Интерналины В Listeria monocytogenes как факторы роста и регуляторы сигнальных путей в эукариотических клетках Чаленко Ярослава Михайловна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 12

1.1. Listeria monocytogenes: место в инфекционной патологии человека 12

1.2. Этапы развития инфекционного процесса 13

1.3 Основные механизмы внутриклеточного размножения 14

1.4. Структурно-функциональная характеристика факторов инвазии семейства интерналинов 18

1.6. Рецептор фактора роста гепатоцитов: Механизмы и клеточные функции 28

1.6.1 MAPK-каскад, PI3K/Akt-путь и STAT-путь 28

1.7. Ответ макроорганизма на внедрение микроорганизма 33

1.8. Использование бактериальных продуктов в терапевтических целях 36

Глава 2. Материалы и методы 40

2.1 Бактериальные штаммы, плазмиды и праймеры 40

2.2 Микробиологические методы 46

2.2.1 Условия культивирования 46

2.2.2 Подготовка культуры для инфицирования эукариотических клеток 46

2.2.3 Приготовление компетентных клеток 46

2.2.4 Электропорация 47

2.3 Молекулярно-генетические методы 47

2.3.1 Полимеразная цепная реакция 47

2.3.2 Электрофорез в агарозном геле 48

2.3.3 Лигирование 49

2.3.4 Рестрикция 49

2.3.5 Выделение плазмидной ДНК 49

2.3.6 Определение нуклеотидной последовательности 49

2.4. Методы экспрессии и очистки белка 50

2.5. Методы, анализа очищенных белковых препаратов 50

2.5.1 Электрофорез белков в полиакриламидном геле 50

2.6. Биологические методы 51

2.6.1 Клеточные линии и условия их культивирования 51

2.6.2 Оценка метаболической активности клеток в МТТ-тесте 52

2.6.3 Оценка митотического индекса эукариотических клеток с использованием флуоресцентной микроскопии 53

2.6.4 Оценка перестройки цитоскелета с использованием флуоресцентной микроскопии 53

2.6.5 Оценка подвижности эукариотических клеток с использованием метода царапины 54

2.6.6 Оценка активации сигнальных путей с использованием флуоресцентной микроскопии 54

2.6.7 Оценка активации сигнальных путей с использованием коммерческого ИФА-анализа 55

2.6.8 Оценка скорости заживления скарифицированных ран с использованием мышиной модели 55

2.6.9 Определение эффективности инвазии в эукариотические клетки 55

2.6.10 Определение уровня интерферона- после инкубации культуры первичных макрофагов и эпителиальных клеток с различными природными вариантами интерналинового домена 56

2.7 Статистические методы 57

Глава 3. Результаты собственных исследований 58

3.1 Конструирование рекомбинантных штаммов E. coli для экспрессии природных вариантов idInlB 58

3.2 Экспрессия и очистка вариантов idInlB 61

3.3 Влияние вариантов idInlB на пролиферацию перевиваемых и первичных клеточных линий 63

3.4 Влияние вариантов idInlB на перестройки актинового цитоскелета перевиваемой и первичной клеточных линий 70

3.5 Оценка мотогенного эффекта природных вариантов интерналина В 75

3.6 Анализ активации внутриклеточных сигналов 76

3.7 Рекомбинантный idInlB ускоряет заживление скарифицированных ран 92

Глава 4. Обсуждение 96

Выводы 109

Список литературы 110

• Структурно-функциональная характеристика факторов инвазии семейства интерналинов
• Использование бактериальных продуктов в терапевтических целях
• Влияние вариантов idInlB на пролиферацию перевиваемых и первичных клеточных линий
• Анализ активации внутриклеточных сигналов

Введение к работе

Актуальность темы и степень ее разработанности

В современной медицинской микробиологии большую важность приобретает новое направление исследований - разработка лекарственных препаратов на основе бактериальных белков, осуществляющих специфические взаимодействия с эукариотическими мишенями. Такие бактериальные белки чаще всего относятся к факторам патогенности, опосредующим ключевые этапы инфекции. Так, например, было показано, что тиол-зависимый гемолизин Streptococcus pyogenes (стрептолизин О), влияет на миграцию эукариотических клеток и может быть использован как средство для сглаживания шрамов и ингибитор миграции опухолевых клеток (Hall et al., 2011). Сигнал чувства кворума Pseudomonas aeruginosa N-3-додеканоил-гомосерин-лактон ускоряет заживление ран, влияя на дифференциацию миобластов (Nakagami et al., 2010). Особый интерес с точки зрения использования в качестве средства терапии представляют бактериальные белки – специфические агонисты поверхностных эукариотических рецепторов, часто выявляемые у внутриклеточных паразитов, у которых они опосредует такие процессы, как адгезия и инвазия.

Грамположительная бактерия Listeria monocytogenes является
типичным факультативным внутриклеточным паразитом. В процессе
инфекции L. monocytogenes продуцирует ряд факторов патогенности с

разными активностями (тиол-зависимый гемолизин - листериолизин О, фосфолипазы С, интерналин А и интерналин B) (Radoshevich, Cossart, 2018). Белки семейства интерналинов - интерналин А (InlА) и интерналин В (InlВ) -основные факторы L. monocytogenes, опосредующие процессы адгезии и активной инвазии в непрофессиональные фагоциты через взаимодействия со специфическими эукариотическими рецепторами (Mengaud et al., 1996).

Белок InlB с молекулярной массой 65 кДа необходим для инвазии бактерий в гепатоциты и многие типы эпителиальных и эндотелиальных клеток. InlB взаимодействует с несколькими эукариотическими рецепторами: gC1qR (Braun et al., 2000), c-Met и гликозоаминогликаном (GAGs) (Jonquieres et al., 2001). Наиболее важным для активной инвазии листерий в клетки является рецептор тирозиновой киназы c-Met – физиологический рецептор для фактора роста гепатоцитов (HGF). Активация c-Met его физиологическим лигандом - фактором роста гепатоцитов обуславливает как клеточное деление, так и клеточное рассеивание. Оба процесса являются ключевыми в эмбриогенезе, физиологическом росте и репарации мягких тканей (Corso et al., 2005).

В процессе инфекции продуцируемый листериями InlB присутствует в двух формах: растворимой и связанной с бактериальной поверхностью. При этом взаимодействие c-Met c InlB, связанным с бактериальной поверхностью, активирует нижележащие сигнальные пути, вызывая перестройку актина и, как следствие, приводит к формированию фагосомальной чаши и интернализации бактерии (Bonazzi, Cossart, 2006). В отличие от связанной с поверхностью бактерии формы InlB, растворимая форма InlB ведет себя как фактор роста. Кластеризующийся на поверхности клетки-хозяина растворимый InlB опосредует димеризацию c-Met и его сильную активацию, аналогичную той, что происходит при взаимодействии c-Met с его нормальным лигандом - фактором роста гепатоцитов, HGF. В результате взаимодействия InlB с c-Met происходит активация нижележащих сигнальных путей, в том числе MAPK-каскада, PI3K/Akt-пути и STAT-пути (Mungunsukh et al.,2010). Формирования фагосомальной чаши при этом не происходит.

До настоящего времени процессы активации c-Met изучались преимущественно с точки зрения роли этого события в активной инвазии листерий в непрофессиональные фагоциты с участием связанной с

бактериальной поверхностью формой. Вместе с тем, очевидно, что активация перечисленных выше сигнальных путей растворимой формой InlB может влиять как на процессы инвазии, так и приводить к эффектам, не связанным с инвазией, но влияющим на системную инфекцию через изменения в экспрессии факторов, контролируемых, в частности, PI3K/Akt- и STAT-сигнальными каскадами. Потенциал InlB как возможного средства терапии также не был исследован.

Хотя исследования активности очищенного InlB проводили в нескольких лабораториях, был использован один вариант InlB, характерный для типового штамма EGDe. Ранее в нашей лаборатории были описаны альтернативные природные варианты InlB, встречающиеся в изолятах листерий, выделенных из клинического материала и природных очагов (Zaytseva et al., 2007, Adgamov et al., 2012, Voronina et al., 2015). Было показано, что изогенные рекомбинантные штаммы листерий, экспрессирующие различные варианты InlB, различаются по вирулентности, что указывает на потенциальные различия в функциональной активности вариантов (Собянин и др., 2016). Однако исследований функциональной активности очищенных препаратов InlB, и, в частности, эффекта природных вариантов InlB на сигнальные системы эукариотической клетки до настоящего времени не проводилось.

Цель настоящего исследования: оценить влияние природных вариантов интерналинового домена интерналина В на модуляцию каскадных внутриклеточных сигналов в клетках человека и других млекопитающих, а также изучить возможность использования InlB для регенерации эпителиальных тканей млекопитающих.

Для достижения этой цели необходимо решить следующие задачи:

1. Клонировать различные аллели гена inlB из клинических штаммов L. monocytogenes в E. coli, создать рекомбинантные штаммы-продуценты,

продуцирующие разные варианты c-Met - связывающего фрагмента интерналина В (idInlB) и получить его очищенные препараты.

2. Изучить воздействие природных вариантов idInlB на митотическую
активность, перестройки цитоскелета и подвижность эпителиальных и
эндотелиальных клеток человека и других млекопитающих.

3. Изучить влияние природных вариантов idInlB на сигнальные каскады в
цитоплазме эукариотических клеток.

4. Оценить эффект очищенных препаратов idInlB на продукцию
интерферонов первого типа макрофагами и эпителиальными клетками.

5. Оценить эффект очищенных препаратов idInlB на процессы заживления
ран у лабораторных животных.

Научная новизна

Впервые получена коллекция штаммов-продуцентов E.coli, продуцирующих природные варианты idInlB.

Показано, что природные варианты интерналинового домена интерналина В, отличающиеся по аминокислотным последовательностям, оказывают различные эффекты на клетки человека и наблюдаемые эффекты являются клеточноспецифичными.

Впервые установлена возможность применения природных вариантов idInlB для ускорения заживления поверхностных ран у лабораторных животных. При этом обработка ран экспериментальных животных очищенными препаратами idInlB сокращала процесс заживления на 2 дня.

Практическая значимость

Практическая значимость работы заключается в создании штаммов-продуцентов природных вариантов idInlB на основании штамма Escherichia coli BL21, трансформированного плазмидами pET28b-idInlBallele13, pET28b-idInlBallele14, pET28b-idInlBallele9, кодирующими варианты idInlB.

Созданные штаммы-продуценты защищены патентом (№ 2634416 от 26 октября 2017 г). Полученные положительные предварительные результаты по исследованию влияния интерналинов на пролиферативную активность эукариотических клеток и процессы заживления ран могут быть использованы для создания лекарственных препаратов, используемых в регенеративной медицине. Получены акты внедрения: Результаты кандидатской диссертации включены в курс лекций для обучения школьников, клинических ординаторов, инфекционистов, терапевтов, врачей общей практики и других специальностей на образовательных циклах «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» и ООО «ЦДП «Парамита»».

Методология и методы исследования

Методологией исследования является экспериментальная работа по
анализу белков аналогичных природным вариантам интерналинового домена
интерналина В L. monocytogenes с использованием бактериологических,
культуральных, биохимических, молекулярно-генетических,

иммуноферментных и биологических методов. Данные обрабатывали с помощью компьютерного и статистического анализа.

Положения, выносимые на защиту

1. Активация внутриклеточных сигнальных путей, митотическая активность, перестройка цитоскелета и подвижность эпителиальных и эндотелиальных клеток млекопитающих зависят от аллельного варианта idInlB, взаимодействующего с эукариотическими рецептором c-Met. Наблюдаемые эффекты зависят от клеточной линии, на которой экспрессируется рецептор, и являются, по-видимому, клеточноспецифичными.

2. Разные аллельные варианты idInlB опосредуют различный уровень продукции интерферонов первого типа, что может быть одной из причин

различного влияния вариантов InlB на развитие и продолжительность системной инфекции. 3. idInlB9 способствует более быстрому заживлению раневых поверхностей и может быть использован для разработки средств, ускоряющего регенерацию эпителиальных тканей.

Личный вклад автора состоит в самостоятельном проведении всех исследований, которые представлены в данной работе, а так же в обобщении, анализе и статистической обработке полученных данных, в подготовке и написании публикаций, в том числе в англоязычной литературе.

Степень достоверности и апробация результатов

Степень достоверности результатов проведенного исследования определяется соответствием его критериям: репрезентативностью выборки количества повторов исследований и использованием современных аналитических методов исследования. Примененные статистические методы адекватны поставленным задачам, а сформулированные выводы аргументированы и логически вытекают из анализа полученных данных. Результаты работы были доложены на 4 зарубежных конференциях и 1 Российской конференции с международным участием: «19th Problems of Listeriosis Conference 2016 ISOPOL», France-Paris, 2016; «68th Annual Meeting of the DGHM», Germany-Ulm, 2016; «III Национального конгресса по регенеративной медицине», г. Москва, 2017; «7th Congress of the European Microbiologists FEMS», Spain-Valencia, 2017; «42^nd FEBS Congress from molecules to cell and back», Israel-Jerusalim, 2017

В завершенном виде работа была апробирована и рекомендована к защите на заседании отделов медицинской микробиологии, природно-очаговых инфекций, генетики и молекулярной биологии бактерий «Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени

почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации «15» февраля 2018 года.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 4 статьи, 2 из них в журналах рекомендованных ВАК, 2 из них в зарубежных изданиях, а также 4 тезисов.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение полученных результатов, выводы и список литературы, включающий 4 работы отечественных и 139 зарубежных авторов. Работа содержит 39 рисунков и 13 таблиц.

Бактериальные штаммы и культуры клеток. Объектами исследований служили штаммы бактериальных культур из коллекции лаборатории экологии возбудителей инфекции ФГБУ НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава РФ. В генноинженерных работах были использованы штаммы Listeria monocytogenes VIMHA015, VIMHA034 из коллекции, типовой штамм Listeria monocytogenes EGDe (серовар 1/2a) и его изогенный вариант с делецией гена inlB Listeria monocytogenes EGDeinlB, любезно предоставленные Dr. J.Vazquez-Boland, Univ. Bristol, UK, также использовались изогенные штаммы Listeria monocytogenes, ранее полученные в нашей лаборатории (Собянин К., 2016) и коммерческие штаммы Escherichia coli JM109 и Escherichia coli BL21. Объектами исследования эукариотических клеток послужили перевиваемая клеточная линия HEp-2, а также культура первичных эндотелиоцитов человека HUVEC и перитонеальные макрофаги мыши.

Условия культивирования. L. monocytogenes культивировали на сердечно-мозговом агаре (BHI, BD), при 37С. Культивирование E.coli проводили на жидкой и твердой питательных средах Луриа-Бертани (LB)(Amresco, США). Культивирование штаммов E. coli BL21, содержащих плазмиду pET28b, проводили на жидкой и твердой питательных средах LB c добавлением антибиотика канамицина в концентрации 100мкг/мл. Рекомбинантные штаммы, несущие вектор pGem-T Easy, культивировали на среде LB c добавкой ампициллина 200мкг/мл, IPTG-0,1М, X-Gal-50мкг/мл. Культивирование в бульоне проводили с шутелированием при 200 об/мин.

Эукариотические клетки выращивали в среде DMEM с добавлением 2% сыворотки при 37С в 5% СО₂ атмосфере.

Приготовление лизатов L. monocytogenes для ПЦР. Лизаты готовили как описано в (Карпова и др., 2003).

Полимеразная цепная реакция. ПЦР проводили в термоциклере Терцик (ДНК-технология, Россия).

Электрофорез в агарозном геле. Электрофорез проводили в 1 % агарозном геле, приготовленном на основе трис-ацетатного буфера, с добавлением бромистого этидия до 0,5 мкг/мл.

Рестрикция и Лигирование. Клонирование ПЦР-продукта в вектор pGemTEasy осуществлялось с помощью набора pGEM-T Easy Vector Systems (Promega, США). Инкубировали реакционную смесь 18 час при 37⁰С. Лигирование в вектор рET28b осуществляли T4ДНК лигазой (Fermentas, Литва). Рестрикцию ДНК осуществляли эндонуклеазами HindIII и BamH1(Fermentas, Литва).

Выделение плазмидной ДНК. Для выделения плазмидной ДНК использовался набор БиоСилика. Подготовку проб к сиквенированию проводили по рекомендации Центра коллективного пользования «ГЕНОМ».

Подготовка компетентных клеток для электропорации. E. coli выращивали и готовили для электропорации, как описано в руководстве к прибору Gene Pulse Xcell (BioRad).

Подготовка культуры для инфицирования эукариотических клеток.

Культуру готовили как описано в (Sysolyatina et al., 2015).

Электропорация. Трансформацию компетентных клеток проводили методом электропорации с помощью прибора Gene Pulse Xcell (BioRad), при следующих условиях: для E.coli использовали условия, предложенные производителем прибора. Для L.monocytogenes расстояние между электродами 2 мм, напряжение 2кВ, емкость 25мкф, сопротивление 400 Ом. Количество ДНК, используемое для трансформации, составляло 5-7 нг.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле. Разделение белков проводили методом вертикального гель-электрофореза в полиакриламидном геле с использованием вертикальной электрофорезной камеры BIO-RADMini-PROTEANTetraCell («BIO-RAD», США) согласно инструкции производителя. Образцы готовили в буфер для нанесения образцов 1X Леммли кипячением в течение 5 минут.

Очистка рекомбинантного белка, несущего метка His-tag. Для очистки 6х His белка использовались магнитные наночастицы Dynabeads (Invitrogen, CША) согласно инструкции производителя.

Методика проведения иммуноблотинга белков. Для проведения иммуноблотинга образцы готовились с использованием RIPA буфера. Образцы после завершения электрофореза переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad, Германия). Для переноса использовали камеру для электропереноса (Bio-Rad, Германия). Блокировка мембраны и инкубация с антителами осуществлялась согласно инструкции производителя (Abcam, Cell Signaling).

МТТ-тест. Клетки ресуспендировали в культуральной среде в концентрации 2 х 10⁴ кл/мл. Добавляли по 100мкл в лунки. В лунки вносили рекомбинантные белки idInlB14, idInlB13 и idInlB9 в концентрации от 1 мкг/мл до 125 нг/мл. В качестве положительного контроля использовали фактор роста гепатоцитов (HGF) в концентрации от 50 до 150 нг/мл. Отрицательный контроль – клеточная суспензия в культуральной среде. Клетки инкубировали 48 ч во влажной камере с содержанием 5% СО₂ при 37 С. На третий день количество жизнеспособных клеток оценивали добавлением по 10 мкл МТТ (5 мг/мл) в каждую лунку. Результат теста оценивали измерением оптической плотности при длине волны 540 нм.

Оценка митотического индекса эукариотических клеток с использованием флуоресцентной микроскопии. Клетки линии HЕp-2 и HUVEC наносили на покровные стекла в количестве 20000 клеток/стекло и инкубировали 18ч. Клетки инкубировали 6 часов, после добавления агонистов с-Met. Ядра окрашивали витальным красителем Hoechst (1 мкг/мл).

Оценка перестройки цитоскелета с использованием флуоресцентной микроскопии. Клетки линии HЕp-2 и HUVEC наносили на покровные стекла в количестве 20000 клеток/стекло и инкубировали 18ч. Клетки инкубировали 6 часов, после добавления агонистов с-Met. Спустя 6 ч инкубации клетки отмывали дважды PBS и окрашивали фаллоидином (Alexa Fluor 555 Phalloidin, США) согласно инструкции производителя.

Оценка активации нижележащих путей с использованием коммерческого ИФА-анализа. Оценку эффекта рекомбинантных белков на активацию внутриклеточных сигналов проводили с использованием коммерческого набора InstantOne ELISA ERK/AKT/p70S 6K Activation (Invitrogen, США) согласно инструкции производителя на клеточных линиях HEp-2 и HUVEC.

Оценка скорости заживления скарифицированных ран с использованием мышиной модели. На спинной стороне предварительно проводили процесс удаления шерсти. Затем верхний слой кожи удаляли путем абразивной обработки с помощью наждачной бумаги. Данная процедура проводилась под эфирным наркозом. Затем на раневую поверхность наносили по 50 мкл суспензии idInlB14 и idInlB9 в концентрации 300 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля использовали стерильный глицерин.

Определение уровня бета интерферона после инкубации культуры первичных макрофагов с различными природными вариантами интерналинового домена. Определение уровня продукции интерферонов первого типа проводили коммерческим набором VeriKine Mouse IFN Beta ELISA Kit (PBL Assay science).

Статистические методы. Средние значения и стандартные ошибки подсчитывались в программе Microsoft Excel 2007. Для оценки статистической значимости использовали Ttest, включенный в то же программное обеспечение.

Структурно-функциональная характеристика факторов инвазии семейства интерналинов

Генерализованные формы листериоза связаны с пересечением эпителиальных барьеров:

- эпителиального барьера кишечника – пересечение этого барьера – критический момент инфекции, необходимый для проникновения возбудителя, попавшего в кишечник вместе с контаминированными пищевыми продуктами, во внутреннее пространство организма;

- плацентарного барьера – пересечение этого барьера является ключевым этапом в развитии перинатальных форм листериоза;

- гематоэнцефалического барьера – критическая стадия развития листериозного менингита и менингоэнцефалита. Интерналин А (InlА) и InlВ – первые белки, выявленные как медиаторы вхождения листерий в различные клеточные линии непрофессиональных фагоцитов и как два основных белка процесса инвазии листерий. Оба белка принадлежат семейству интерналинов, богатых лейциновыми повторами. InlА содержит LPXTG мотив, предсказывающий ковалентное связывание белка в клеточной стенке через сортазо-зависимый механизм. Рецептором клетки-хозяина для InlА является Е-кадгерин, трансмембранный гликопротеин, участвующий в межклеточной адгезии эпителиальных клеток (Mengaud et al., 1996). Для образования и поддержки InlA/Е-кадгерин необходима целостность цитоплазматического домена Е-кадгерина, который связывает катенины (, и р120), взаимодействующие с актиновым цитоскелетом. При проникновении листерий в клетку терминальные 35 аминокислот Е-кадгерина связываются с -катенином, который объединяется с -катенином, который в свою очередь, взаимодействует с актином (Lecuit et al., 1997). Полимеризация актина при интерналин-опосредованной инвазии является Rac-зависимым процессом и происходит через Arp2/3 комплекс (da Silva Tatley et al., 2003). Rac- (GTP-связывающие белки) и Arp- (actin-related proteins – актиноподобные белки) белки являются компонентами системы полимеризации актина эукариотических клеток и необходимы для перестройки цитоскелета (Bonazzi et al., 2008). Для проникновения внутрь клетки также необходимы миозин VIIa и его лиганд везатин (Sousa et al., 2004). Вероятно, эти два белка участвуют в процессе образования фагосомальной инвагинации. Также взаимодействие InlА/Е-кадгерин, активирует Src киназу клеток хозяина, приводя к полимеризации клатрина и последующей полимеризации актина опосредуя Е-кадгериновый эндоцитоз. Взаимодействие InlА с Е-кадгерином является видоспецифичным и в организме человека играет существенную роль благодаря остаткам пролина в 16 положении молекулы Е-кадгерина. В противоположность этому, мышиный Е-кадгерин не может взаимодействовать с InlА, поскольку пролин заменен остатком глутаминовой кислоты (Lecuit et al., 1999). Эпидемиологические исследования показали, что InlА играет ключевую роль в развитии листериоза у людей: 96% клинических штаммов экспрессируют полноразмерную функциональную форму InlА, в то время, как только 65% штаммов, изолируемых из продуктов питания, содержит полную форму. Взаимодействие InlА с Е-кадгерином имеет решающее значение для вторжения в эпителиальные клетки, так как активизирует сложные сигнальные пути, ведущие к реорганизации цитоскелета (Pentecost et al., 2010).

Белок InlB с молекулярной массой 65 кДа необходим для инвазии бактерий в гепатоциты. Этот поверхностный белок также принадлежит к LRR семейству белков. Это единственный из этого семейства белок, который нековалентно связан С-концевым доменом, содержащим GW повторы, с клеточной стенкой через поверхностные липотейхоевые кислоты (Braun et al., 1997). Для InlB были определены различные рецепторы хозяина: gC1qR, c-Met и гликозоаминогликаны (GAGs). Наиболее важным является взаимодействием интерналина В с рецептором тирозиновой киназы c-Met, который является физиологическим рецептором для фактора роста гепатоцитов. Через свои GW модули растворимый InlB непосредственно связывается с эукариотическими GAGs. GAG рецепторы способствуют отделению InlB от бактериальной поверхности и кластеризации InlВ на поверхности клетки-хозяина, тем самым опосредуя сильную активацию c-Met и бактериальную инвазию. Взаимодействуя с нормальным лигандом (фактором роста гепатоцитов, HGF), c-Met димеризуется и фосфорилирует два важных аминокислотных остатка, действующих как стыковочные участки для приема сигналов и адапторных молекул (Ireton et al., 1999). То же происходит при взаимодействии c-Met с LRR-повторами InlB. Для оптимальной активности c-Met необходимо наличие глюкозаминогликанов (GAG) на поверхности клетки, необходимых для олигомеризации фактора роста и/или его защиты от внеклеточных протеаз (Jonquieres et al., 2001). Наличие GAG способствует повышению инвазии листерий в клетки. Контакт c-Met и InlB инициирует нуклеацию актина и его полимеризацию через малые ГТФазы Rac-семейства и Arp2/3 комплекс (Bierne and Cossart, 2002; Cossart and Sansonetti et al., 2004). В процесс элонгации актина, который создает движущую силу для выпячивания мембраны, вовлечен белок VASP, влияющий на ориентацию полярных концов актина, а также кофилин, который ускоряет обновление актина через инициацию его деполимеризации на острых концах филаментов и создание новых свободных концов для полимеризации путем разрезания актиновых филаментов (Suei et al., 2011). Таким образом, InlB является сигнальным белком, который действует как инвазин. Но также он может усиливать действие других бактериальных факторов, вовлеченных в инвазию и тканевой тропизм, таких как InlA (Bierne, Cossart, 2002; Cossart, Sansonetti, 2004). Хотя InlB связывается с несколькими рецепторами, считается, что c-Met является основным. При взаимодействии с c-Met, InlB вызывает убиквитинирование c-Met и бактериальную интернализацию через механизм клатрин-опосредованного эндоцитоза.

Таким образом, взаимодействие белков семейства интерналинов - InlA и InlB - с узнаваемыми ими рецепторами опосредует критический шаг листериозной инфекции – пересечение эпителиального барьера кишечника и плацентарного барьера, что определяет важность роли этих факторов патогенности листерий.

Другой важный аспект InlA и InlB – это их роль в ткане - и хозяин-специфичности листерий. Несмотря на то, что Met и Е-кадгерин являются консервативными белками, присутствующими у широкого спектра не только млекопитающих, но других многоклеточных организмов, между рецепторами существуют межвидовые различия. Например, в Е-кадхерине мышей и крыс в 16 положении находится остаток глутаминовой кислоты (Glu), в то время как в Е-кадгерине человека в данной позиции расположен пролин (Pro). Замена на глутаминовую кислоту полностью ингибирует взаимодействие с InlA. В результате InlA не активен в клетках мышей и крыс и не играет роли при инфекции этих грызунов (Lecuit et al., 1999). Более того, замена Glu/Pro в мышином рецепторе достаточна, чтобы обеспечить взаимодействие с InlA (Disson et al., 2009). Линии гуманизированных мышей с такой заменой были использованы для изучения деталей пересечения кишечного и плацентарного барьера (Pentecost et al., 2010). Интересно, что Е-кадгерин морских свинок и кроликов несет в 16-м положении пролин, как и белок человека, что позволяет InlA эффективно взаимодействовать с рецепторами этих грызунов. Напротив, видоспецифические, но еще не установленные черты рецептора с-Met морских свинок и кроликов, препятствуют взаимодействию с ними InlB листерий, который эффективно взаимодействует с рецептором человека и мышей (Khelef et al., 2006).

Таким образом, интерналины InlA и InlB не только осуществляют критические шаги листериозной инфекции, а именно, активную инвазию в непрофессиональные фагоциты и пересечение эпителиального барьера кишечника и плацентарного барьера, но и определяют специфичность листерий в отношении организмов хозяев. В целом это определяет интерес к этим факторам с точки зрения экологии возбудителя и изучения механизмов, лежащих в основе полигостальности листерий.

Использование бактериальных продуктов в терапевтических целях

Ранние исследования по возможности регенерации тканей млекопитающих осуществлялись с использованием экзогенных цитокинов. Одним из таких разрабатываемых продуктов являлся фактор роста гепатоцитов.

Фактор роста гепатоцитов (HGF) – это протеин, являющийся сильным митогеном для гепатоцитов и участвующий в регенерации печени. Зрелая молекула HGF состоит из двух цепей ( и ). В структуре белка имеется N-концевая шпилька, 4 крингл-домена (домены типа «двойная петля») и домен, гомологичный сериновым протеазам (SPH) (рисунок 7). Функционально активный HGF предусматривает правильную сборку в конформацию, содержащую 20 дисульфидных связей (Bottaro et al., 1991).

Одним из подходов к контролируемой регенерации тканей является использование экзогенного HGF как индуктора пролиферации клеток. Использование экзогенного агониста c-Met, фактора роста гепатоцитов HGF для ускорения регенерации органов и тканей было продемонстрировано в начале 1990-х, и успешно проверено в ряде исследований (Ishiki et al., 1992, Kawaida K. et al., 2004). Несмотря на то, что в экспериментальных моделях HGF эффективно способствовал регенерации, о переводе исследований в клиническую фазу было сообщено только в 2014 (http://www.kringle-pharma.com/en/). Основным недостатком при использовании очищенного экзогенного HGF является короткое время нахождения фактора в кровяном русле, не превышающее 3-5 минут, а использование ДНК-вакцин ограничивается потенциальными канцерогенными и аутоиммунными эффектами (Lee et al., 2014).

Другой проблемой терапевтического использования HGF является сложность его полноценной структуры. Были сделаны попытки (Cioce et al., 1996, Day et al., 1999) использовать небольшие фрагменты молекулы HGF, такие как NK1 и NK2, естественно встречающиеся изоформы HGF, которые содержат только N-концевую шпильку и первый или первый и второй крингл-домены соответственно. Хотя NK1 и стимулирует подвижность, жизнеспособность и пролиферацию, но его эффективность ниже, чем у полноценного HGF (Cioce et al., 1996). Активация NK2 рецептора способствует лишь подвижности. Важно отметить, что, несмотря на малый размер, крупномасштабное производство NK1 и NK2 пока еще невозможно, так как их синтез с помощью бактерий требует продолжительных и дорогих ступеней рефолдинга и ренатурации, чтобы достичь правильной конформации (Stahl et al., 1997).

В современной медицинской микробиологии большую важность приобретает новое направление исследований - разработка лекарственных препаратов на основе бактериальных белков, осуществляющих специфические взаимодействия с эукариотическими мишенями. Так, например, местные инъекции ботулинического токсина типа А в настоящее время используются в лечении постинсультной спастичности и способствуют облегчению синдрома «болезненного плеча» (Agafonova, Khasanova, 2014). Бактериальный липополисахарид Salmonella typhi исследовался в качестве средства, ускоряющего эпителизацию ран, и активатора секреции эпидермального фактора роста (Костарной А. и др., 2012). Тиол-зависимый гемолизин Streptococcus pyogenes (Стрептолизин О) был использован как средство для сглаживания шрамов (Mamber et al., 2004) и ингибитор миграции опухолевых клеток (Hall et al., 2011). Сигнал чувства кворума Pseudomonas aeruginosa N-3-додеканоил-гомосерин-лактон, как было продемонстрировано, ускоряет заживление ран, влияя на дифференциацию миобластов (Nakagami et al., 2010). Бактериальные носители на основе авирулентных штаммов Salmonella typhimurium используются для лечения глиобластомы (Mehta N. et al., 2016). В качестве потенциальной стратегии нового ускорения консолидации костной ткани у пациентов, проходящих лечение рассеянного остеогенеза может применяться Стафилококковый энтеротоксин С2 (SEC2) (Xu et al., 2016).

На сегодняшний день в микробиологии, промышленной технологии, и медицине уделяется внимание новым способам и методам использования микроорганизмов и их продуктов жизнедеятельности: создание микробиологических биореакторов для получения «зеленого топлива», очистка сточных вод с использование генно-инженерных штаммов микроорганизмов, разработка лекарственных препаратов на основе бактериальных продуктов. Все передовые и современные исследования в этих областях способствуют улучшению экономических показателей, повышают уровень и качество жизни людей и пациентов. Исследования в области взаимодействия микроорганизма с макроорганизмом на молекулярном уровне - это новый шаг в развитии современной микробиологии. В связи с этим, полученные в результате исследований данные расширяют представление о факторах патогенности L. monocytogenes. А проведенные в данной работе исследования были прежде всего направлены на изучение различий в функциональной активности природных вариантов интерналинового домена интерналина В, а также на оценку регенеративного потенциала интерналинового домена интерналина В.

Влияние вариантов idInlB на пролиферацию перевиваемых и первичных клеточных линий

Клетки человека HEp-2 несут на поверхности рецептор c-Met и усиливают пролиферацию в присутствии природного агониста c-Met, фактора роста гепатоцитов (Bierne H. and Cossart P., 2002). Кроме того, эта клеточная линия часто используется для анализа цитотоксичности иммунобиологических продуктов. Поэтому эти клетки были использованы нами в качестве модели для изучения различий в активности вариантов idInlB.

Первостепенно для определения рабочих концентраций рекомбинантных белков, способных влиять на пролиферацию клеток, был использован MTT-тест, позволяющий оценить число метаболически активных клеток в зависимости от концентрации лиганда. Через 72 часа после начала эксперимента максимальным эффектом, согласно МТТ-тесту, обладали белки idInlB в концентрации 250 и 125 нг/мл (таблица 10). Более высокие концентрации внесенных белков, по-видимому, обладали токсическим эффектом. Аналогично, высокая концентрация HGF (150 нг/мл) была менее эффективна, чем концентрация 100 нг/мл. Одним из возможных объяснений наблюдаемой нелинейной зависимости эффекта от концентрации могут быть достаточно сложные последствия активации c-Met, в определенных условиях приводящие к апоптозу клеток (Sun et al., 2013). Статистически значимых различий между вариантами согласно MTT-тесту выявлено не было.

Таблица 10. Оценка жизнеспособности клеток HEp-2 по результатам МТТ теста через 72 часа после внесения HGF или idInlB к клеткам. Показаны средние значения оптической плотности, р 0,05.

Используя флуоресцентную микроскопию провели подсчет числа делящихся клеток в поле зрения и оценку митотического индекса (процента делящихся клеток от общего числа проанализированных клеток). Для отрицательного контроля величина митотического индекса составила 1,2%, для положительного контроля в присутствии фактора роста гепатоцитов эта величина равнялась 14,10% (рисунок 16). Митотический индекс клеток, обработанных вариантами idInlB, был достоверно (р 0,05) выше, чем в отрицательном контроле: idInlB9 - 20,8%, idInlB14 – 20,00 %, idInlB13 – 8,6 %. Для idInlB14 и idInlB9 митотический индекс был достоверно (р 0,05) выше, чем для фактора роста HGF.

Белки IdInlB и HGF добавлены к клеткам HEp-2 в концентрациях 250 нг/мл и 100 нг/мл, соответственно. Делящиеся клетки наблюдали через 6 часов после добавления белков. Показан митотический индекс (отношение числа делящихся клеток к общему числу клеток в поле зрения). Данные получены усреднением по минимум 10 полям зрения в трех независимых экспериментах.

Анализ состояния ядер выявил в образцах, обработанных фактором роста гепатоцитов и вариантами idInlB, клетки на разных стадиях деления (рисунок 17). Помимо различий в процентах делящихся клеток, для каждого действующего фактора были выявлены специфические цитологические изменения в состоянии ядра. Так, в отрицательном контроле все ядра имели ровную форму и содержали по 1-2 ядрышку. В положительном контроле клетки, обработанные фактором роста гепатоцитов, имели ядра с неровной формой, которые выглядели рыхло, что может соответствовать начальным этапам митоза - ранней профазе. В тоже время, большинство ядер в клетках, обработанных вариантами idInlB, имели ровную форму, характерную для контроля, и лишь некоторые – неровную, описанную выше. Различия между HGF и вариантами бактериальных белков могут свидетельствовать о том, что эффект idInlB зависит от дополнительных параметров.

Изменения в состоянии ядер клеток HEp-2 в присутствии очищенных препаратов белков idInlB или фактора роста гепатоцитов. Ядра клетки окрашивали красителем Hoechst через 6 часов после добавления белков. HGF в концентрации 100 нг/мл, стрелки показывают характерные изменения ядра; idInlB9 в концентрации 250 нг/мл, стрелки показывают на ядра в метафазе и начале анафазы; idInlB13 в концентрации 250 нг/мл, стрелка указывает на ядро в анафазе; idInlB14 в концентрации 250 нг/мл, стрелка указывает на ядро в анафазе.

Аналогично, добавление белков в концентрации 1 мкг/мл вызывало специфические цитологические изменения состояния ядер, характерные для фаз митотического цикла. Процессы фрагментации ядерного аппарата, которые могли бы свидетельствовать об апоптозе, не наблюдались.

В целом сравнительный анализ пролиферативной активности природных вариантов idInlB показал, что все они обладают способностью влиять на пролиферацию клеток HEp-2. Впервые было показано, что природные варианты idInlB отличаются по своей пролиферативной активности. Полученные результаты подтверждают потенциал idInlB как агента, способного ускорять пролиферацию некоторых типов клеток человека. Однако выявленная цитотоксичность в условиях пролонгированной инкубации клеток с высокими концентрациями рекомбинантных белков должна быть учтена в дальнейших исследованиях.

Для оценки влияния вариантов интерналинового домена на пролиферацию первичных клеток использовали МТТ-тест на клетках HUVEC. В первой схеме эксперимента клетки ресуспендировали в среде, адаптированной для ведения первичных эндотелиоцитов. При использовании данной среды установить влияние агонистов рецептора фактора роста гепатоцитов на пролиферативную активность не удалось, так как полученные значения были идентичны интактному контролю, культивированному на полноценной адаптированной среде (RPMI+EGF). Очевидно, наличие в полноценной среде всех компонентов, необходимых для культивирования HUVEC нивелирует значение посторонних внешних стимулов. В измененной схеме клетки в концентрации 2 x 104 кл/мл ресуспендировали в культуральной среде DMEM, содержащей 2% бычью сыворотку. В лунки вносили рекомбинантные белки idInlB14, idInlB13 и idInlB9 в концентрации от 125 нг/мл до 1 мкг/мл. В качестве положительного контроля использовали фактор роста гепатоцитов HGF в концентрации от 100 нг/мл. В таблице 11 представлены средние значения оптических плотностей в МТТ-тесте.

Для подтверждения отсутствия немедленной цитотоксичности был проведен подсчет митотического индекса при максимальной концентрации белка 1мкг/мл спустя 6 часов после добавления агонистов рецептора c-Met. Для всех образцов зафиксировать делящиеся клетки в полях зрения не удалось, так же не было различий и в морфологии ядер, что косвенно подтверждает отсутствие апоптотических изменений.

Анализ активации внутриклеточных сигналов

Оценка влияния вариантов интерналинового домена на активацию внутриклеточных сигнальных путей после взаимодействия рекомбинантного белка с эукариотическим рецептором c-Met проводилась на клеточной линии НЕр-2. Согласно литературным данным, оптимальное время взаимодействия агонистов с рецептором для активации последнего составляет 15 минут (Mungimsukh О. et al., 2010).

Используя флуоресцентную микроскопию, провели анализ фосфорилирования тирозиновых остатков эукариотическорго рецептора с-Met в положениях 1230-1234-1235 (рисунок 22). Активация рецептора происходит в результате его димеризации, после связывания с лигандом, что приводит к аутофосфорилированию тирозиновых остатков в положениях 1234 и 1235 (Rodrigues G., 1994). Это способствует последующему фосфорилированию тирозиновых остатков в положениях 1349 и 1356 и, как следствие, к активации различных сигнальных эффекторов, включая белковые адаптеры GRB2 (Growth factor receptor-bound protein 2), SHC (Src homology-2-containing), CRK (v-crk sarcoma virus CT10 oncogene homology) (Bray A. et al., 2009). Дополнительные тирозины также могут способствовать передаче сигналов c-Met. Фосфорилирование Y1313 приводит к активации PI3K, что, вероятно, способствует жизнеспособности и подвижности клеток (Tsao et al., 2011). Результаты микроскопических исследований показывают, что максимальным эффектом на первичное аутофосфорилрование с-Met по остаткам 1234-1235 обладают варианты idInlB13 и idInlB9, фактор роста гепатоцитов и idInlB14 также приводят к усилению фосфорилирования по сравнению с отрицательным контролем.

Для подтверждения полученных результатов было использовано количественное определение эукариотического рецептора c-Met и уровня интенсивности фосфорилирования тирозиновых остатков в положениях 1349 и 1356 методом иммуноблотинга. Клеточные лизаты линии HEp-2 разделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле (рисунок 23), после чего осуществляли перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану согласно материалам и методам. Результаты Вестерн-блотинга, полученные с помощью поликлональных моноспецифических антител (Abcam) показали, что все полученные варианты idInlB стимулируют фосфорилирование с-Met в положении тирозина 1349 приблизительно на одинаковом уровне, соответствующем уровню, наблюдаемому при воздействии на клетки природного лиганда c-Met, фактора роста гепатоцитов (рисунок 24).

Результаты Вестерн-блотинга на клетках HUVEC, полученные с помощью поликлональных моноспецифических антител (Abcam) показали, что все полученные варианты idInlB стимулируют фосфорилирование с-Met в положении тирозина 1349 приблизительно на одинаковом уровне, соответствующем уровню, наблюдаемому при воздействии на клетки природного лиганда c-Met, фактора роста гепатоцитов (рисунок 25).

Если интенсивность сигнала достаточна, то после активации рецептора происходит запуск внутриклеточных сигнальных путей. Среди главных внутриклеточных сигнальных путей, запускаемых в результате активации c-Met, можно выделить: MAPK-каскад, PI3K/Akt-путь и STAT-путь.

Каскады MAPK (митоген-активированная протеинкиназа) являются центральными сигнальными путями, которые регулируют широкий спектр клеточных процессов, включая пролиферацию, дифференцировку, апоптоз и реакцию на стресс. В настоящее время идентифицированы четыре различных MAPK каскада млекопитающих, названные по их компонентам: внеклеточная сигнальная киназа 1 и 2 (ERK1 / 2), c-Jun N-терминальная киназа (JNK), p38, и ERK5. Для оценки активации МАРК-каскада использовали антитела к фософорилированным формам центральных киназ каскада - Erk1/2 (фосфорилирование по положению Erk 1 (pT202/pY204) + Erk 2(pT185/pY187)). После 15-минутного воздействия очищенных белков idInlB на клетки НЕр-2 проводили процедуры фиксации и окраски клеток антителами, а сам анализ осуществлялся с использованием флуоресцентной микроскопии. Результаты эксперимента представлены на рисунке 26. В образце, инкубированном с idInlB14 наблюдалось заметное усиление свечения, при этом наибольшая концентрация фосфорилированных форм Erk1/2 наблюдалась в районе ядра. Инкубация клеток с рекомбинантным белком idInlB9 также приводила к усилению свечения, но область локализации в районе ядра проявлялась не так выражено, как у 14 аллельного варианта. При инкубации клеток с HGF и idInlB13 усиление фосфорилирования Erk1/2 выражено в наименьшей степени и приближается к отрицательному контролю

Для количественного определения активации МАРК - каскада использовали вестерн-блот анализ.

Уровень активации нижележащих сигнальных путей отличался при воздействии различных вариантов idInlB. На рисунке 27 представлены данные иммуноблота, отражающие уровень фосфорилирования Erk1/2. Варианты idInlВ, обозначенные как idInlB14 и idInlB9, оказывали более выраженный стимулирующий эффект на фосфорилирование киназы Erk1/2, контролирующей МЕК1/2/Erk1/2 сигнальный путь, чем idInlB13 и фактор роста гепатоцитов. Степень активации Erk1/2 у idInlB13 и HGF сопоставимы друг с другом. В качестве контроля использовалась оценка уровня бета-тубулина, который во всех образцах был идентичным.

Аналогичное определение уровня фосфорилирования Erk1/2 с использованием флуоресцентной микроскопии было проведено на первичных эндотелиоцитах HUVEC. На рисунке 28 представлены результаты, полученные после 15-минутной инкубации эндотелиоцитов с различными агонистами c-Met. Добавление в среду рекомбинантных белков idInlB14, idInlB13, idInlB9 приводило к усилению фосфорилирования Erk1/2. Наименьшим потенциалом на активацию фосфорилирования обладал фактор роста гепатоцитов, но все же, большим, по сравнению с отрицательным контролем. Полученные результаты по усилению фосфорилирования эффекторных молекул согласуются с результатами, полученными в МТТ-тесте.

Для того чтобы подтвердить наблюдаемые результаты, полученные с использованием флуоресцентной микроскопии и методом Вестерн-блот анализа, по имеющимся различиям в активации фосфорилирования эффектороной молекулы ERK1/2, был проведен ИФА анализ с использованием коммерческой тест системы: InstanatOne ELISA ERK1/2, Akt, p70S 6K (Invitrogen). Результаты ИФА анализа были следующими: после 15 минутной активации клеток линии HEp-2 агонистами рецептора фактора роста гепатоцитов в образцах, обработанных idInlB14 и idInlB9 наблюдалось достоверное усиление фосфорилирования ERK1/2, в то время как образцы, инкубированные с idInlB13 не показали усиления фосфорилирования эффектороной молекулы МАРК-каскада. Фактор роста достоверно увеличивал фосфорилирование ERK1/2 по сравнению с отрицательным контролем, но заметно отставал по активности с рекомбинантными белками, соответствующими 14 и 9 аллелям (рисунок 29).

AKT представляет собой семейство из трех внутриклеточных белков, кодируемых генами AKT1, AKT2, AKT3. АКТ является частью PI3K/AKT/mTOR сигнального пути, который отвечает за уход от апоптоза, а также рост, пролиферацию клеток и регуляцию метаболизма. Результаты анализа показали достоверное увеличение уровня фосфорилирования АКТ в образцах, обработанных idInlB14 и idInlB9, в то время как образцы, инкубированные с idInlB13 и HGF, не обладали потенциалом для усиления фосфорилирования АКТ (рисунок 30).

Еще одним элементом PI3K/AKT/mTOR сигнального пути, является рибосомальная протеинкиназа p70S6K, которая осуществляет фосфорилирование S6. Фосфорилирование S6 индуцирует синтез белка на рибосоме. В данном анализе установить достоверные различия в активации p70S 6K между природными вариантами idInlB и HGF не удалось. Возможно, 15-минутный временной интервал, после которого осуществлялся приготовление образцов эукариотических клеток для ИФА-анализа, является недостаточным для активации данной адаптерной молекулы (рисунок 31).