Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Бактерии рода Azospirillum как объект исследования 13
1.2 Роль белковых структур бактериальной поверхности в установлении растительно-микробных ассоциаций 17
1.2.1 Строение бактериальных жгутиков 18
1.2.2 Особенности жгутикования азоспирилл 21
1.2.3 Бактериальные флагеллины в качестве элиситоров, индуцирующих защитные реакции растений 23
1.2.4 Разнообразие бактериальных пилей 27
1.2.5 Пилеподобные структуры азоспирил 33
1.3 Изменения бактериальной поверхности азоспирилл под влиянием различных стимулов 34
1.4 Биоинформатический анализ в биологических исследованиях 36
Глава 2. Материалы и методы 43
2.1 Бактериальные штаммы и условия культивирования микроорганизмов 43
2.2 Иммунизация животных и получение антител 43
2.2.1 Иммунизация животных целыми бактериальными клетками A. brasilense SK048 43
2.2.2 Иммунизация животных мономерами флагеллина полярного жгутика A. brasilense Sp245 44
2.2.3 Получение антител 44
2.2.4 Использованные антитела 45
2.3 Реакция агглютинации 45
2.4 Препараты наружных мембран бактериальных клеток 46
2.5 Двойная иммунодиффузия 46
2.6 Линейный иммуноэлектрофорез 47
2.7 Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле и иммуноблотинг 47
2.8 Дот-анализ 48
2.9 Получение коньюгатов антител с коллоидным золотом 48
2.10 Изучение особенностей фронта распространения азоспирилл в среде, содержащей витальный краситель конго красный и ИК-спектроскопия препаратов наружных бактериальных мембран 49
2.11 Контрастирование бактериальных препаратов 49
2.12 Иммуноэлектронная микроскопия 50
2.13 Выделение флагеллина полярного жгутика 50
2.14 Обработка растений препаратом флагеллина полярного жгутика 51
2.15 Определение митотического индекса меристематических клеток 52
2.16 Статистическая обработка результатов 52
2.17 Молекулярное моделирование по шаблону 53
Глава 3. Полученные результаты и обсуждение 54
3.1 Исследование поверхностных белковых антигенов бактерий Azospirillum brasilense 54
3.1.1 Выявление детерминант флагеллина очехленного жгутика A.brasilense Sp245 54
3.1.2 Получение и анализ антител на флагеллин A. brasilense Sp245 57
3.1.2.1 Получение мономеров флагеллина из филаментов полярного жгутика штамма A. brasilense Sp245 58
3.1.2.2 Серологический анализ флагеллина A. brasilense Sp245 62
3.1.3 Выявление белковых пилей у A. brasilense Sp245 и мутантного штамма A. brasilense SK048 64
3.1.4 Выявление фибриллярных структур на поверхности A. brasilense SK048 с помощью негативного контрастирования 68
3.1.5 Получение и анализ антител на клетки Gri+ мутанта A. brasilense SK048 70
3.2 Анализ изменений клеточной поверхности и структуры макроколоний бактерий Azospirillum brasilense под влиянием конго красного 73
3.3 Оценка влияния флагеллина A. brasilense Sp245 на митотическую активность растительных апикальных меристем 81
3.4 Биоинформатический анализ 3D структур флагеллина и пилиноподобных белков с использованием результатов полногеномного секвенирования ДНК штамма A. brasilense Sp245 84
Заключение 96
Выводы 99
Список использованных источников 100
- Бактерии рода Azospirillum как объект исследования
- Биоинформатический анализ в биологических исследованиях
- Получение мономеров флагеллина из филаментов полярного жгутика штамма A. brasilense Sp245
- Биоинформатический анализ 3D структур флагеллина и пилиноподобных белков с использованием результатов полногеномного секвенирования ДНК штамма A. brasilense Sp245
Введение к работе
Актуальность темы. Значительная часть выявленных к настоящему
моменту закономерностей возникновения и развития растительно-
микробных ассоциаций установлена с использованием в качестве модели
бактерий рода Azospirillum. Азоспириллы, первоначально выделенные из
ризосферы злаков и прошедшие с ними разнообразные, в том числе, полевые
испытания, достаточно успешно коммерциализированы [Pereg et al., 2016].
Исследование особенностей взаимодействия микроорганизмов с растениями
обеспечивает создание научно-обоснованных подходов к подбору
эффективных вариантов инокуляции растений и, в конечном итоге,
способствует развитию экологически безопасных современных
агробиотехнологий.
Степень разработанности темы исследования. Колонизация и прикрепление бактерий к корням растений являются основополагающими этапами формирования растительно-микробных ассоциаций. У многих грамотрицательных бактерий процесс закрепления на корнях растений опосредуется жгутиками, фимбриями (или пилями), представляющими собой, в основном, белковые структуры [DeWeger et al., 1987; Drr et al., 1998; Croes et al., 1993; DeTroch, Vanderleyden, 1996]. Первые необходимы для подвижности бактерий в жидкой среде или по поверхности твердых сред, а вторые – для адгезии и осуществления других функций. У ассоциативных бактерий рода Azospirillum при культивировании в жидких средах имеется один полярно расположенный жгутик, обеспечивающий подвижность и хемотаксис [Zhulin, Armitage, 1992], изолированный от окружающей среды липополисахаридным чехлом [Бурыгин и др., 2007], а при росте в средах с повышенной вязкостью и на плотных средах образуются дополнительные латеральные жгутики (Khammas et al., 1989; Tarrand et al., 1978). Полагают, что полярный жгутик A. brasilense содержит в своем составе адгезивный компонент, вовлеченный в связывание с корнями пшеницы [Rodriguez-Navarro et al., 2007].
В ряде работ имеются сведения о появлении фибриллярного материала при закреплении азоспирилл на корнях растений, однако его природа остается невыясненной [DeTroch, Vanderleyden, 1996]. При этом установлено, что в ходе адаптации к существованию на корнях пшеницы у A. brasilense повышается количество представленных на клеточной поверхности родоспецифичных белковых поверхностных антигенов, участвующих в процессе микроколониального распространения данных бактерий [Шелудько и др., 2010]. В осуществлении указанного способа коллективной миграции
азоспирилл и в колонизации ими корней пшеницы могут участвовать белковые пили или пилеподобные структуры.
Компоненты поверхности бактериальных клеток, как правило,
изучаются, будучи отделенными от клеточной массы. Существует немного
работ, относящихся к исследованию архитектуры клеточной поверхности,
степени представленности на клетке, а также обособленности от
окружающей среды тех или иных поверхностных бактериальных структур.
Очень хорошую перспективу для решения подобных задач имеют
иммунохимические подходы, основанные на использовании специфических
антител для оценки экспонированности на поверхности бактериальных
клеток детерминант различной природы, задействованных во
взаимодействии с макропартнерами. Эти сведения могут быть полезны для контроля над многими процессами, такими как бактериальная адгезия и адсорбция, а также при разработке приемов выявления и серологической идентификации бактерий.
Существенным вкладом в раскрытие механизмов растительно-микробной ассоциативности могут стать сведения о том, что происходит с бактериальными клетками и с их поверхностью в прикорневой зоне растений при контактах с агентами, меняющими способ распространения бактерий. В первую очередь, это относится к информации о представленности на поверхности бактерий тех или иных структур, опосредующих различные механизмы подвижности. Кроме этого, представляет интерес возможность участия мажорных белковых антигенов ассоциативных бактерий, в частности, флагеллина полярного жгутика, в развитии ответных реакций у растений.
Получение с помощью биоинформатического анализа данных о
молекулярном строении флагеллина и пилиноподобных белков
ассоциативных бактерий открывает перспективы изучения физических свойств поверхности этих макромолекул, в значительной степени определяющих биологическую активность исследуемых структур.
Целью настоящей работы являлось изучение мажорных белковых
антигенов Azospirillum brasilense, отвечающих за бактериальную
подвижность и взаимодействие с растительными партнерами.
Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие задачи:
-
Выполнить иммуномикроскопическую визуализацию флагеллиновых и пилиновых детерминант бактерий Azospirillum brasilense.
-
Сравнить иммунохимические свойства флагеллинов полярных жгутиков штаммов A. brasilense Sp245 и A. brasilense Sp7, относящихся
к разным серологическим группам согласно характеристикам их О-антигенов.
-
Исследовать изменения клеточной поверхности и структуры макроколоний Azospirillum brasilense под влиянием витального красителя конго красного, меняющего способ распространения данных бактерий.
-
Оценить влияние флагеллина полярного жгутика эндофитного штамма A. brasilense Sp245 на митотическую активность апикальных меристем проростков пшеницы.
-
Провести биоинформатический анализ 3D структур флагеллина и пилиноподобных белков с использованием результатов полногеномного секвенирования ДНК штамма A. brasilense Sp245. Научная новизна работы. Впервые в составе поверхности бактерий
Azospirillum brasilense выявлены детерминанты пилина/пилиноподобного
белка. Впервые продемонстрированы штаммовые серологические различия
белковых детерминант гликозилированных флагеллинов бактерий
Azospirillum brasilense. Впервые показано положительное влияние
флагеллина полярного жгутика ассоциативных бактерий на митотическую
активность апикальных меристем проростков пшеницы. Методом
гомологичного моделирования и моделирования по шаблону для штамма A. brasilense Sp245 впервые описаны на уровне 3D структур белки флагеллы и пилиноподобные белки, гены которых представлены в его геноме.
Практическая значимость работы. Разработан способ
пробоподготовки клеток азоспирилл для иммуноэлектронной микроскопии,
обеспечивающий удаление прочно связанного полисахаридного чехла с
полярного жгутика. Модифицирована методика препаративного выделения
химически чистого препарата гликозилированного флагеллина азоспирилл.
Полученные в работе препараты и антитела были использованы при
проведении плановых НИР ИБФРМ РАН. Методические приемы,
разработанные в диссертационной работе, применялись при подготовке
квалификационных работ студентами биологического факультета
Саратовского госуниверситета.
Основные положения, выносимые на защиту
-
На поверхности бактерий Azospirillum brasilense выявляются белковые антигены пилийного происхождения, не проявляющие штаммовой специфичности.
-
Изолированные субъединицы флагеллина полярного жгутика эндофитного штамма A. brasilense Sp245 повышают митотическую активность апикальных меристем проростков пшеницы.
3. Взаимодействие бактерий Azospirillum brasilense с витальным красителем конго красным, меняющим способ их распространения в полужидких средах, приводит к формированию организованных клеточных структур, способных покидать границы роения единичных клеток. Клетки в таких образованиях не имеют полярных жгутиков и покрыты слоем фибриллоподобного материала.
Степень достоверности и апробация результатов. Степень
достоверности полученных результатов определяется значительным объемом
данных, полученных с помощью современных научных методов в
повторяющихся экспериментах. Статистическая обработка результатов,
отличающихся качественной (двояковозможной) изменчивостью,
проводилась по адекватным формулам и алгоритмам. Основные положения диссертации были представлены в виде устных и стендовых сообщений на VI и VIII Всероссийских конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2012; 2016); X Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2015); III Пущинской школе-конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов» (Пущино, 2016) и 21-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2017).
Связь работы с научными программами и личный вклад автора в
исследования. Работа выполнена на базе лаборатории иммунохимии
ИБФРМ РАН в соответствии с плановой темой НИР «Антигенные структуры
и ответные реакции партнеров в процессе межклеточных и
межорганизменных коммуникаций» (2013-2017 гг., № гос. регистрации 01201359056).
Личный вклад автора состоит в непосредственном получении и
обработке экспериментальных данных, планировании экспериментов,
анализе литературных источников. Автором лично разработаны
методические подходы к освобождению бактериальных клеток от
капсульного и очехляющего жгутик материала для проведения
иммуномикроскопических исследований, а также этапы проведения прямой и стереоскопической световой микроскопии бактериальных популяций. Совместно с сотрудниками ЦКП «Симбиоз» ИБФРМ РАН были проведены работы по электронномикроскопической визуализации поверхностных родоспецифичных белковых антигенов бактерий Azospirillum brasilense. Биоинформатический анализ 3D структур флагеллина и пилиноподобных белков штамма A. brasilense Sp245 проводился совместно с д.х.н. проф.
Щеголевым С.Ю. При непосредственном участии автора осуществлялась подготовка основных публикаций по теме диссертационного исследования.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, из них 2 статьи в журнале, рекомендованном ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, описывающей материалы и методы исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников, содержащего 263 наименования. Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, включает 26 рисунков и 1 таблицу.
Бактерии рода Azospirillum как объект исследования
Бактерии рода Azospirillum известны на протяжении многих лет как стимулирующие рост растений ризобактерии (plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR) [Dbereiner, Day, 1976]. Это свободноживущие азотфиксирующие высокоподвижные бактерии, колонизирующие, преимущественно, поверхность растительных корней. У азоспирилл описаны только несколько штаммов, способных проникать внутрь корня [Baldani et al., 1986; Assmus et al., 1995]. Эффект осуществляемой данными бактериями фитостимуляции обусловлен несколькими механизмами, основными из которых являются продукция фитогормонов (в частности, ауксина) и биологическая азотфиксация. В ряде исследований установлено, что в результате инокуляции азоспириллами только часть фиксированного бактериями азота доставляется в растения [Kapulnik et al., 1981]. При этом мутанты по нитрогеназной активности в ряде случаев сохраняли способность к стимуляции роста зерновых культур [Bashan et al., 1989]. В отличие от симбиотической азотфиксации, где происходит прямой транспорт азота через симбиотический интерфейс, азоспириллы, как и другие ассоциативные диазотрофы, не могут быстро передавать фиксированный азот растению, и этот процесс, очевидно, связан с жизненным циклом бактерий [Lethbridge, Davidson, 1983; Rao et al., 1998]. К другим механизмам фитостимуляции азоспириллами относятся общее улучшение роста корней и усиление поглощения минералов и воды, солюбилизация фосфатов почвы, смягчение растительных стрессов [Bashan, de-Bashan, 2010].
Существование бактерий в ризосфере растения и содействие его росту не обязательно квалифицируют растение как хозяина. Чтобы быть истинным хозяином, растение должно поддерживать бактерии, прикрепленные к его органам или находящиеся внутри его тканей, обеспечивая долгосрочную связь между партнерами. Способность видов Azospirillum прикрепляться к корням растений различными способами хорошо документирована, что делает некоторые растения подлинными хозяевами азоспирилл [Pereg et al., 2016].
В настоящее время к роду Azospirillum отнесено 18 видов: A. brasilense и A. lipoferum [Tarrand et al., 1978], A. halopraeferens [Reinhold et al., 1987], A. largimobile [Sly, Stackebrandt, 1999], A. doebereinerae [Eckert et al., 2001], A. oryzae [Xie, Yokota, 2005], A. melinis [Peng et al., 2006], A. canadense [Mehnaz et al., 2007a], A. zeae [Mehnaz et al., 2007b], A. rugosum [Young et al., 2008], A. palatum [Zhou et al., 2009], A. picis [Lin et al., 2009], A. thiophilum [Lavrinenko et al., 2010], A. formosense [Lin et al., 2012], A. humicireducens [Zhou et al., 2013], A. fermentarium [Lin et al., 2013], A. soli [Lin et al., 2015] и A. agricola [Lin et al., 2016]. Большинство штаммов описанных видов выделены из почвы или ризосферы, однако некоторые были выделены из нехарактерных для почвенных бактерий сред обитания, таких как бактериальные маты, сформировавшиеся в серном источнике [Lavrinenko et al., 2010] и отработанное дорожное покрытие [Lin et al., 2009].
Изначально описанные как стимуляторы роста и развития злаковых растений, азоспириллы впоследствии продемонстрировали положительный эффект по отношению к более чем 100 видам как однодольных, так и двудольных растений, инокулированных этими бактериями или консорциями микроорганизмов, включающими азоспириллы [Bashan et al., 2004]. В большинстве случаев успех инокуляции выражался в морфологических изменениях корней и побегов, увеличении урожайности и улучшении питания растений. На протяжении 30 лет изучалось стимулирующее действие азоспирилл на развитие растений пшеницы, кукурузы и риса, поскольку большинство штаммов были изолированы из злаковых культур [Bashan et al., 2004; Fuentes-Ramirez, Caballero-Mellado, 2005; Veresoglou, Menexes, 2010]. Однако рост числа штаммов, изолированных не из злаков, вызвал интерес исследователей к анализу положительного влияния бактерий рода Azospirillum на широкий круг декоративных, лекарственных и сельскохозяйственных растений, таких как земляника [Pedraza et al., 2010], картофель [Tkachenko et al., 2015], представитель семейства астровых Gaillardiapulchella [Gadagi et al., 2004], смолевка меловая Silenecretacea Fisch. exSpreng. [Крицкая и др., 2017] и др. Особенно следует отметить положительный эффект использования азоспирилл при осуществлении микроклонального размножения хозяйственно ценных растений [Tkachenko et al., 2015; Крицкая и др., 2017]. Так, показано, что инокуляция бактериями A. brasilense Sp245 микроклонов картофеля в культуре in vitro позволяет повысить эффективность технологии производства посадочного материала картофеля с улучшением приживаемости микрорастений в условиях открытого грунта и увеличением урожайности клубней [Tkachenko et al., 2015].
Электронно-микроскопические исследования нескольких видов инокулированных растений показали, что клетки Azospirillum соединяются с поверхностью корня и друг с другом в бактериальных агрегатах массивной сетью фибриллярного материала [Bashan et al., 1986; Levanony et al., 1989]. Хотя азоспириллы не всегда демонстрируют единую картину прикрепления в разных экспериментах, даже когда один и тот же штамм используется с одним и тем же растением-хозяином [Michiels et al., 1989], представляется, что агрегация фибриллярным материалом является характерной чертой колонизации поверхности корня бактериями данного рода, независимо от вида или штамма [Umali-Garcia et al., 1980; Patriquin et al., 1983; Bashan et al., 1986; Gafni et al., 1986; Okon, Kapulnik, 1986; Hadas, Okon, 1987; Levanony et al., 1989]. Химическая природа этих фибрилл однозначно не определена, но есть признаки того, что они содержат белковые соединения [Bashan, Levanony, 1989b] и полисахариды, которые ответственны за явление прикрепления [Katupitiya et al., 1995a; Pereg Gerk et al., 1998, 2000]. Фибриллярное прикрепление, в первую очередь, зависит от активности бактериального метаболизма: убитые бактерии не прикреплялись к корням, тогда как живые бактерии прикреплялись к мертвому растительному материалу [Bashan et al., 1986; Gafni et al., 1986].
Существуют, по меньшей мере, два разных по силе типа прикрепления азоспирилл: слабое прикрепление к небиологическим поверхностям и более сильное прикрепление к корням, хотя в микроскопическом отношении они напоминают друг друга. Прикрепление A. brasilense Cd к гидрофобному полистиролу значительно слабее, чем к корням, и это, вероятно, связано с гидрофобностью полистирола [Bashan, Holguin, 1993]. Прикрепление Azospirillum к чистому песку так же является слабым и достигается сетью протеиновых мостиков, образованных между бактериальной клеткой и частицами кварца [Bashan, Levanony, 1988b]. Следует отметить, что только A. brasilense Sp245 среди нескольких исследованных штаммов в работе [Wisniewski-Dy et al., 2011] оказался способен на опосредованное пилями прикрепление к стеклу.
Анализ большого количества данных, опубликованных за четыре десятилетия, показал, что представители рода Azospirillum способствуют росту и развитию более сотни видов растений из 35 семейств, без каких-либо убедительных доказательств специфичности видов азоспирилл для отдельных видов растений. Многочисленные исследования ассоциации Azospirillum-злаковые растения просто отражают экономическое значение злаков в качестве сельскохозяйственных культур, что приводит к неточным утверждениям о том, что основной эффект этого рода проявляется по отношению к зерновым [Pereg et al., 2016]. Ожидается, что демонстрация взаимодействий азоспирилл с растениями, которые простираются за пределы зерновых культур, приведет к будущим исследованиям и значительно расширит знания об этих бактериях, существенным образом повышающих урожайность растений.
Биоинформатический анализ в биологических исследованиях
Одним из направлений современных исследований в области биологии становится биоинформатика, нацеленная, в частности, на предсказание структур и функций белков по их аминокислотным последовательностям in silico с применением методов молекулярного моделирования. Термин in silico был введен в употребление П. Мирамонтесом в 1989 году [Щеголев, 2014] по аналогии с in vitro (эксперименты с компонентами живых систем вне организмов) и in vivo (эксперименты с живой тканью при живом организме).
Биоинформатику (вычислительную биологию) можно трактовать также и как науку, изучающую последовательности нуклеотидов в генах и геномах и аминокислот в белках, принципы построения данных макромолекул, их историческое развитие, а так же взаимосвязь между последовательностью элементов и их пространственной структурой, физическими свойствами и функциями [Attwood et al., 1999; Lesk, 2008]. В более общем понятии биоинформатика (согласно определению Европейского Института
Биоинформатики (EBI)) – это применение информационных технологий в целях управления данными биологии, а так же их анализа (The European Bioinformatics Institute. [Electronic resource]. – Electronic data. – Mode access: http://www.ebi.ac.uk/2can/bioinformatics/bioinf_what_1.html).
Биоинформатика является междисциплинарной наукой. Для решения поставленных задач в данном направлении широкое применение находят методы математического моделирования и вычислительные мощности как настольных компьютеров, так и многопроцессорных кластерных систем [Порозов, 2010].
Основными задачами биоинформатики являются [Лахно, 2000]:
1. Определение участков в генах и геномах, кодирующих белковые молекулы, и сравнительный анализ первичных структур биополимеров.
2. Исследование и моделирование пространственной структуры биополимеров по результатам рентгеноструктурного анализа, методов ЯМР, крио-электронной микроскопии и др.
3. Предсказание пространственного сворачивания белков (3D-фолдинга).
4. Изучение динамики биомакромолекул.
5. Создание баз данных (нуклеотидных последовательностей, белковых структур, путей метаболизма, клеточных ансамблей и др.).
В качестве одной из актуальных задач компьютерной биологии выступает предсказание пространственной структуры белков по их аминокислотным последовательностям [Щеголев, 2017]. Необходимо также отметить, что биоинформатика рассматривает вопросы, связанные и с четвертичной структурой белка и его взаимодействиями с лигандами (docking). Опираясь на полученные 3D структуры участвующих в исследуемых взаимодействиях молекул, а так же на их физических свойствах (таких как гидрофобность, способность к образованию водородных связей и т.д.) можно предсказать места контакта данных молекул, и вычислить характеристики связывания, что поможет моделировать малые молекулы, задействованные в активировании или блокировке активных центров исследуемого белка [Порозов, 2010].
Основными направление биоинформатических исследований являются: изучение биологической эволюции, поиск и аннотация генов в последовательностях секвенированной ДНК, сборка и аннотация геномов, экзон-интронные соотношения, классификация и характеристика белков, сравнительная геномика и протеомика, филогения и т.д. [Порозов, 2010].
Весьма обширны средства биоинформатического анализа биологических последовательностей, среди которых можно выделить уже упомянутые выше секвенирование и сборку геномов; структурно-функциональный анализ геномов и протеомов; поиск и идентификацию гомологов (биологических систем, имеющих общего предка и изменяющихся в процессе эволюции в результате мутаций, происходящих в молекулах ДНК), путем сравнения биологических последовательностей в результате парных и множественных выравниваний; установление доменной структуры белков; предсказание и всестороннее изучение 3D-структуры белков методами гомологичного моделирования и компьютерного фолдинга ab initio и др. Для исследования эволюционных взаимоотношений между ныне живущими организмами применение находят средства филогенетического анализа биологических последовательностей [Agostino, 2013; Lesk, 2014; Лукашов, 2009; Hall, 2011]. В качестве основных подходов, используемых для предсказания и визуализации третичной структуры белковых молекул, биоинформатика использует [Forster, 2002]: поиск и моделирование с использованием найденных гомологов (homology modeling), предсказание на основе законов квантовой механики и молекулярной динамики (ab initio prediction), прогнозирование вторичной структуры макромолекул. Однако, несмотря на все преимущества указанных методов, они не могут предсказать точной 3D структуры в связи с тем, что основаны на статистических (вероятностных) оценках зависимостей между определенными участками последовательностей аминокислот и элементами вторичной и третичной структуры белков [Порозов, 2010].
Полученные в ходе экспериментов (рентгеноструктурного анализа, ядерно-магнитного резонанса, крио-электронной микроскопии и др.) данные после обработки заносятся в специальные банки данных – PDB, SRS, SRS3D, SCOP, CATH, PFAM и др [Порозов, 2010].
Пакет программ Blast (Blast: Basic Local Alignment Search Tool. – URL: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) представляет собой один из используемых инструментов, предназначенных для поиска гомологичных последовательностей ДНК и белков. Используя данный ресурс, возможно проводить поиск по базам данных: расшифрованных белковых структур – PDB (Protein Data Bank), имеющихся в доступе аннотированных и неаннотированных последовательностей и т.д. Для анализирования последовательностей применяются программы парного и множественного выравнивания. В исследованиях задействуются как программы, сконструированные для анализа и обработки большого количества информации, например Mega [Tamura et al., 2013], так и онлайн-серверы, выполняющих задачи в течение достаточно короткого времени, например, Clustal (Clustal Omega. – URL: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo), предназначенные для сравнений относительно небольших наборов последовательностей. Метод молекулярной динамики, часто производимый с использованием программы NAMD, позволяет рассчитать пространственную структуру и понять функционирование молекулы белка в растворе [Ayupov, Akberova, 2015a; Ayupov, Akberova, 2015b; Phillips et al., 2005] и, таким образом, изучить особенности строения и поведения белковой молекулы в близких к физиологическим условиях. Для визуализации анализа разрешенных структур и траекторий молекулярной динамики используют программы VMD [Humphrey et al., 1996] и Chimera [Pettersen et al., 2004]. Сравнительный структурный анализ позволяет предсказать положение белка в комплексе с рибосомой, оценить качество предсказания структур биоинформатическими программами, а также выявить возможные проблемы при разрешении структуры белка методом ЯМР, который интенсивно используется в исследованиях относительно небольших биологических молекул [Usachev et al., 2015].
Одним из широко применяющихся методов является построение моделей 3D - структур белков, основываясь на гомологии с аминокислотными последовательностями родственных белков, пространственная структура которых определена. Само понятие «молекулярное моделирование» рассматривается как процесс описания физико-химических и биологических систем в рамках достаточно реалистичных атомных моделей. Целью проведения молекулярного моделирования является предсказание макроскопических свойств, основываясь на поведении системы на молекулярном уровне [Косинский и др., 2006]. Дальнейшее изучение трехмерных белковых моделей методами молекулярного моделирования (таких как молекулярная динамика и докинг лигандов) позволяет более детально проводить анализ экспериментальных данных, осуществлять компьютерный дизайн точечных мутаций макромолекул, а также выдвигать различные гипотезы о структуре и функции белка [Косинский и др., 2006].
Для анализа последовательностей в биоинформатике используют их выравнивание (alignment), которое подразделяется на парное (pairwise alignment) и множественное (multiple sequence alignment, MSA), локальное [Smith, Waterman, 1981] и глобальное [Needleman, Wunsch, 1970]. Данные методы состоят в том, что в двух (нескольких) последовательностях производится поиск идентичных или схожих участков. Так как в процессе эволюции генов в них могут происходить не только мутации (замены букв молекулярного текста), но и вставки или делеции, допускается добавление в выравниваниях «пробелов» (gaps) для получения лучшего результата. Выравнивания позволяют выявить нуклеотиды или аминокислоты и их группы (мотивы, домены), имеющиеся в большинстве сравниваемых последовательностей в определенных позициях, и, таким образом, с большей долей вероятности говорить о том, что данные «консервативные» участки являются биологически активными сайтами в белках, так как именно они отбирались и фиксировались в процессе эволюции [Порозов, 2010]. Множественное выравнивание можно применять и при изучении вопросов, связанных с исследованием происхождения видов. Так, определить примерный возраст вида можно зная частоту мутаций [Порозов, 2010].
Получение мономеров флагеллина из филаментов полярного жгутика штамма A. brasilense Sp245
Для получения электрофоретически чистого препарата флагеллина Sp245 модифицировали схему выделения, предложенную в работе [Беляков и др., 2010]. В упомянутой работе объектом исследований служили бактерии штамма Sp7, жгутик которых менее прочно связан с телом клетки (по сравнению с Sp245). Модифицированная схема (рис. 4) включала, помимо механического воздействия на бактериальные клетки с помощью блендера, дополнительное гидродинамическое и ультразвуковое воздействие с применением ультразвуковой установки (данные операции чередовались три раза). После нескольких этапов центрифугирования при разных режимах (для освобождения от клеточного материала) полученный супернатант, содержащий фрагменты флагеллиновых молекул, подвергали ультрацентрифугированию. Осажденный флагеллин (рис. 5) диссоциировали с помощью кислоты, удаляли недиссоциированную высокомолекулярную фракцию, проводя ультрацентрифугирование.
Значение pH полученного супернатанта доводили до нейтрального и проводили ещё одно ультрацентрифугирование. Полученный в результате супернатант представлял собой свободный от примесей раствор мономеров флагеллина (рис. 6, трек 6).
Итоговый продукт использовался для получения специфических антител и в экспериментах по оценке влияния флагеллина на пролиферативную активность клеток проростков пшеницы. Результаты иммуноблоттинга, приведенные на рисунке 6Б, характеризуют специфичность взаимодействия полученных антител с препаратом флагеллина штамма Sp245.
Биоинформатический анализ 3D структур флагеллина и пилиноподобных белков с использованием результатов полногеномного секвенирования ДНК штамма A. brasilense Sp245
Нами был проведен анализ молекулярных структур основных белков, формирующих полярный жгутик, а также пилеподобных структур, выявляемые на поверхности клеток штамма A. brasilense Sp245. Для биоинформатического исследования 3D структур флагеллина и пилиноподобных белков использовали аминокислотные последовательности, аннотированные в сборке генома данного штамма на уровне одной хромосомы и шести плазмид, представленных в работе [Wisniewski-Dye et al., 2011]. Для характеристики состава указанных поверхностных структур на молекулярном уровне были применены современные биоинформатические подходы. В качестве метода компьютерного моделирования было выбрано молекулярное моделирование по шаблону, как одна их эффективных разработок в данном направлении [Yang et al., 2015], и соответствующий веб-ресурс (IASSER) [Yang et al., 2015], обеспечивающие высокоточные предсказания in silico пространственной структуры, а также основных функций белков (связывание с лигандами, ферментативные свойства, генно онтологические характеристики) по определенным аминокислотным последовательностям. Набор алгоритмов данного метода направлен, прежде всего, на отыскание шаблонов с наиболее близким фолдингом в базе данных PDB экспериментально определенных трехмерных структур белков (www.rcsb.org). По сравнению с постоянно возрастающим числом расшифрованных белковых последовательностей имеется весьма ограниченный набор таких шаблонов, однако вероятность их обнаружения достаточно велика, что объясняется чисто эволюционными причинами благодаря наличию гомологов (организмов, произошедших от общего предка), белковых доменов (отобранных эволюцией универсальных «строительных блоков») и т.п [Щеголев, 2017]. При отсутствии экспериментального шаблона программой используется моделирование ab initio (с нуля) с применением высокоэффективных математических методов [Lee et al, 2017].
В зрелой структуре жгутика имеются три смежные полые составляющие: вал (rod), крюк (hook), филамент (filament) [Evans et al, 2013]. Экспонированными над клеткой являются белковые структуры: FlgE, составляющий крюк клеточной поверхности; белки FlgK и FlgL, представляющие собой соединительные белки между крюком и филаментом; белок FliC - флагеллин внешнего филамента жгутика и белок FliD (является белком наконечника дистального кончика флагеллы). На рисунке 19 представлена схема, отображающая расположение белков жгутика, представленных в его зрелой структуре [Evans et al, 2013].
Биоинформатическое исследование 3D структур флагеллина нами было выполнено на примере белка FliC, формирующего внешний филамент жгутика и, следовательно, в наибольшей мере задействованного в растительно-бактериальных взаимодействиях. Полученные нами молекулярные 3D модели протеиновой основы флагеллина полярного жгутика представлены на рисунке 20. Заметим, что данные модели не учитывают вклада углеводных структур гликозилированного флагеллина [Moens et al, 1995], доля которых в молекулярной массе зрелого белка может достигать 30% [Belyakov et al., 2012].
По итогам моделирования всех белков из A. brasilense Sp245, аннотированных в его геноме как флагеллины филамента жгутика, было замечено, что флагеллин штамма A. brasilense Sp245, в зависимости от локализации в конкретном репликоне (хромосома, плазмиды), представлен в трех вариантах, различных по молекулярной массе M (рассчитанной по аминокислотной последовательности) (28,3; 43,6; 65,2 кДа) и степени выраженности вариабельной части (Р-структуры и петли), расположенной между высоко консервативными N- и C-концевыми доменами (ос-спирали) аминокислотной последовательности белка. Белок FliC из плазмиды р3 массой 28,3 кДа морфологически практически мало отличается от соединительного белка FlgL и, возможно, таковым и является (рис. 21).
Белок массой 43,6 кДа с учетом гомологии генов идентифицируется как флагеллин Laf1 латерального жгутика [Moens et al, 1995; Filip echeva et al, 2017]. Оставшийся полноразмерный белок FliC массой 65,2 кДа, локализованный на хромосоме и плазмиде р1, имеет все основания считаться основным белком филамента полярного жгутика A brasilense Sp245. Бльшее значение молекулярной массы мономеров флагеллина Sp245, определяемое методом электрофореза в ПААГ (рис. 6), объясняется гликозилированием данного белка (см. выше). На основании продемонстрированной нами способности углеводных фрагментов гликозилированного флагеллина штамма Sp245 формировать полноценную полосу преципитации с антителами на ЛПС данного штамма (рис. 8) можно предположить, что, как и у типового A. brasilense Sp7, у штамма Sp245 углеводные фрагменты флагеллина представлены олигосахаридами, иммунохимически идентичными О-специфическим полисахаридам ЛПС. Данное обстоятельство, очевидно, обуславливает различия рассчитанной и определенной экспериментально молекулярной массы субъединиц гликозилированного флагеллина FliC штамма Sp245 (рис. 6). Здесь уместно отметить, что у типового штамма А. brasilense Sp7 доля углеводной части в молекуле флагеллина превышает 30% [Belyakov et al., 2012].
При помощи метода молекулярного моделирования по шаблону нами также были исследованы 3D структуры пилиноподобных белков. Как уже отмечалось выше, для грамотрицательных бактерий характерны различные типы пилей, задействованных в разнообразных процессах жизнедеятельности бактериальных клеток. При установлении растительно-микробных ассоциаций универсальными средствами реализации подобных взаимодействий являются пили IV типа [Drr at al, 1998; Ramey et al., 2004], показано участие данных структур в процессах адгезии, подвижности бактериальных клеток, в процессах формирования микроколоний, секреции протеаз и факторов колонизации [Craig, Li, 2008]. По информации, приведенной в работе [Wisniewski-Dye et al., 2011], для штамма А. brasilense Sp245 характерно наличие пилей типа Tad. Пили типа Tad относятся к T4b классу пилей IV типа [Giltner et al., 2012] и играют важную роль в формировании биопленок, колонизации и в патогенезе микроорганизмов. Данные структуры кодируются в геноме в так называемом острове обширной колонизации WCI (Widespread Colonization Island) и собираются из фимбриального низкомолекулярного белка Flp [Tomich et al., 2007]. Известно, что данные структуры среди азоспирилл уникальны для вида A. brasilense [Wisniewski-Dye et al., 2012]. На рисунке 22 представлена схема секреторной системы Tаd, определяющей синтез и функционирование пилей этого типа [Tomich et al., 2007].
В геноме А. brasilense Sp245 представлены TadV, Flp IVb пилин (Flp1), CpaB (RcpC), CpaC (RcpA), CpaD (RcpB), CpaF (A, ATPase), TadG (G). Все гены обозначенных структур локализованы на плазмиде р4. Как достаточно показательные примеры рассмотрим Flp IVb пилин и белок CpaB (RcpC). Первый представляет собой молекулярную заготовку главного структурного компонента пилей, второй известен возможным участием в процессах образования биопленок [Wisniewski-Dye et al., 2011]. Как и для флагеллинов, для рассматриваемых белков характерным является как наличие высококонсервативных, так и вариабельных областей (петель). Для главного структурного компонента пилей, белка IVb пилина (рис. 22) программой был определен ряд структурных аналогов, однако наиболее близкими оказались эндотоксин из Bacillus thuringiensis (рис. 24А) и модельный белок, сконструированный искусственно, закристаллизованный и охарактеризованный методом рентгеноструктурного анализа (рис. 24Б). Последний относится к категории повторяющихся структурных элементов, широко распространенных среди разных организмов [Brunette et al., 2015]. Однако в данном случае авторами решалась задача получения белка de novo при главном условии формирования им 3D структур типа спираль-петля-спираль-петля как основной повторяющейся единицы, с участием которой может быть создано огромное разнообразие структур белковых молекул [Brunette et al., 2015]. Ими отмечено, что разработанные модели и их генетические последовательности существенно отличаются от известных повторяющихся белков без какой-либо значительной структурной гомологии с ними. Так что полученный нами результат может стать одним из первых прецедентов обнаружения данных структур в составе бактериального генома.
Необходимо заметить, что моделированный IVb пилин представляет собой лишь препилин, претерпевающий целый ряд посттрансляционных модификаций, прежде чем он станет полноценным структурным элементом пилей. Среди процессов посттрансляционных модификаций можно отметить протеолиз, объединение полипептидных фрагментов, гликозилирование и пр. Представление о том, как может выглядеть зрелый IVb пилин, можно получить из приведенного здесь примера IVb пилина из сальмонеллы, представленного на рисунке 25.