутствие достаточной информации о свойствах GDH для метилотрофов, реализующих гексулозофосфатный путь ассимиляции С1 -соединений является существенным пробелом.
Ферменты цикла трикарбоновых кислот у метилотрофов также изучены недостаточно. К настоящему времени показана определенная корреляция между путями ассимиляции С1-соединений и уровнями активности ферментов ЦТК [35. 36, 83, 114].
- г -
Сведения об очистке и изучении свойств цитратсинтазы (CS) и НАД и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ (ICDH) отсутствуют в литературе. Некоторые данные по регуляции этих ферментов получены при использовании бесклеточных экстрактов или частично очищенных препаратов ферментов [15, 37, 96, 97]. Для облигатных метилотрофов до сих пор отсутствует сведения о регуляции НАД и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ (за исключением Pseudomonas W6), не было сделано попытки установить, принадлежат ли активности с двумя кофакторами разным изоферментам, либо это свойство фермента с двойной специфичностью. Эти данные были бы очень полезны для понимания механизмов регуляции ассимиляции аммония, поскольку в случае облигатных метилотрофов ЦТК разомкнут на уровне оксоглутаратдегидроге-назы и выполняет исключительно биосинтетическую функцию, обеспечивая 2-оксоглутаратом глутаматдегидрогеназную реакцию.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение физиологии и биохимии ассимиляции аммония у М. flagellatum. Для осуществления поставленной цели решали следующие задачи:
изучение регуляции ассимиляции аммония в условиях непрерывного культивирования в условиях хемостата;
изучение регуляции ассимиляции аммония в переходных условиях культивирования;
выделение, очистку и изучение свойств НАДФ-зависимой глутаматде-гидрогеназы из М. flagellatum;
выделение, очистку и изучение свойств НАД(Ф)-зависимой изоцит-ратдегидрогеназы из М. flagellatum;
выделение, очистку и изучение свойств цитратсинтазы из М. flagellatum.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые у обли-гатного метилотрофа изучена физиология ассимиляции аммония в условиях непрерывного культивирования в хемостате, а также в переходных условиях культивирования. Показано, что у M.flagellatum имеются две системы утилизации аммония. Ключевым ферментом ассимиляции аммония у M.flagellatum является НАДФ-зависимая глутаматдегид-рогеназа. Утилизация аммония путем прямого восстановительного ами-нирования 2-оксоглутарата с помощью глутама'тдегидрогеназы происхо-
дит как при избытке аммония, так и при его лимитировании. Ферменты глутаматного цикла (глутаминсинтетаза и глутаматсинтаза) имеют наибольшие значения активностей и принимают участие в утилизации аммония при медленной скорости роста культуры в условиях лимитирования по азоту. НАД(Ф)-зависимая изоцитратдегидрогеназа регулируется аммонием координирование с глутаматдегидрогеназой.
Выделен и охарактеризован ключевой фермент ассимиляции аммония -НАДФ-зависимая глутаматдегидрогеназа. Показано, что фермент не регулируется на метаболическом уровне.
Впервые из метилотрофа выделена и охарактеризована НАД(Ф)-за-висимая изоцитратдегидрогеназа. Показано, что фермент не регулируется промежуточными метаболитами и только НАДФ-зависимая активность ингибируется АТФ.
Впервые из метилотрофа выделена и охарактеризована цитратсинта-за. Показано, что фермент не регулируется по типу отрицательной обратной связи и ингибируется АТФ.
Полученные в настоящей работе результаты позволили предложить схему, предполагающую, что скорость ассимиляции аммония определяется на начальных этапах окисления метанола и распределения потоков формальдегида на ассимиляцию и прямое окисление.
Полученные результаты по регуляции ассимиляции аммония у обли-гатного метилотрофа М. flaellatum имеют важное значение для получения штаммов-продуцентов биологически-активных веществ (например аминокислот) с улучшенными технологическими параметрами.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разд лов: введение, материалы и методы, результаты и обсуждение (10 глав), выводы, список литературы (116 наименований); и содержит 30 рисунков и 8 таблиц. Обьем работы - 103 с.