Введение к работе
Актуальность проблемы. Молликуты — наименьшие свободно-живущие прокариотические организмы, многие из которых являются возбудителями заболеваний человека, животных и растений. В связи с растущей резистентностью патогенных видов молликутов к действию антибиотиков все более актуальным становится поиск принципиально новых биологически активных соединений, способных эффективно подавлять их жизнедеятельность. Так как молликуты имеют самый малый среди самореплицирующихся организмов размер генома и все наборы генов, необходимых для нормального функционирования клетки, представлены у них чаще всего в одной копии, то это указывает на возможность использования уникальных свойств не только их генома, но и рибонуклеиновых кислот для разработки новых, с четко определенной мишенью средств подавления жизнедеятельности этих микроорганизмов. Учитывая такие особенности молликутов, как отсутствие клеточной стенки и механизма синтеза предшественников нуклеиновых кислот, источники которых являются экзогенными, одним из перспективных направлений в создании средств, способных избирательно подавлять жизнедеятельность этих микроорганизмов может явиться применение препаратов на основе антиСмысловых олигонуклеотидов.
Мы полагаем, что одним из объектов для атаки в клетках 'молликутов ген-направленными биологически активными веществами могут служить уникальные, характерные только для отдельных групп организмов нуклеотидные последовательности в составе их 16S рРНК, так называемые "сигнатурные" участки (Woese et al., 1980).
Цель и задачи исследований. Основная цель настоящей работы состояла в получении доказательств возможности контролирования жизнедеятельности молликутов с помощью олигодезоксирибонуклео-тидов и их аналогов, которые являются комплементарными к сигна-
турным участкам 16S рРНК данных микроорганизмов (в дальнейшем мы их будем называть антисигнатурными).
Для выполнения работы необходимо было решить такие задачи:
1. Провести сравнительное изучение связывания и поглощения
клетками молликутов разнообразных антисигнатурных олигодезокси
рибонуклеотидов и их аналогов.
2. Обеспечить стабильность олигодезоксирибонуклеотидов в
процессе их взаимодействия с клетками молликутов;
3. Разработать методы детекции внутриклеточной интернализа-
ции олигонуклеотидов и их производных.
4. Изучить воздействие антисигнатурных олигодезоксирибо
нуклеотидов и их аналогов на жизнедеятельность клеток молликутов.
Научная новизна работы. Впервые получены экспериментальные доказательства активного поглощения коротких (длиной до 15 нуклео-тидных оснований) олигодезоксирибонуклеотидов и их тиоаналогов клетками молликутов.
Установлено, что модификации олигонуклеотидов по меж-нуклеотидным фосфатам обеспечивает полную резистентность к расщеплению нуклеазами молликутов.
Впервые осуществлено эффективное угнетение биосинтеза белка в клетках молликутов тиофосфатными аналогами олигонуклеотидов, комплементарными к сигнатурным участкам 16S рРНК этих микроорганизмов. Показана высокая видовая специфичность антисигнатурных олигонуклеотидов и их тиоаналогов в подавлении процесса трансляции у молликутов. Обнаружен эффект аддитивности действия при одновременном использовании двух олигонуклеотидов, комплементарных к примыкающим участкам 16S рРНК.
Предлагается модель механизма подавления жизнедеятельности молликутов антисигнатурными олигонуклеотидами.
Практическое значение работы. Результаты исследований утверждают перспективность применения антисмысловой технологии, основанной на использовании антисигнатурных олигонуклеотидов в целях контроля жизнедеятельности молликутов путем направленного воздействия на их нуклеиновые кислоты и создают основания для расширения фронта и интенсификации работ в этом направлении. Разработкой ген-направленных биологически-активных соединений на основе антисигнатурных олигонуклеотидов инициируется развитие нового направления генной терапии для лечения заболеваний, вызываемых разнообразными микроорганизмами.
Конкретное личное участие автора в полученных результатах. Работа выполнена лично автором под руководством член-корр. НАНУ, д. б. н., профессора И. Г. Скрипаля. Культивирование клеток молликутов осуществляли совместно с к. б. н. Л. П. Малиновской. Синтез ал-килирующих производных олигодезоксирибонуклеотидов проводился в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН к. х. н. Е. М. Ивановой и к. х. н. Н. В. Амирхановьш. Синтез тиоаналогов олигонуклеотидов был выполнен в Институте биоорганической и нефтехимии НАН Украины к. х. н. И. Я. Дубеем, к. х. н. Д. М. Федоря-ком и в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН к. х. н. Н. В. Амирхановьш.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на конференции-конкурсе экспериментальных работ молодых ученых Института микробиологии и вирусологии НАН Украины (1990, 1991, 1992), ежегодной научной конференции-конкурсе работ Института микробиологии и вирусологии НАН Украины (1991, 1993, 1995, 1996), на IX Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканию лекарственных веществ (Рига, 1991), на Всесоюзной школе-конференции "Физиология, биохимия и генетика микроорганизмов —
фундаментальная основа биотехнологии" (Алушта, 1991), на II Международной конференции "СПИД, рак и ретровирусы человека" (Санкт-Петербург, 1993), на I Учредительном /VIII/ съезде Украинского микробиологического общества (Одесса, 1993), на I Национальной научно-практической конференции по проблемам ВИЧ/СПИДу с международным участием (Киев, 1995), на III Международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-Петербург, 1995).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (2 главы), заключения, выводов и списка цитированной литературы, который включает 245 наименований. Работа изложена на 207 страницах машинописного текста, иллюстрирована 55 рисунками и 11 таблицами.