Введение к работе
Актуальность проблемы. В последнее время появляется все больше технологий, использующих штаммы различных видов микроорганизмов с рекомбинантными ДНК в качестве продуцентов таких биологически активных веществ (ВАВ), как ферменты, гормоны, интерфероны, инсулин, антигени бактерий и вирусов и др. ( В. Аоек , 1993; А.А.Воробьев, 1993).
Применение методов генной инженерии при конструировании . промышленных штаммов микробов-продуцентов позволяет получать большие количества высокоактивных препаратов ВАВ, что невозможно при традиционных способах их производства. Создание высокопродуктивных штаммов генно-инженерных микробов (ГИМ) привело к накоплении в лабораториях, на биотехнологических производствах значительных количеств микроорганизмов с искусственно измененным геномом.
Биологические свойства промышленных штаммов ГИМ изучаются лишь с целью оптимизации технологических процессов получения ВАВ. Вопроси безопасности использования этих ГИМ на производстве часто отходят на второй план. Наименее изучена биология штаммов ГИМ, продуцирующих не свойственные бактериям продукты, в частности, оукарио-тические белки (В.Г.Дебабов, 1992; А.А.Воробьев и соавт., 198?). Несовершенство технологических процессов делает возможным попадание ГИМ-продуцентов по внешнюю среду, что приводит к повышении степени микробной загрязненности рабочей зоны (И.З.Зельцер, Г99І; A.M. Bennett , 1992) и достоверному трехкратному росту числа дис-биозов, гнойно-воспалительных и аллергических заболеваний среди работников биотехнологических производств (И.И.Прохорова, 1991).
Часто продуценты конструируются на основе условно-патогенных бактерий: baclttui subtltis ДнЬеПсМо. cott,Pst,4 в состав нормальной микрофлоры человека. Наиболее изученной в генетическом и биологическом отношении, доступной для культивирования и идентификации считается кишечная палочка, на основе которой уже получены высокопродуктивные штаммы для производства инсулина, интер феронов, вирусных антигенов и др. Этот микроорганизм широко распространен в природных биоценозах, в т.ч. в организме человека, способен к адаптации при изменяющихся внешних условиях и к приобретению в результате генетических рекомбинаций и/или мутаций новых признаков, повышающих его вирулентность и устойчивость в окружающей среде (В.Г.Дебабрв, 1992; Л.Ю.Попова и'соавт., 1993; MtAtfaS и соавт., 1992). Осложнение экологической обстановки во всем мире под влиянием антропогенных факторов обострило интерес к проблеме безопасности биотехнологических производств (А.Ф.Гирич'и соавт., 1993; З.Е.Ъе-гЫагг » 1992; Ц CtfumpAetvo . 1992). Однако, до настоящего времени не существует стандартной методики для адекватной оценки экологической опасности, а также методов мониторинга и идентификации штаммов ГШ, в т.ч. созданных на основе E.coli и продуцирующих эу-кариотические белки. Не исследована также степень влияния целенаправленных изменений генома на комплекс биологических свойств таких ГШ-продуцентов. Цель и задачи исследования: провести сравнительное изучение биологических свойств исходных и рекомбинантных штаммов E.coli -продуцентов оценить степень биологической опасности и адаптационных воз можностей этих микроорганизмов при воздействии различных факторов внешней среды. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи в - о - отношении штаммов E.colt -продуцентов Л-интс.рферонов: Определение морфологических, тинкториальных свойств, оценка культуралькых особенностей и динамики роста и размножения на питательных средах; определение спектра ферментативной активности; изучение антигенной структуры. Определение чувствительности к различным типам колицинов. Изучение биологических свойств, обусловливающих пагоген-ность (адгезивной способности, гемолитической активности, токсичности, токсигенности). Оценка вирулентности в отношении восприимчивых животных в зависимости от способов заражения. Выявление характера диссеминации во внутренних органах экспериментальных животных при различных способах заражения^ скорости элиминации из организма. Оценка влияния факторов внешней среды (температуры, кислотности и состава питательной среды, степени аэрации, антибактериальных химиопрепаратов, антисептиков и дезинфектантов) на динамику роста и размножения штаммов, а также на постоянство биологических признаков и стабильность внедренных плазмид. Научная новизна. Настоящее исследование существенно дополняет сведения о биологических свойствах рекомбинантных штаммов Е.соИ -продуцентов А -интерферонов. Охарактеризовано таксономическое положение данных рекомбинантных штаммов, выявлено соответствие их биологических свойств признакам, присущим виду Escherichia cott . На основании результатов проведенных исследований получена возможность оценить степень биологической опасности при работе с данными микробами-продуцентами. Изучены вирулентность данных штаммов и основные биологические свойства, ее определяющие. Исследован характер диссеминации Е.соИ -продуцентов Л-интерферонов в организ- - ІІ - ые экспериментальных животных. Установлены способы воздействия на эти микроорганизмы с помощью антибактериальных хишоярепаратов, антисептиков и дезинфектантов. Выявлена множественная лекарственная резистентность у продуцентов Л.-интерферона-Xj. Изучены адаптационные возможности штаммов E.coli , продуцирующих «L -интерферо-ны, при изменении параметров различных факторов внешней среды. Ilpej дожено использование дифференциально-диагностических сред с антибиотиками для определения стабильности плазмида. Практическая значимость. Достоверно подтвервдекная принадлежность исследованных штаммов E.colt -продуцентов «С -ингерферонов к виду СОІІ по совокупности ключевых биологических свойств, а также наличие стабильных генетических маркеров позволяет использовать эти признаки для идентификации данных иташов на всех этапах технологического цикла и в случае их попадания во вдек нюю среду. Выявленные низкие адаптационные способности данных продуцентов и слабая вирулентность позволяют установить Ш-ІУ класс опасности при работе с этими .микробами. Определение спектра чувствительности данных штаммов-продуцентов к антибактериальным препаратам позволяет выработать меры воздействия на эти ыикробы в соответствии с их индивидуальной чувствительностью. Показана опасност: использования антибиотикорезистентности в качестве генетического маркера. Подтвервдена целесообразность расширения стандартной методики исследования генетически измененных микроорганизмов-продуцентов при решении вопроса о внедрении их в производство. Материалы настоящего исследования используются при чтении лекций по экологической микробиологии и проведении занятий на ка федре микробиологии, вирусологии и иммунологии им. И.М.Сеченова. Апробация. Основные положения диссертационной работы были дс ложены: на У Объединенном съезде гигиенистов, эпидемиологов, мик| - 7~ биологов, паразитологов и инфекционистов Казахстана (г.Алма-Ата, 1991 г.), на У1 Всероссийском съезде микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (г„ Нижний Новгород, 1991 г.), на конференции (" bloteckaoCo^i-u. rnetttcinCC' (г, Гвардалахара, Мексика, 1994 г.), на ХХУ Национальном микробиологическом конгрессе (Мексика, 1994г., г.Обрегон), на научной конференции молодых ученых России, посекщєн-ной 50-летию АМН (г.Москва, 1994 г.), на научной конференции кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ММА им. И.М.Сечено-за (29 марта 1993 г.). Публикации. По теме диссертация опубликовано б работ. Структура и объем работы. Диссертация изложена на Ч?0. страницах машинописного текста, включая № таблиц, РА рисунков и содержит следующие раздели: введение, обзор литературы, материалы и методы, 5 глав с результатами собственных.исследований, обсуждение полученных результатов, вывода. Список использованной литературы содержит 2SA источника, в том числе 160 , опубликованных на иностранных языках.