Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Загрявнение окружающей среди ксеноГню-тиками является одной из проблем, достигших глобальны* масштабов. Оа>'Сочитающая способность биосферы,' обусловленная лна<;одея":ель--ностью микроорганизмов, испытывает эначиталы-ме1 пер? грудки иъ-ья
КриТИЧеСКИХ КОЛИЧеСТВ СИКТЄТИЧЄСКИХ ВсіІ'рЯаНеїШЛ ПрОМНЛЛсННОГО происхождения, поступающих в природную систему. Одними іій нмиОол-е распространенных загрязнителей являются поьерхностнс-октн'Н'Ы'; ье-щества (ПАВ). Они широко используются более чем в 100 отраслях и подотраслях народного хозяйства и их мировое прошьодотьо -жегодно увеличивается. Около 80 X объема выпускаемых в странах СНГ IJ/.B используются в составе технических и бытовых мовних срздоть и в производстве тканей и волокон (.Клименко Н.А., Тимошенко М.ІІ., 1Я93). Практически все оферк их применения связали с нодоемкпил процессами, что пряводит к попаданию большей части производимых ИЛЬ ь окружающую среду в составе сточных вод. Неудивительно, что ъы ря.-.не-ние ими природы, и в первую очередь водоемов, представляет серьезную проблему, которую сегодня по масштабам модно сравним- голько с загрязнением почвы и воды нефтьы и пестицидами (Статлнл о. с, 1990). Наличие ПАВ в природных оохектач аначит^лью ухудшает их санитарно-гигиеническое состояние и оказывает вредное ьли>гни<> как на человека, так и'на биоценозы водоемов и почвы.
Около 35 Z выпускаемых в мире ПАВ составляют нкаюногеиньк-(ППАВ). Последние представляют собой полигликолевые ифирн жирных спиртов, кислот, адкилфенолов и других веществ, молекулы которых содержат подвижный водород. Одними из самых "жестких", с трудом поддавшихся биорачложению, НПАВ являются оксиэтюшрованпие алкил-фенолы, выпуск которых у нас в стране особенно велик, что связано с доступностью сырья и более ниькой стоимостью производства (Поверхностно- активные вещества .... 1989). Одними и& наиболее вредных свойств ПАВ как загрязнителей окружающей среды являются: новообразование, способность растворять другие малорастворимые н воде ксенобиотики, в частносїи пестициды и нефтепродукты, усиливать токсичность, канцерогенность и кумуляцию в живых организма* других загрязнителей, выраженный аллергенный аффект и другие. Ьес^ма неприятной особенностью ПАВ является способность изолировать ЛР'/ГИе ксенобиотики мицелляриоД пленкой от контакта с водной микріч-дорой и тем самым значительно ухудшать их естественное р&злилеки*'.
Существуют различные способы очистки ПАВ-содержащих сточных вод. объединяемые в два основных типа: физико-химическая и биологическая очистка. Основными критериями оценки различных способов являются эффективность, экологическая безопасность и экономичность. Наиболее распространенным недостатком различных физико-химических методов является -образование шламов - концентратов извлеченных загрязнителей, что означает их недостаточную экологическую безопасность. Биологические методы очистки, основанные на использовании активного ила или биопленки, являются более экологичными, но они предусматривают подачу стоков с низкой концентрацией ПАВ -не Гхзлее 10-20 мг/л - так как, более высокие концентрации являются токсичними для биоценозов очистных сооружений. Одним из наиболее перспективный является метод локальной микробной очистки, удельный вес использования которого в настоящее время в очистке ПАВ-содер-жаліих сточных вод достигает 13 Z как самостоятельно, так и ь комплексе <: физико-химическими методами (Клименко Н.А., Тимошенко М. Н., ИпіЗ). Микробная деструкция І1АВ отличается не только экологической безопасностью, но и значительно более высокой экономичностью и эффективностью по сравнению с другими методами (Гвоздяк П.И., 1989). №вершенстьование биотехнологии микробной очистки от ПАВ, в частности неиоьогенных, связано с получением высокоактивных штаммов-деструкторов, изучением и отработкой условий и приемов их наиболее эффективного использования. Поэтому выделение штаммов-деструкторов НПАВ, изучение микробиологических и биотехнологических аспе,,юв их применения в локальной очистке сточных вод являемся актуальной вадачей.
МЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы явилось совершенствование методов локальной очистки сточных вод от НПАВ на основе выделения и изучения высокоактивных штаммов-деструкторов, моделирования и отработки основных технологических параметров очистки.
Лля ое достижения были решены следующие конкретные задачи:
1) расширение коллекции штаммов-деструкторов НПАВ, изучение \и кулвтуральио-морфологичеоких и Фи?ио.і!ого-С!ЮлнМических характеристик;
?,) исследование рос га, деструктивной активности выделенных штаммов, биохимических цутей рзарувючйя ими различных представителей НПАВ; .
СЧ) от работка способов получения биомассы штаммов-деструкторов
- 5 - ч' и создание биокяталиватопов на основе иммобилизованных клеток;
-
отработка основних технологических параметров процессов очистки модельных и реальных сточных вод;
-
моделирование и оптимизация процессов микробной очистки
CTP'.'.itW вод ОТ НПА8.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Выделены новые высокоактивные штаммы-деструкторы НПАВ: Fseudomonas puMda ТИ-19 (валька N у3039И6 от 30.07.93) с широким субстратным спектром, включающим биологически "жесткие" вещества - оксиэтилированные алкилфенолы ЮЗА1'); Pseudomonas fluorescens ОС-263 - деструктор оксиэтилированных спиртов"и амидов (ОЗС и ОЭА); Pseudomonas species ОС-22 (ьаявка N 93039122 от 30.07.93) - деструктор оксиэтилированных спиртов. Изучены ростовые и деструктивные характеристики нового штамма ТИ-19, биохимические аспекты разрушения ОЗС и ОЭАФ этим штаммом, определены основные оптимальные параметры для моделировании очистки сточных вод конкретных производств.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Дана характеристика деструктивной активности выделенных штаммов по отношению к 28 препаратам не-ионогенных и 2 препаратам анионных ПАВ в концентрациях до 10 г/л. Наиболее активный ытамм P. putida ТП-19 прошел лабораторные испытания на модельных и реальных сточных водах для использования в биотехнологии очистки от НПАВ. Отработаны приемы наработки биомассы штамма, подобраны оптимальные носители для иммобилизации клеток и получены активные биокатализаторы на их основе. Исследована очистка НПАВ-содержащих сточных вод полученными биокатачизаторами. Совдана Оиотехнологическая модель очистки промышленных сточных вод, бесперебойно работающая в течение 3-х лет. Модель апробирована на реальных сточных водах.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были доложены на Всесоюзных и региональных съездах и конференциях (г.Шебекино, 1990; г.Пенза, 1990; г.Таллин, 1991; г.Оренбург, 1991; г.Полтава, 1992; г.Суздаль, 1S92; г.Белгород, 1992; г.Пущина, 1992; г.Киев, 1993). Диссертация апробирована на расширенном заседании кафедр микробиологии и общей гигиены СГМУ (март 1994 г.). Материалы диссертаиии внедрены в работу лабораторий СФ ВНИИ генетики, НИИ сельской гигиены, кафедры микробиологии СМГУ, а также в конструирование установки микробной очистки А/0 НИТИ ТЕСАР.
ПУБЛИКАЦИИ. Но теме исследования опубликовано 10 работ, «моются 2 рационализаторских предложения, поданы заявки на 3 патента.
- Сі - '
ОГК-'КІУРА И ОВЪГМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, 8 'план, ьакдат'ниа, .ьы водов, списка использованной литературы, включающего '120 работ отечественных й 70 ёарубелных авторов, . и содержит 215 страниц машинописного текста, включающего 34 рисунка и 45 таОЛіпі.'
:МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
h ряйотз использованы' .368 штаммов бактерий, ив.которых 364 isv-'іьтурьі ънделенн і« объектен окружающей срелы. Из коллекции СФ ВНИИ генетика были'получены 4 штамма:, штаммгдеструктор НПАВ Pseu-' осйі:,na? putida ТШ-ІіЗ (В-KP50), штамм-деструктор акриловой кислоты к ее производных Brevib'acl.eriUm species 13 ПА (В-4987) й два не-нчеїтіфишїройанньїх шт аммм- Деструктора 'минеральных масел с лабора- : торными шифрами СЯІ-і и Б-03. -.
Микроорганизмы хранили ;ри 4'С на столбиках с 0,6 % агаризо- ванний LB средой с регулярными пересевами через б месяцев.
'В работе'. использованы оледуюшие среды: а) полноценные питательные среды:' мпсо-пептонный агар (МПА), бульон Хоттингера, среда LP; б) минеральная ерзд'а М9 (Миллер Дж., 1976). Кроме того, в экспериментах но выращивания биомассы был использован.ряд сред, содержащих л;''С*невой экстракт, мелассу и глюкозу в различных сочетаниях и;концентрация*.
Ореды с (ШАВ,готовили на МЭ, куда они вносились-до стерилизации в концеіітрацияу, 0',8--10,0 г/л. Ври необходимости среды уплотня^ ли агар-агаром в концентрации 16^-20 г/л.
. Модельные ряствбры сточных вод готовиш на водопроводной воде, с добавлением технических моющих средств (ТМС) и дополнительных промышленных затаїшителей. Растворы не стерилизовали.
Микроорганизмы из объектов внешней среды выделяли путем лря-ш>т* ьысгва к. методом накопительных культур. В первом случае 1 г Г мл) іїроо почвы, поды или активного ила разводили в 10 мл стерильного физиологического раствора и после десятикратных разведений по 0,1 ш наносили на поверхность плотной полноценной среды, равномерно '.распределяя, нанесенный' объем с: помощью стерильного шпателя. В случае применения меттда.накопительных'культур .!>-10 г. (мл) пробы г.носили в 100. ил среды ш, 'соцерхаікеіі ЦПАВ в качестве единственного источника углерода и энергии в.концентрации о,5-і,О г/л. Культуры инкубировали, р-4 подели при; комнатной температуре с периоди-
- у -ческими пересевами и анализом микрофлоры путем висеьов на плотные селективные среды.
Штаммы-деструкторы выявляли с помощью метода Кука (Ccik К.А., 1978), заключающегося в обработке селективных чашек с выросшими микроорганизмами реагентом Драгендорфа.
Идентификация выделенных культур проводилась общепринятыми методами на основании изучения совокупности морфолого- культураль-ннх и физиолого-биохимических признаков (Bergey's, 1986).
Чувствительность микроорганиэмов к антибиотикам определяли методом бумажных дисков.
Динамику развития микробной популяции изучали путем измерения оптической плотности культуральной жидкости на фоточдектроколори-метре КФК-2 при 440 им через определенные промежутки времени в зависимости от цели и продолжительности эксперимента.
Количественные характеристики процесса биодеградации НПАБ получали с помощью колориметрического метода с фосфорно-молибденовой кислотой (Клименко Н.А., Панченко Н.П., ІЯ71).
Деструктивная активность штаммов выражалась в 7. убыли субстрата.
В качестве посевного материала использовали смыь суточной
культуры штаммов с МПА физиологическим раствором или средой, ь ко
торой проводилось дальнейшее культивирование. Посевная доза, то
есть количество клеток в 1 мл среды, определялась по предваритель
но построенной калибровочной кривой, выражающей соотношение коли
чества клеток с оптической плотностью, определяемой на КФК-2 при
440 нм! ,
Культивирование проводили в колбах Эрленмейера при 28'С; посевная дова, кроме особо оговоренных случаев, составляла 0,7 П 440 (5-Ю8 кл/мл).
Были вычислены следующие показатели роста и деструктивной активности культуры-деструктора: 1) абсолютная деструктивная активность (АДА) - убыль субстрата (г/л) за 24 ч; 2) удельная деструктивная активность (УДА) - количество г вещества, разрушенного 1 г посевной дозы по сухому весу аа 24 ч; 3) абсолютный прирост биомассы (АПБ) - максимальное количество биомассы ъ единицах оптической плотности при D 440, образовавшееся за 24 ч; 4) удельный прирост биомассы (:/ТВ) - отношение АП6 к посевной дозе (D 440).
Аэрация при культивировании осуществлялась в зависимости от задач путем кругового перемешивания на качалке УВМТ 12-250 при им,
-8--со/мин или с помощью микрокомпрессора АЭН-3.
Для подачи растворов с заданной скоростью при непрерывном культивировании использовали перистальтический насос НП-1.
Пути микроОной деструкции НПАВ исследовали методами УФ- и ИК-епектроскопии (Скипина И.М., 1987; Frazee. CD., 1964) и 7СХ (Эа-купраВ.А.. 1977; РаНегебп S.J. et al, 1967, 1970). Для записи зЧК- спектров использовали спектрофотометр "Specord IR-75" и кюветы с окнами из монокристалла NaCl с толщиной поглощающего слоя 1,0 мм. Запись спектров проводили в. диапазоне 4000 - 800 см"1.
Разрушение ароматического . кольца в молекуле ОЭАФ исследовалось методами ИК- и УФ- спектроскопии. В последнем случае оценивали изменение поглощения хлороформенного экстракта культуральной жидкости при ?.50-290 нм на спектрофотометре "Specord М40".
Исследования по наработке оиомассы штамма-деструктора НПАВ проводили на ферментере АК-203 при автоматическом поддержании еа-даннкх параметров культивирования и т записи на самопишущем потенциометре КСП-4. ' В течение ферментирования прирост биомассы определяли по оптической плотности культуральной жидкости, а после окончания процесса по сырому весу.
Иммооилиаацию клеток штаммов-деструкторов НПАВ включением в поли-чкриламидный (ПАА) гель проводили общепринятым методом (Иммо-Оилиуованные клетки .... 1988), в агаровый и фурцелларановый гели способами, разработанными специально для клеток микроорганизмов -деструкторов ксенобиотиков. (А.е.- 1705345; А.с. 1742330). Биоката-лизауор на основе криогеля поливинилового спирта (ПВО был получен в институте пищевых веществ АН СССР (г.Москва) по методу Е.И.Рай-тщой (1987). Приемы иммобилизации клеток »л волокнистых носителях и природном цеолите разрабатывались в процессе работы. В качестве годокнистых носителей использовали ацетатное волокно и нетканое -имготическое полотно, а такд-е специальную волокнистую насадку "ДОГ; разработанную в ИКХХВ АН УССР (ТУ 995990).
Моделирование процессов микроОной очистки проводилось на ла-'r.[',H'tfipni;x очистных установках оригинальной конструкции,"
'еяультатн акспкримеи'гоя .гЛраГтзны.,статистически о ггоимене-чіки ігг'!Т'і<-р('Я Сть^Д'.нта ! ,'орлон А.-,.-«Ърд Р. , ,1976).