Исследование деградации рибосом у бактерий при минимальных бактерицидных воздействиях Лищенко, Николай Николаевич

Введение к работе

Актуальность темы

Среди разнообразных взаимоотношений человека и представителей царства прокариотов на одном из первых мест стоит необходимость уничтожения патогенных бактерий как внутри макроорганизма, так и во внешней среде. В современных условиях для этого используется все большее число антимикробных средств [Машковский М.Д., 1993; Красильников А.П., 1995]. Соответственно, все острее ощущается необходимость в каждом случае определить молекулярные и субклеточные причины гибели микробов при бактерицидных воздействиях. Глубокое знание тонких механизмов инактивации бактерий необходимо в производстве субклеточных и иных вакцин [Лихолетов СМ., 1988; Воробьев А.А., Ляшенко В.А., 1995]. В практической дезинфекционной работе, а также в таких производственных сферах, как нефтедобыча [Карасева Э.В. и др., 1987], недостаточное понимание механизмов бактерицидного действия антимикробных веществ порождает их неоправданный перерасход со всеми неблагоприятными экономическими и, главное, экологическими последствиями.

Изучение разных структурных уровней действия антимикробных факторов имеет не только прикладное медицинское, но и общебиологическое научное значение. Среди важнейших клеточных систем, повреждение которых может приводить к гибели бактерий, наиболее полно и на достаточно глубоком уровне изучен аппарат биосинтеза белка, в особенности рибосомы [Спирин А.С., 1986]. Эти органеллы осуществляют чрезвычайно важные функции, главная из которых - трансляция генетической информации. Вместе с тем рибосомы являются одним из основных сенсоров условий существования клетки и в ответ на их изменение синтезируют особые регуляторные молекулы, перестраивающие в оптимальном направлении весь метаболизм бактерии [Лишневская Е.Б., 1984; VanBogelen R.A., Neidhardt F.C., 1990].

Учитывая эти обстоятельства, повреждение именно этих субклеточных компонентов целесообразно в первую очередь исследовать в качестве возможной главной причины гибели бактерий при бактерицидных воздействиях. Вопрос о деградации рибосом у бактерий, помимо прочего, приобретает и непосредственное прикладное значение. Понимание ее закономерностей

становится необходимым для выбора наиболее эффективных и экономичных способов получения препаративных количеств ри-босомного материала. В настоящее время это требуется для изготовления рибосомных вакцин [Белкин З.П., 1989], для бесклеточного синтеза биологически активных веществ (биотехнология in vitro) [Baranov V.I. и др., 1989], а также для риботипирования бактерий [Tarkka Е. и др., 1994]. Вероятно, будут разработаны и другие способы использования бактериальных рибосом.

Не исключено, что именно незнание закономерностей и недооценка внутриклеточной деградации рибосом являются причиной относительного отставания в разработке рибосомных вакцин. Поскольку эти препараты предполагается получать из патогенных бактерий, перед выделением рибосом необходимо убить клетки. Однако надо быть уверенным, что фактор, вызывающий их гибель, не разрушит сами рибосомы. На момент начала нашей работы были известны лишь единичные попытки увязать механизм бактерицидного действия нагревания культуры с повреждением рибосом [Allwood М.С., Russell A.D., 1968; Rosenthal L.J., Iandolo J.J., 1970; Tomlins R.I., Ordal Z.J., 1971], причем было исследовано всего два вида бактерий. А у таких основных компонентов нормальной микрофлоры человека, как бифидобактери, рибосомы не только не изучались, но даже и не были выделены из клеток. Помимо повышенной температуры никакие другие антимикробные средства, в первую очередь антисептические вещества, подобному анализу не подвергались. Разработка перечисленных теоретических и практических проблем требует углубления представлений о субклеточных и молекулярных механизмах бактерицидного действия антимикробных агентов.

Поэтому изучение процесса деградации рибосом у бактерий при действии на них широкого круга бактерицидных факторов является актуальным и важным для практики.

Цель исследования:

Изучить закономерности, особенности и биологическую роль деградации рибосом у бактерий при минимальных бактерицидных воздействиях антимикробных факторов.

Задачи исследования:

1. Разработать методологию изучения влияния бактерицидных факторов на состояние рибосомного аппарата бактерий.

1. Определить минимальные бактерицидные дозы (Bactericidal Dose - BD99) физических (повышенная температура), химических (основные антисептические вещества) и физико-химических (изменение рН среды) факторов для представителей семейств грамотрицательных (энтеробактерии, псевдомонады, вибрионы) и грамположительных (бациллы, бифидобактерии) бактерий.

2. Разработать способ получения рибосом из клеток бифидобактерии и охарактеризовать некоторые физико-химические и биологические свойства этих частиц.

3. Выявить наличие и закономерности повреждений рибосом у представителей пяти семейств микроорганизмов при различных минимальных бактерицидных воздействиях и на этой основе определить средства и способы инактивации бактерий, обеспечивающие в одних случаях сохранение в клетках интакт-ных рибосом, а в других - их максимальное разрушение.

4. Изучить особенности изменений состава рибосомного материала разных бактерий в зависимости от типа примененного бактерицидного агента (нагревание, антисептические вещества, изменения рН).

5. Оценить роль деградации рибосом в утрате жизнеспособности бактерий при минимальных бактерицидных воздействиях.

Научная новизна

Разработана методология изучения механизмов бактерицидного действия различных антимикробных факторов, нацеленная на получение сопоставимых результатов. В ее основу положено: 1) изучение этих механизмов в максимально стандартизованных условиях в отношении как физиологического состояния бактерий, так и интенсивности бактерицидных воздействий; 2) сведение к минимуму защитного действия на клеточные структуры шаперонинов и им подобных белков; 3) использование минимальных доз бактерицидных воздействий с применением для оценки их интенсивности нового, более точного показателя -

BD99.

Установлено, что бактерицидное действие на грамотрица-тельные бактерии повышенной температуры, некоторых антисептических веществ, а также изменений рН среды сопровождается интенсивным повреждением в клетках рибосом, заключающемся в деполимеризации рибосомных РНК.Угрампо-

ложительных - эти процессы выражены значительно слабее.

Получены данные о том, что разрушение рибосом у грамот-рицательных бактерий осуществляется специфической клеточной системой, активирующейся при некоторых воздействиях. Общим признаком для них, по-видимому, является способность строго определенным образом нарушать структуру и, как следствие, проницаемость клеточных мембран. Показано, что такие повреждения мембран возникают только под действием некой "оптимальной" дозы антибактериального фактора. Составлена вероятная схема внутриклеточных процессов, приводящих к разрушению рибосом у грамотрицательных бактерий.

Впервые предложена классификация результатов деградации рибосомных РНК. Несмотря на многообразие возможных индукторов, деполимеризация рРНК и, соответственно, распад бе-локсинтезирующих частиц происходят по двум основным путям, обозначенным нами как симметричная в отношении субъединиц (СДР) и асимметричная (АДР) деградация рибосом. Последняя у большинства исследованных бактерий представлена типом АДРІ, когда преобладает разрушение 30S субъединиц. Особенности деградации рибосом определяются в первую очередь свойствами бактерий и в меньшей мере зависят от характера антимикробного агента. Повреждение рибосом по типу АДРИ (разрушение 50S-4acran) обнаружено только у Bacillus subtilis.

Выявлены ранее неизвестные особенности механизмов действия антисептических веществ на состояние рибосомного аппарата бактерий. По наличию или отсутствию способности вызывать деградацию рибосом у грамотрицательных бактерий антисептики разделены на две категории.

Обнаружена способность хлоргексидина стимулировать лизис бацилл и освобождение рРНК под действием детергентов.

С помощью вновь разработанной питательной среды для бифидобактерий (неагаризованной дрожже-молочно-солевой, ДМС) реализован новый метод их выращивания, динамическое анаэробное культивирование, обеспечивающий получение биомассы, свободной от примесей питательного субстрата. Это открыло возможность широкого изучения биохимических процессов у бифидобактерий.

Из клеток бифидобактерий впервые выделены рибосомы, основные физико-химические свойства которых сходны с таковыми у Е. coli. Рибосомы бифидобактерий способны индуцировать у млекопитающих состояние тахифилаксии кгетероло-6

гичной бактериальной инфекции. Впервые изучено влияние минимальных бактерицидных доз нагревания и некоторых антисептиков на состав рибосомного материала бифидобактерий. Установлено, что у них, в отличие от псевдомонад, кишечной и сенной палочек, рибосомы при этих воздействиях практически не повреждаются.

Вся совокупность полученных данных позволяет заключить, что обнаруженная нами избирательная деградация рибосом при бактерицидных воздействиях, по-видимому, не является главной, то есть первичной, причиной гибели микробных клеток, хотя, безусловно, вносит в нее очень важный вклад.

Практическая значимость

Определены величины минимальных бактерицидных доз (BD99) повышенной температуры, антисептических веществ, закислення и защелачивания среды для представителей трех семейств грамотрицательных и двух семейств грамположительных бактерий, включая бифидобактерий. Для последних эти величины при кратковременном (15 минут) воздействии определены впервые.

Показано, что "аномально высокая устойчивость к нагреванию" так называемых "термостойких" шигелл, скорее всего, является артефактом. Реально она не превышает таковой у лабораторных штаммов Е. coli (MRE600). Поэтому нет оснований пересматривать в масштабе страны режим пастеризации молока на пищевых предприятиях.

Разработана новая, относящаяся к типу неагаризованных дрожже-молочно-солевая (ДМС) среда для бифидобактерий. Она имеет более низкую стоимость, чем прототипные среды, и не содержит дефицитных компонентов. На ДМС-среду получено положительное решение по заявке о выдаче патента на изобретение.

Определены условия инактивации культур бактерий, обеспечивающие как получение недеградированных рибосом, так и их разрушение. Высокая избирательность разрушения 30S субъединиц рибосом некоторыми бактерицидными факторами позволяет использовать их для препаративного получения 50S частиц вместо трудоемкого ультрацентрифугирования в градиенте концентрации сахарозы. У рибосом бифидобактерий выявлены им-мунопротективные свойства.

Часть материалов диссертации обобщена в монографии (Молекулярная биология и медицина. - М.: Медицина, 1987. - 287 с). Некоторые фактические данные включены в учебник для студентов фармацевтических и медицинских вузов "Фармакотерапия с основами клинической фармакологии" под редакцией В.И.Петрова (Волгоград, 1996, - 451 стр). Результаты работы используются в лекционном курсе для студентов Кубанской медицинской академии на кафедрах микробиологии и фармакологии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Методология изучения деградации рибосом у бактерий при бактерицидных воздействиях, включающая: а) соблюдение максимально стандартизованных условий эксперимента и постоянства физиологического состояния подвергаемой воздействию популяции микроорганизмов; б) сведение к минимуму проявлений самозащиты клеток в виде синтеза шоковых белков; в) использование минимальных бактерицидных доз повреждающих воздействий с применением нового показателя оценки их интенсивности - BD99.

2. Обнаружение двух основных типов деградации рибосом у бактерий при минимальных бактерицидных воздействиях, обозначенных как симметричная и асимметричная деградация.

3. Совокупность данных, подтверждающих, что деградация рибосом при минимальных бактерицидных воздействиях не является главной причиной утраты жизнеспособности бактерий.

4. Способ динамического анаэробного культивирования би-фидобактерий, позволивший получить их очищенную биомассу, пригодную для препаративного выделения рибосом.

Апробация работы

Результаты проведенных исследований доложены на 3-м Всесоюзном совещании по управляемому биосинтезу и биофизике популяций (Красноярск, 1973); 5-м и 7-м съездах Всесоюзного микробиологического общества (Ереван, 1975; Алма-Ата, 1985); на симпозиуме "Регуляция биохимических процессов у микроорганизмов" (Пущино-на-Оке, 1979); на Всесоюзном семинаре "Современные проблемы антибиотикорезистентности" (Москва, 1988); на I Международном конгрессе по иммунореабилитации (Дагомыс, 1994); на II и III Международных симпозиумах врачей (Анапа, 1994; Геленджик, 1995); на заседаниях Краснодарских краевых обществ микробиологов. 8

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 34 печатные работы, в том числе одна монография. По заявке N. 94023024/13 (021772) о выдаче патента на изобретение "Дрожже-молочно-солевая питательная среда для накопления биомассы бифидо-бактерий" с приоритетом от 13.06.94 г. получено положительное решение (30.5.96 г.).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 332 страницах машинописного текста, состоит из введения; обзора литературы; раздела предварительных исследований (три главы); двух основных разделов, где в пяти главах приведены результаты экспериментов; заключения; выводов; списка цитированной литературы, включающего 326 отечественных и зарубежных источника. Работа иллюстрирована 57 рисунками и 20 таблицами.