Введение к работе
Актуальность проблемы. Образование активных форм кислорода (АФК) в юцессе нормального аэробного метаболизма клеток всех типов и широкий спектр изиологичсских эффектов АФК объясняют неослабевающий интерес к ;естороннему изучению их действия на живые организмы. Встреча внутри зганизма хозяина с макрофагами - еще одна ситуация, в которой бактерии эдвергаются воздействию активных форм кислорода. Установлено, что АФК <азывают на клетки всех тапов токсическое и мутагенное действие, вызывая шслительные повреждения ДНК, белков и мембранных липидов (Farr, Kogoma, )91). С окислительным стрессом связываются такие важные процессы как гарение, апоптоз, мутагенез и иммунитет (Дильман, 1986; Halliwell, Gutteridge, ?90, Пескин, Столяров, 1994; Hochman, 1997).
Бактерии Escherichia coli, как и другие энтеробакгерии, обладают несколькими ^стемами защиты от окислительного повреждения, вызываемого декс-^ием АФК. ак, в ответ на обработку перекисью водорода у Е. coli индуцируется синтез около 3 белков, включая каталазу-гидропероксидазу HPI, которая является активным гструктором Н2О2 (Christman etal, 1985).
Среди нерешенных вопросов, связанных с ответом бактерий па окислительный фесе, и в частности, на действие Н2О2, остается неясной роль глутатиона. лутатион является главным низкомолекулярным , тиолом у многих замотрицательных бактерий, включая Е. coli (Fahey et al, 1978). По сравнению с ругими бактериями клетки Е. coli примечательны тем, что содержат около 10 мМ тутатиона, что близко к уровню, наблюдаемому в клетках животные (Kosower, osower, 1978; Romero, Canada, 1991). Известно, что в клетках животных глутатион зляется важным компонентом клеточной защиты от окислительного повреждения, ызываемого Н2О2, и обработка клеток этим оксвдантом сопровождается снижением ровня восстановленного глутатиона (GSH) и его окислением (Meister, Anderson, 983). Для бактерий данные о роли глутатиона в защите от действия АФК менее
определенны. Так, было сообщено, что мутантьГ. coli, дефицитные по синте глутатиона, проявляют такую же устойчивость к действию Н2О2 и некотор! друтим оксидантам, как и клетки родительского типа (Apontoweil, Berends, 197: Owens, Hartman, 1986). Более того, в некоторых ситуациях такие мутанты проявля даже большую устойчивость к действию Н2О2, чем клетки дикого типа (Imlay, Lii 1987). Было обнаружено также, что обработка перекисью водорода не влияет уровень глутатиона у Е. coli (Greenberg, Demple, 1986) или даже приводит увеличению его уровня (Smirnova, Oktyabrsky, 1994).
В то же время рядом авторов сообщалось, что клетки Е. coli, лишенн каталазы, имеют такую же чувствительность к обработке Н2О2, как и клетки дикс типа (Greenberg, Demple, 1986). Таким образом, сложилась парадоксальг ситуация, при которой для защиты Е. coli от действия Н2О2 оказывается не нужн ни одна из главных антиоксидантных систем клетки. В совокупности анаг научной литературы показывает, что данные о роли глутатиона в ответе бактер ' Е. coli на окислительный стресс немногочисленны и носят противоречив: характер. В этой связи выяснение роли глутатиона во время окислительного стрес и механизмов взаимодействия двух антиоксидантных систем крталазы глутатиона, является актуальной задачей.
Основная цель настоящего исследования - изучение роли глутатиона отклике бактерий Е. coli на окислительный стресс, вызванный обработкой растут клеток различными оксидантами.
Основные задачи:
-
Изучить действие перекиси водорода и генератора О2' менадиона на таї параметры растущих клеток Е. coli, как удельная скорость роста, внутриклеточн уровни тиолов и калия, а также редокс-статус глутатиона.
-
Сравнить уровень устойчивости клеток Е. coli, дефицитных по синтс глутатиона и клеток с нормальным уровнем глутатиона к окислительному стрес вызванному обработкой бактерий Н2О2, менадионом, кумеи гидропероксидом
' также сульфгидрильиым реагентом N-этилмалеимидом (NEM).
3. Исследовать влияние каталазы HPI на уровни низкомолекулярных тиолов и
шия при действии Н2О2 и менадиона на клетки Е. coli.
4, Провести сравнительное исследование действия проникающего (Н2О2) и
^проникающего (К4[Fe(CN)б]) оксидантов на растущие клетки Е. coli.
Научная новизна и практическое значение. Показано, что обработка 1стущих клеток Е. coli дикого типа низкими и умеренными дозами Н2О2 не ызывает снижения уровня непротеиновых тиолов. Обнаружена обратная связь ежду количеством SH-групп в белках и уровнями низкомолекулярных тиолов -IMT) и калия при действии низкими и умеренными дозами Н2О2.
Исследовано действие Н2О2 и менадиона на уровень и редокс-статус глутатиона клетках Е. coli. Обработка Н2О2 не влияет на уровень общего глутатиона, в то ремя как уровень окисленного глутатиона значительно снижается, следствием чего вляется повышение редокс-статуса глутатиона. Обработка клеток Е. coli енадионом вызывает истощение пула общего глутатиона, увеличение содержания кисленного глутатиона и понижение редокс-статуса глутатиона.
, Выявлена взаимосвязь между каталазной активностью и уровнем непро-еиновых тиолов в клетках Е. coli. Показано, что в клетках Е. coli, дефицитных по аталазе HPI, обработка Н2О2 приводит к снижению уровней небелковых тиолов и алия.
Показано, что обработка Е. coli феррицианидом калия приводит к снижению ровня внутриклеточных НМТ; этв изменения уровня НМТ были протавоположны ем, которые наблюдали при обработке клеток перекисью водорода.
Выявленные закономерности между изменениями уровней белковых и ебелковых тиолов и калия дополняют накопленные к настоящему времени данные механизме адаптации клеток Е. coli к окислительному стрессу. Установление едокс-статуса глутатиона во время окислительного стресса не только определяет оль глутатиона как антиоксиданта, но и способствуют более полному пониманию го значения для жизнедеятельности бактерий. Полученные данные о взаимосвязи гежду активностью каталазы и уровнем низкомолекулярных тиолов расширяют [редставления о механизме защиты Е. coli. от окислительного стресса и могут быть
использованы при создании лекарственных препаратов против патогеннь микроорганизмов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Обработка растущих клеток Е. coll дикого типа Н2О2 не влияет на уровеї
НМТ; клетки Е. coli, имеющие низкий уровень глутатиоиа имеют такую я
чувствительность к действию Н2О2, как и клетки с нормальным уровнем глутатион;
-
Существует взаимосвязь между каталазной и глутатионовс антиоксидантными системами: действие Н2О2 на клетки Е. coli, дефицитные i каталазе-гидроиероксидазе I (НРІ), приводит к падению уровня общего глутатиок повышению количества GSSG и снижению соотношения GSH:GSSG; у штаммс дефицитных по синтезу глутатиоиа, заметно возрастает активность каталазы HPI.
-
Каталаза HPI играет доминирующую роль в разложении экзогенш перекиси водорода растущими клетками Е. coll.
А. Роль глутатиоиа в ответе па обработку растущих клеток Е. а непроникающим оксидаїггом феррицианидом отлична от той, которую он играет ответе на действие проникающего оксиданта Н2О2. Полученные данш свидетельствуют в пользу участия глутатиоиа в восстановлении феррициани клетками Е. coli.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были доложи
на молодежной конференции УрО РАН (Екатеринбург, 1996; 1998); Международн
конференции «Микробное биоразнообразие: состояние, стратегия сохранен!
экологические проблемы» (Пермь, 1996); II съезде Биохимического общества Р^
(Пущино, 1997), Международной конференции «Проблемы загрязнен
окружающей среды ІСЕР' 98» (Москва, 1998); Региональной конференции молод
ученых ИЭГМ-ПГУ (Пермь, 1999). По теме диссертации опубликовано 14 печати
работ. ,
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на /-?' страши печатного текста, иллюстрирована 28 рисунками и 6 таблицами; состоит из в: дения, обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, заключения
1водоВ. Список литературы включает 195 наименований работ отечественных и рубежных авторов.
Диссертационная работа выполнена в лаборатории физиологии и генетики ікроорганизмов ИЭГМ УрО РАН и является частью исследований, проводимых по ме 2.28,9.3 «Изучение неспецифнческого отклика и адаптивной реакции бактерий і различные етрессовые еоздейсттия». Тема утверждена Прееидиумом РАН, № госс тисграции 01.9.10055305. Представленные исследования были выполнены при шансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты : 95-04-11182 и 98-04-49053).