Введение к работе
з
Актуальность темы исследования
Разработка новых эффективных методов инактивации потенциально опасных микроорганизмов в газах, жидкостях и на поверхностях является одной из важнейших проблем в медицине, промышленности и сфере защиты окружающей среды. Современное состояние исследований в области стерилизации и дезинфекции характеризуется высоким уровнем развития традиционных методов, основанных на использовании термической обработки, фильтрации, применении радиации и химических соединений - биоцидов. В то же время, у каждого из перечисленных методов имеется ряд серьёзных недостатков. Так, считающийся в настоящее время основным средством низкотемпературной стерилизации газообразный оксид этилена токсичен, требует длительного времени воздействия, а также дополнительной дегазации обработанных объектов.
Применение в медицине, пищевой промышленности и биотехнологии новых полимерных материалов, а также приборов и инструментов на их основе требует эффективных, щадящих, дешевых и безопасных методов их стерилизации (Рыбкин В.В., 2000). В этом отношении использование низкотемпературной (холодной) плазмы, генерируемой при атмосферном давлении маломощным электрическим разрядом непосредственно в обрабатываемых жидкостях и газах или на поверхностях стерилизуемых объектов, может представлять особый интерес (Акишев Ю.С. и др., 2006). В ходе обработки плазмой образуется широкий спектр активных агентов: свободные радикалы, активные формы кислорода (озон, атомарный кислород и др.), ультрафиолетовое излучение, электромагнитное поле, заряженные частицы (электроны, положительные и отрицательные ионы) и т.д., способные вызывать гибель микроорганизмов (Laroussi М. et al., 2002).
Степень разработанности темы исследования
Низкотемпературная плазма широко применяется в радиоэлектронных приборах, плазмотронах, газовых лазерах и других устройствах, а также в промышленных технологиях (BellakhalN. et al., 1997). Что касается применения плазмы в медицине при стерилизации инструментов и оборудования и в быту для обработки предметов и поверхностей, то, несмотря на некоторый прогресс, достигнутый на лабораторном уровне (Fridman G. et al., 2008; LaroussiМ., LuX., 2005; LaroussiM. et al., 2006), обработка холодной плазмой при атмосферном давлении с целью уничтожения микроорганизмов пока еще не получила широкого практического применения (Gorre G. et al., 2006; LuX. et al., 2008). На данный момент в литературе практически отсутствуют систематизированные данные о наличии бактерицидного действия холодной плазмы в отношении микроорганизмов разных таксономических групп, а также о механизмах этого воздействия. В связи с вышесказанным, для разработки новой технологии стерилизации и дезинфекции, основанной на применении холодной плазмы, актуальным является изучение чувствительности микроорганизмов разных таксономических групп к бактерицидному действию холодной плазмы, а также выяснение механизмов такого действия. Новые знания позволят обоснованно подходить к выбору
4 оптимальных для конкретных задач источников холодной плазмы и целенаправленно разрабатывать технологии деконтаминации жидкостей, газов и поверхностей предметов (Laroussi М., 2002; Fridman G. et al, 2008).
Цель исследования
Изучение бактерицидного действия низкотемпературной плазмы при атмосферном давлении на микроорганизмы разных таксономических групп при использовании различных типов генераторов.
Задачи исследования
1. Сравнить эффективность разных типов генераторов низкотемпературной
плазмы для инактивации микроорганизмов в разных средах (в жидкости, на
поверхности) и выбрать наиболее перспективный генератор для дальнейших
исследований.
2. Определить оптимальные условия инактивации микроорганизмов
выбранным перспективным генератором низкотемпературной плазмы.
3. Исследовать чувствительность микроорганизмов разных
таксономических групп {Escherichia coli, Serratia marcescens, Pseudomonas
aeruginosa, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Enterococcus hirae,
Mycobacterium flavescens, Candida lypolithica, Aspergillus niger) к обработке
холодной плазмой.
-
Исследовать воздействие холодной плазмы на клеточную оболочку и цитоплазматическую мембрану микроорганизмов на примере Е. coli.
-
Исследовать принципиальные возможности использования генераторов холодной плазмы для деконтаминации поверхностей объектов (электронные приборы, денежные купюры, пищевые продукты).
Научная новизна
Впервые показаны отличия в чувствительности микроорганизмов разных таксономических групп к холодной плазме.
Впервые показана высокая чувствительность природной ассоциации микроорганизмов, выделенной из нефтепромысловых вод, к обработке холодной плазмой.
Впервые показано, что обработка клеток Е. coli холодной плазмой приводит к повреждению клеточной оболочки бактерий.
Впервые получены данные о возможности восстановления повреждений микробных клеток Е. coli и В. subtilis, обработанных плазмой, при культивировании на богатых питательных средах.
Теоретическая и практическая значимость работы
Предложена гипотеза о механизмах инактивации микроорганизмов при воздействии на них холодной плазмой, в основе которой лежит предположение о пороговом количестве повреждений, нанесённых клетке активными компонентами плазмы.
Показано, что увеличение концентрации кислорода в составе плазмообразующего газа усиливает бактерицидное действие холодной плазмы.
Исследования эффективности инактивации микроорганизмов с использованием восьми генераторов плазмы разных типов позволили выбрать наиболее перспективный для решения задач данного исследования генератор холодной плазмы на основе диэлектрического барьерного разряда («ДБР»). Оптимизированы условия прямой (в зоне разряда) и удалённой (вне зоны
5 разряда) обработки поверхностей объектов данным генератором холодной плазмы.
Показано, что для полной инактивации микроорганизмов Е. coli, Е. hirae, P. aeruginosa, S. aureus и Mycobacterium sp. холодной плазмой требовалась на два-три порядка меньшая экспозиция (время воздействия) по сравнению с другими методами деконтаминации (ультрафиолетовое излучение и перекись водорода).
Показана высокая эффективность деконтаминации поверхностей объектов повседневного пользования (электронные приборы и денежные купюры) холодной плазмой, генерируемой установкой «ДБР». Показана принципиальная возможность применения холодной плазмы для инактивации микроорганизмов на поверхности пищевых продуктов.
Материалы диссертации послужили основой для разработки трёх методических рекомендаций: «Разработка и совершенствование различных аппаратов для стерилизации с помощью холодной плазмы, а также оптимизация условий и режимов их практического применения» (Оболенск, 2010 г., учрежденческий уровень внедрения), «Стерилизация продуктов питания низкотемпературной плазмой» (Оболенск, 2012 г., учрежденческий уровень внедрения) и «Стерилизация упаковочного материала и продуктов питания низкотемпературной плазмой с целью увеличения сроков хранения» (Оболенск, 2013 г., учрежденческий уровень внедрения).
Материалы диссертации были использованы в программах подготовки магистрантов Учебного центра Пущинского государственного естественнонаучного института и аспирантов Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии.
Методология и методы исследования
В работе использованы микробиологические, биохимические и биофизические экспериментальные методы исследования (культивирование микроорганизмов, оценка выживаемости микроорганизмов (высев на агаризованные среды, измерение диаметров зон поражения газонов тест-микроорганизмов), метод обработки жидкостей и поверхностей объектов холодной плазмой, спектрофотометрическая оценка целостности цитоплазматической мембраны, метод осмотического шока).
Положения, выносимые на защиту
1. Микроорганизмы разных таксономических групп отличаются по
чувствительности к бактерицидному действию холодной плазмы: наиболее
чувствительны грамотрицательные бактерии Е. coli, S. marcescens,
P. aeruginosa, P. fluorescens и Е. hirae; менее чувствительны
грамположительные бактерии В. subtilis, S. aureus и Mycobacterium sp., дрожжи
С. lypolithica и споры грибов A. niger; наименее чувствительны споры
грамположительных бактерий В. subtilis.
2. Увеличение концентрации кислорода в составе плазмообразующего газа
усиливает бактерицидное действие холодной плазмы.
3. Активные компоненты холодной плазмы (заряженные частицы,
свободные радикалы и др.) вызывают нарушение целостности клеточной
оболочки Е. со И.
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена лично автором; результаты, описанные в отдельных главах, получены в соавторстве с сотрудниками лаборатории биотехнологической экологии Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии к.б.н. Чугуновым В.А., к.б.н. Ирхиной И.А., н.с. Жирковой Н.А., м.н.с. Ракицким Ю.А., а также с сотрудниками лаборатории слабоионизованной плазмы Троицкого института инновационных и термоядерных исследований (ГНЦ РФ ТРИНИТИ), д.ф-м.н., проф. Акишевым Ю.С., д.ф-м.н. Трушкиным Н.И., к.ф-м.н. Грушиным М.Е.
Степень достоверности и апробация результатов
Результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на
10-ти Всероссийских и международных конференциях: 11 Annual Biological
Conference of the European BioSafety Association, Флоренция, Италия, 2008 г.;
51th Annual Biological Safety Conference, Рино, США, 2008 г.; 12th Annual
Conference of the European Biosafety Association, Сольна, Швеция 2009 г.;
Школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-
исследовательских организаций Роспотребнадзора «Биобезопасность в
современном мире», Оболенск, 2009 г.; 13-ой Пущинской школы-конференции
молодых ученых, Пущино, 2009 г.; Всероссийской научно-практической
конференции «Актуальные проблемы общей и военной гигиены», Санкт-
Петербург, 2011 г.; NATO Science Advanced Research Workshop on Plasma for
bio-decontamination, medicine and food security, г. Ясна, Словакия, 2011 г.;
Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и
специалистов Роспотребнадзора с международным участием
«Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения», Пермь, 2012 г.; П-ой Международной научно-практической конференции «Биотехнология - перспективы развития», Уфа, 2012 г.; Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Актуальные проблемы профилактической медицины, среды обитания и здоровья населения», Уфа, 2013 г.
План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ от 29 января 2009 г. (протокол № 1, приказ № 14 от 9 февраля 2009 г.) с изменениями, утверждёнными на заседании Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ от 21 октября 2013 г. (протокол № 8). Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного научного семинара ФБУН ГНЦ ПМБ (протокол № 34 от 1 октября 2013 г.).
Публикации. Основное содержание работы отражено в 15 научных публикациях, в том числе в двух статьях в рецензируемых журналах, одной книге и 12 тезисах международных конференций.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 189 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, три главы результатов исследований, обсуждение результатов, выводы и список литературы, включающий 33 работы отечественных и 107 зарубежных авторов. Работа содержит 75 рисунков и 12 таблиц.
Похожие диссертации на Инактивация микроорганизмов низкотемпературной плазмой при атмосферном давлении
