Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Полигоны захоронения тврдых бытовых отходов городов 10
1.1. Общие сведения 10
1.2. Экологическая характеристика 12
1.3. ПТБО как источники образования и эмиссии метана 14
1.4. Сточные воды и их микрофлора 17 Глава 2. Обмен веществ на полигонах ТБО 22
2.1. Обмен углерода 22
2.1.1. Роль в глобальном газообмене 22
2.1.2. Превращения одноуглеродных соединений 24
2.1.3. Образование и окисление метана 25
2.2. Обмен азота 27
2.2.1. Общие сведения 27
2.2.2. Структура бактериального цикла азота в водных системах 27
2.2.3. Аммонификация 28
2.2.4. Нитратредукция и денитрификация 30
2.2.5. Нитрификация 31
Глава 3. Характеристика протеобактерий как космополитов
3.1. Распространение протеобактерий на очистных сооружениях 33
3.2. Метано- и метилотрофные бактерии 35
3.3. Метилотрофия как научное направление 36
3.4. Биотехнологический потенциал метилотрофных бактерий 38
Экспериментальная часть 46
Глава 4. Объекты и методы исследований 46
4.1. Методы лабораторных исследований 47
4.1.1. Гидрохимические анализы фильтрационных вод 47
4.1.2. Количественная оценка микроорганизмов 48
4.1.3. Культивирование микроорганизмов 50
4.1.4. Газохроматографический анализ активности денитрификации 50
4.1.5. Определение состава жирных кислот 52
4.1.6. Выделение ДНК из исследуемых проб in situ /ex situ з
4.1.7. ПЦР-амплификация гена 16S рРНК, клонирование, секвенирование и анализ 53
4.1.8. ПЦР-амплификация гена mxaF, клонирование, секвенирование
и анализ 55
4.1.9. Подсчт клеток и флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) 56
4.1.10. Эксперименты с проростками 58
Результаты исследований и их обсуждение 59
Глава 5. Общая характеристика фильтрационных вод ПТБО 59
Глава 6. Молекулярная in situ детекция «культивируемых» и «не культивируемых» микроорганизмов 64
6.1. Подсчт количества клеток и филогенетических групп методом FISH 64
6.2. Анализ последовательностей генов 16S рРНК
6.2.1. Анализ сиквенсов архейных генов 16S рРНК 69
6.2.2. Анализ сиквенсов бактериальных генов 16S рРНК 72
6.3. Анализ сиквенсов генов метанолдегидрогеназы mxaF .76
Глава 7. Ex situ исследования «культивируемых» бактерий 78
7.1. Разнообразие эколого-трофических групп бактерий 78
7.2. Фенотипическая и генотипическая характеристика накопительных и чистых культур бактерий 79
7.3. Детекция метанолдегидрогеназы mxaF культур метилотрофов 84
7.4. Активность денитрификации выделенных штаммов 87
7.5. Предварительное описание новых метилотрофных денитрификаторов, изолированных из фильтрационных вод ПТБО 89
Заключение 93
Выводы 102
Писок принятых сокращений 104
Список литературы .
- Сточные воды и их микрофлора 17 Глава 2. Обмен веществ на полигонах ТБО
- Метано- и метилотрофные бактерии
- Газохроматографический анализ активности денитрификации
- Анализ последовательностей генов 16S рРНК
Сточные воды и их микрофлора 17 Глава 2. Обмен веществ на полигонах ТБО
С доисторических времн свалки ТБО являлись непременными спутниками населнных мест. На первом этапе развития методов и технологий захоронения ТБО действовал простой принцип «собрать и вывезти». Лишь к концу XX века были разработаны методы обезвреживания отходов и соответствующая законодательная база, благодаря которым произошла замена неорганизованных, неконтролируемых свалок на усовершенствованные инженерные сооружения – полигоны захоронения ТБО, оборудуемые системави дегазации и противофильтрационной защитой (Вайсман, 2003; Pantini et al., 2015).
Накопленные за последние десятилетия знания в области охраны окружающей среды, а также принятая мировым сообществом стратегия устойчивого развития привели к формированию новой политики в области захоронения отходов, направленной на всестороннее снижение эмиссий загрязняющих веществ с полигонов ТБО.
В настоящее время в мировой практике существует две концепции достижения этой цели: концепция «вечного захоронения» и концепция полигона ТБО как биологического реактора (Горбатюк и др., 1989; Ножевникова и др., 1989; Вайсман, 2003).
Концепция «вечного захоронения» заключается в широком использовании системы раздельного сбора отходов в местах их образования и термическом обезвреживании неутилизируемых фракций ТБО. Основная идея концепции заключается в запрещении размещения на полигоне не обезвреженных термическими методами отходов. Сторонники второй концепции предлагают управлять полигоном как биологическим реактором, в котором происходит разложение органических веществ определнным микробиоценозом. Регулируя количество и качество биоразлагаемого субстрата (органического углерода и др.) на входе в реактор, можно управлять выходом конечного продукта и эмиссией загрязняющих веществ. При этом воздействие на окружающую среду будет минимальным, если содержание органических веществ в ТБО не превышает 5%. Достижение такого уровня органики требует значительных финансовых затрат даже в развитых странах. Более реальным представляется уровень 7–9%, однако и он труднодостижим. (Иванов, 1998; Offermann-Clas, 1999; Laner et al., 2012).
Инфраструктура переработки ТБО в России существенно проще, чем в Европе. Более 90% всех отходов после сбора вывозится на свалки и полигоны без какой-либо предварительной обработки. По данным Государственного доклада «О состоянии окружающей природной среды Российской Федерации», из 130 млн. т тврдых бытовых отходов, образованных в 1998 году, только 3,6% перерабатывалось промышленными методами, остальные вывозились на полигоны ТБО и свалки (Трибис, 2000).
При инженерном освоении территорий закрытых свалок и полигонов ТБО особенно большие трудности возникают в связи с проявлениями метаногенеза в ходе процесса анаэробного разложения ТБО, который пока остается неуправляемым и плохо предсказуемым.
В настоящее время общие методические подходы, позволяющие регулировать процесс метаногенеза плохо разработаны.
Вместе с тем, целенаправленное изучение основных параметров процесса разложения ТБО, определяющих его факторов, разработка и внедрение технологий переработки ТБО и систем дегазации позволяют прогнозировать объем образования газа и эффективно управлять метаногенезом на основных этапах движения отходов. При управлении метаногенезом должны использоваться методы комплексной переработки и термического обезвреживания с целью регулирования морфологического состава ТБО при формировании потока отходов; системы уплотнения ТБО, формирования водного режима, системы сбора и переработки биогаза при эксплуатации полигонов ТБО; современные биотехнологические методы и эффективные системы мониторинга в период рекультивации (Иванов, 1998; Вайсман, 2003).
Свалки и полигоны твердых бытовых отходов (ТБО), находящиеся на разной фазе жизненного цикла, различные по морфологическому составу и объему отходов, площади захоронения, высоте и геометрии тела, распространены повсеместно и занимают большие территории. Захоронение ТБО всегда сопровождается долговременными эмиссиями загрязняющих веществ и безвозвратной потерей вторичных материальных ресурсов. В населенном пункте численностью 100 тыс. жителей ежегодно образуется 37 тыс. т ТБО, задалживается 0,65 га рекреационных земель для их депонирования и затрачивается (на 2003 год) около 9 млн. руб. на санитарную очистку от ТБО. Протекающие в рабочем теле полигона физико-механические, физико-химические и биологические процессы приводят к образованию биогаза, фильтрата и просадке. В результате этого полигоны в течение многих десятилетий остаются источником загрязнения грунтовых вод, почвы, влияя на процесс глобального потепления вследствие выделения парниковых газов (Scaglia et al., 2010; Thomsen et al., 2012; White, Beaven, 2013; Pantini et al., 2014). Территория, занимаемая полигонами и свалками ТБО, является опасной и надолго исключается из хозяйственного использования (Ножевникова и др., 1989; Вайсман, 2003). Вследствие быстрой урбанизации и недостаточного в течение многих лет контроля за состоянием природной среды, в пределах крупных городов в карьерах, оврагах и других естественных понижениях рельефа образовались стихийные или контролируемые свалки, которые впоследствии засыпались грунтом или просто зарастали растительностью и превращались в пустыри.
Повсеместно, занимая огромные территории в границах населнных мест, распространены объекты захоронения ТБО, находящиеся на разных этапах жизненного цикла, отличающиеся по объему отходов, их морфологическому составу (Таблица 1), времени и площади захоронения, высоте и геометрии тела. Состояние объектов захоронения ТБО в целом по России можно охарактеризовать как неудовлетворительное, а многие из них могут быть отнесены к числу открытых свалок, интенсивно загрязняющих окружающую среду (Иванов, 1998; Трибис, 2000; Meadows et al., 1999).
Метано- и метилотрофные бактерии
В конце прошлого века француз Э.Маршель показал, что процесс аммонификации носит универсальный характер и осуществляется многими микроорганизмами в широком диапазоне условий, за исключением мест с очень жарким и сухим климатом (Заварзин, 1984).
Аммонификация белков — наиболее динамичное звено в цикле азота. При внеклеточных превращениях конечным продуктом являются аминокислоты, и их накопление в почве служит одним из показателей ее биологической активности. При дезаминировании выделяется свободный аммиак. В аэробных условиях кроме аммиака при аммонификации образуется СО2 и окислы серы, а в анаэробных — жирные и ароматические кислоты (бензойная, ферулиновая и др.), спирты, индол, скатол, метилмеркаптан (Речкин, Ладыгина, 2010).
Образующиеся в переувлажненных почвах при анаэробиозе некоторые продукты аммонификации обладают фитотоксическими свойствами и могут вызывать угнетение роста растений.
В процессе аммонификации помимо бактерий участвуют актиномицеты и грибы, но наиболее активные возбудители известны среди бактерий родов Pseudomonas и Bacillus. Аммиак, образующийся при микробном разложении соединений растительного и животного происхождения, претерпевает далее различные превращения:
В анаэробных условиях многие аэробные бактерии вместо кислорода могут использовать нитрат в качестве конечного акцептора электронов. Нитратредукция - процесс переноса двух электронов, в результате чего нитрат восстанавливается до нитрита. Поток электронов через пул хинонов, цитохромный комплекс b/ci и нитратредуктазу приводит к переносу протонов через мембрану: NО3+ 2е+ 2Н+ NО2+ Н2О Так как потенциальная энергия восстановления нитрата меньше в сравнении с кислородом - микроорганизмы будут использовать кислород в аэробных условиях, однако, в среде с нитратами, но лимитированной по кислороду - будет использована нитратредукция (Koike, Srensen, 1988; Zehr, Ward, 2002).
Таким образом, всякий раз, когда при разложении органического вещества в почве или воде кислород исчерпывается в результате дыхания аэробных микроорганизмов, некоторые из этих аэробов в присутствии нитрата продолжают дышать за счет органического вещества, т. е. переходят к анаэробному дыханию. При этом происходит восстановление нитратов. Некоторые бактерии (например, Escherichia coli) способны восстанавливать нитрат только до уровня нитрита, другие (например, Pseudomonas aeruginosa) могут восстановить его до газообразного азота (Shapleigh, 2009). В ходе этого процесса, называемого денитрифшацией, связанный азот удаляется из почвы и воды с освобождением газообразного N2 в атмосферу (Кузнецов и др., 1985; Tosques et al, 1997; Zumpft, 1997). NО3" NО2" NO N20 N2
Денитрификация - процесс, имеющий большое экологическое значение. Он лишает почву необходимого для растений азота, снижая за счет этого продуктивность сельского хозяйства. Особенно значительные потери происходят в удобренных почвах. Хотя точные цифры не известны, но при определенных условиях удобрения могут утрачивать в результате денитрификации до 50% связанного азота (Заварзин, 1984; Zumft, 1997; Moreno-Vivian еґ al, 1999).
Тем не менее, денитрификация приводит не только к вредным последствиям. Благодаря денитрификации в почве всегда имеется определенное количество связанного азота. Хорошо растворимые ионы нитрата постоянно выщелачиваются из почвы и в конечном счете переносятся в океаны. При отсутствии денитрификации земной запас азота, включая N2 атмосферы, в конце концов, сосредоточился бы в океанах, и жизнь стала бы невозможной на основной части суши, за исключением прибрежной полосы. Денитрификация делает пресную воду пригодной для питья, поскольку высокие концентрации ионов нитрата являются токсичными (Koike, Srensen, 1988).
В процессе всех превращений, которым подвергается азот с момента его ассимиляции растениями до его освобождения в виде аммиака, атом азота остается в восстановленной форме. Превращение аммиака в нитрат (нитрификация) осуществляется в природе двумя высокоспециализированными группами облигатно аэробных хемоавтотрофных бактерий, объединенных в одно семейство Nitrobacteriaceae. Нитрификация происходит в два этапа: на первом аммиак окисляется до нитрита, на втором нитрит окисляется до нитрата.
В результате совместной деятельности этих бактерий аммиак, освобождающийся в процессе минерализации органического вещества, быстро окисляется в нитрат. Таким образом, нитрат – основное азотистое вещество почвы, используемое растениями в процессе роста (Кузнецов и др., 1985; Речкин, Ладыгина, 2010).
Нитраты представляют собой весьма растворимые соединения, поэтому они легко выщелачиваются из почвы и уносятся водой; следовательно, определенное количество связанного азота постоянно удаляется с континентов и переносится в океаны. В некоторых местностях, особенно в полузасушливых районах, в почве накапливаются отложения нитратов в результате выхода и испарения поверхностных вод. Такие отложения — ценный источник удобрения, хотя их значение существенно снизилось за последние 50 лет вследствие развития химических методов производства азотистых соединений из атмосферного азота (Zehr, Ward, 2002).
Газохроматографический анализ активности денитрификации
Также, метилобактерии с РМФ-путем образуют из метанола сахарофосфаты, которые являются интермедиатами биосинтеза ароматических аминокислот - L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана. В связи с этим они рассматриваются как перспективные продуценты этих аминокислот (Максимова, 2005; Троценко и др., 2010; Sy et al., 2005; Mosin, Ignatov, 2014). Экзополисахариды (ЭПС). Метилобактерии-продуценты ЭПС реализуют, в основном, РМФ- и РБФ-пути С1-метаболизма. Биоконверсия C1-соединений в полисахариды лимитирована кислородом. Так, выходы полисахарида из метанола и глюкозы идентичны при пересчете на углерод, а расход кислорода на образование ЭПС из метанола почти в 10 раз больше. Некоторые факультативные метилотрофы, использующие различные источники углерода, способны синтезировать ЭПС только на средах с метанолом (Dourado et al., 2015).
Высокая вязкость растворов, способность к гелеобразоваию псевдопластичность, тиксотропность ЭПС метилобактерий позволяет обсуждать возможность их использования в пищевой промышленности, медицине, сельском хозяйстве, для производства картона и повышения нефтедобычи. Однако остается актуальным выделение и селекция новых штаммов-продуцентов ЭПС на основе метанола (Троценко и др., 2010).
Поли--гидроксибутират/валерат (ПГБ/В). Производство полимеров и пластмасс развивается высокими темпами, что обусловлено стремительным ростом их потребления. Однако упаковка из синтетических полимеров, составляющая 40% бытового мусора, практически не разлагается почве, так как не найдены микроорганизмы и ферменты, способные е деградировать. При сжигании синтетических полимеров образуются крайне токсичные диоксины. Кроме того, в посуде, упаковочных материалах, детских игрушках и других изделиях из синтетических пластиков обнаружены высокотоксичные соединения: бисфенол А, вызывающий рак груди, и эфиры фталевой кислоты, наносящие вред развитию новорожденных и поражающие головной мозг. Кроме того, на производство синтетических пластиков расходуется более 8% добываемой нефти, запасы которой ограничены, а цены на нее постоянно растут. В связи с этим вс большее внимание уделяется исследованиям по получению и использованию различных биоразлагаемых пластиков, в том числе ПГБ и ПГБ/В.
Многие прокариоты синтезируют и запасают ПГБ и подобные ему полимеры при несбалансированных условиях роста (дефицит азота, фосфора, кислорода или магния) в виде цитоплазматических гранул. ПГБ обладает рядом полезных свойств – биоразлагаемостью, биосовместимостью и термопластичностью. Введение -гидроксивалерата в ПГБ существенно улучшает физико-химические и реологические свойства полимера. Образующийся сополимер (ПГБ/В) прочнее и эластичнее, чем ПГБ, поэтому перспективен как биоразлагаемый заменитель персистентных химических полимеров (Dourado et al., 2015).
Отобраны метилотрофные продуценты, накапливающие ПГБ/В при росте на метаноле в присутствии пропанола, пентанола, пропионата и валерата, причем добавление C5-субстратов приводит к более высокому содержанию -гидроксивалерата в составе сополимера, нежели внесение С3-соединений. Paracoccus methylutens синтезирует ПГБ/В из метанола также в присутствии глицерина и гептана (Троценко и др., 2010; Dourado et al., 2015).
В условиях периодического культивирования различные сериновые метилобактерии способны накапливать как низкомолекулярный (50-60 кДа), так и высокомолекулярный ПГБ (1300-2000 кДа). В оптимизированных условиях содержание ПГБ может составить 50-55%. При непрерывном культивировании максимальная продуктивность 0,64 г/л ч получена для Hyphomicrobium zavarzinii, а содержание ПГБ варьировало от 40 до 59%. При периодическом культивировании с контролируемым с ношением C/N М. extorquens К накапливал до 60% ПГБ с выходом 0,2 г/г метанола.
Фитогормоны (цитокинины, ауксины), B12. В последнее десятилетие установлена новая жизненно важная роль аэробных метилотрофов в качестве фитосимбионтов, поскольку показано, что метанол и другие C1-соединения являются естественными продуктами метаболизма растений (Nemecek-Marshall et al., 1995). Проведнный скрининг 140 видов одно- и двудольных растений показал, что филлосфера и ризосфера, а также семена растений колонизованы метилотрофными бактериями. Высокая плотность метилобактерий на единицу листовой поверхности (до 600 КОЕ/см2) свидетельствует об образовании ими своеобразного катаболического экрана, препятствующего поступлению в атмосферу летучих С1 продуктов метаболизма растений, прежде всего метанола и формальдегида (Фдоров и др., 2011). Особо следует отметить широкое распространение среди метилотрофов – фитосимбионтов представителей рода Methylobacterium, которые чаще других метилобактерий обнаруживаются в ассоциации с растениями (Dourado et al., 2015). В частности, многие метилобактерии (Methylobacterium cerastii, Mtb. marchantiae, Mtb. gnaphalii, Mtb. trifolii, Mtb. thuringiense, Mtb. gossipiicola и др.) впервые были выделены с различных органов растений (Schauer et al., 2011; Madhaiyan et al., 2012; Tani et al., 2012; Wellner et al., 2012, 2013; Zou et al., 2013). Показано, что колонизация метилотрофами растений повышает скорость роста, фотосинтетическую активность, регенерационный потенциал и способность к корнеобразованию. Кроме того, у колонизованных метилобактериями растений повышалась устойчивость к фитопатогенным микроорганизмам (Иванова и др., 2000; Knief et al., 2008; Gogleva et al., 2011). Также, среди метилобактерий есть симбионты растений способные индуцировать образование клубеньков (Sy et al., 2001).
Биоактивные соединения, выделяемые метилобактериями прижизненно или в результате лизиса клеток, оказывают благоприятное воздействие на рост и развитие растений. При росте на одно- и полиуглеродных субстратах некоторые факультативные метилотрофы конститутивно синтезируют цитокинины (Koenig et al., 2002). Представители всех известных родов метилобактерий, выращенные на средах с метанолом или метиламином в присутствии 5 мМ L-триптофана, синтезируют индольные соединения, в частности, индолилуксусную кислоту (ИУК), что зачастую используется как таксономический признак (Герхардт, 1983; Иванова и др., 2001; Доронина и др., 2002; Фдоров и др., 2009; Gogleva et al., 2011). Выделены ключевые ферменты, участвующие в синтезе ИУК у некоторых метилотрофов (Фдоров и др., 2010).
Целый ряд сообщений свидетельствует об образовании факультативными метилобактериями витамина В12 (кобаламина), выход которого был существенно выше при использовании С1, чем Сn-субстратов. Так, при росте на средах с метанолом или дихлорметаном Methylobacterium dichloromethanicum DM4 образует 10 мкг В12/г сухой биомассы, а на средах с этанолом и сукцинатом – на 30% меньше. Наряду с тем, что метионинсинтетаза метилотрофов является В12-зависимым ферментом, более высокий уровень кобаламина при метилотрофном росте связан с участием в ключевых реакциях путей С1-метаболизма (Троценко, 2010; Фдоров и др., 2011).
Анализ последовательностей генов 16S рРНК
Практически все 20 чистых культур аэробных а-, р , у-протеобактерий, выделенных из образцов сточных вод ПТБО, существенно отличаясь по содержанию Г+Ц в ДНК (43,9 - 70,5 мол.%), обладали способностью к нитратредукции и 15 культур - к денитрификации на пирувате и метаноле (Таблица 6). При этом изоляты Alphaproteobactena (включая типично гетеротрофные, метилотрофные и метанотрофные) относились к родам лишь одного порядка Rhizobiales: Rhizobium, Agrobacterium, Ochrobactrum, Methylobactenum и Methylosinus. В их жирнокислотных профилях явно преобладала октадеценовая С18:1 кислота (60-85% в сумме ЖК). В частности, штамм RS-V2 (КС577610) представлял собой розово-пигментированную факультативную метилобактерию, способную к денитрификации на метаноле и, особенно, на пирувате. Подвижные палочки размером 0,8-1,4 1,0-3,0 мкм со слабо выраженной каталазной и оксидазной активностью. Содержание Г+Ц в ДНК составляло 70,5 мол.%. Согласно результатам филогенетического анализа последовательностей генов 16S рРНК, изолят имел высокий уровень сходства (99,3%) с Methylobactenum radiotolerans и, следовательно, являлся штаммом указанного вида: Mb. radiotolerans RS-V2 (Рисунок 23). Штамм альфапротеобактерии RS-MM6 (KF371658) по последовательностям нуклеотидов в гене 16S рРНК на 99,7% оказался схож с Methylobactenum hispanwum DSM 16372т (AJ635304), штамм RS-X6 на 97,7% сходен с гетеротрофом Ochrobactrum cytm, а RS-Mol - с метанотрофом Methylosinus trichosporium.
В исследованных фильтрационных водах численность метанотрофов, учитываемых на элективных средах под газовой фазой с 15% СН4 при 25С, была значительно ниже (в 10 - 100 раз) численности метилобактерий на плотных и жидких средах с 2-5 мл/л метанола: от 4 до 60% от Ъ\б в поверхностных пробах и 0,3-0,7% от Nб в придонной воде. Среди культивируемых метанотрофов доминировали альфапротеобактерии рода Methylosinus {Ms. trichosporium) и гаммапротеобактерии рода Methylomonas {Mm. methanwa). Среди метилобактерий доминировали бетапротеобактерии рода Methyloversatilis {Mv. universalis) порядка Rhodocyclales (сходство сиквенсов 16S рРНК изолятов RS-XM, RS-Х1, RS-X2 с типовым штаммом составило 99,4-99,7%), RS-MT7 с Castellamella denitrifwans - 99,1% и представителей двух таксономически неопределнных изолятов (RS-Х3, RS-М7) порядка Methylophilales. Изолят RS-XM филогенетически был наиболее близок к типовому штамму Methyloversatilis universalis (99,7%) и к метилобактерии Burkholderia phymatum и Bh. denitrifwans (92,2%), но значительно удален от изолятов RS-Х3, RS-М7 (90,8-91,0%) и от альфапротеобактерии Methylobacterium radiotolerans RS-V2 (78,6%). Два филогенетически близких изолята RS-Х3, RS-М7 примыкали к группе родов семейства Methylophilaceae: Methylotenera, Methylovorus, Methylobacillus и Methylophilus (сходство лишь 93,0-95,5%). По совокупности гено- и фенотипических признаков изоляты RS-Х3, RS-М7 идентифицированы как представители нового вида нового рода семейства Methylophilaceae.
У всех метилотрофных изолятов из фильтрационных вод у -протеобактерий (в отличие от а- и у-протеобактерий) в жирнокислотном профиле преобладали Сіє, Сіб:і (70-75% в сумме ЖК), содержание Г+Ц в ДНК составляло 57-66 мол.%. Все они являлись пресноводными нейтрофилами и мезофилами, росли на широком спектре органических субстратов, в анаэробных условиях в качестве терминальных акцепторов электронов использовали нитраты и нитриты.
Накопительные культуры изолятов RS-Х3 и RS-М7 представляли собой ассоциации метилотрофоных и сапротрофных Дпротеобактерий. Из ассоциаций RS-Х3 и RS-М7 были выделены чистые культуры Betaproteobacteria порядка Burkholderiales с высокой каталазной активностью: из RS-М7 – сапротрофный Comamonas sp. RS-M7Pp2013 (на 96,5% сходен с Comamonas terrigena), из RS-Х3 – сапротрофный и метилотрофный денитрифицирущий Achromobacter xylosoxidans RS-X3Pp2013 (99,6% – с Achromobacter xylosoxidans ssp. xylosoxidans и 99,1% – с Ab. xylosoxidans ssp. denitrificans).
Изоляты Gammaproteobacteria по морфо-физиологическим, хемотаксономическим и генетическим признакам представляют довольно гетерогенную группу. У них в очень широком диапазоне варьирует и содержание Г+Ц в ДНК (44 – 68 мол. %). Большинство из них являются сапротрофными, хорошо растут на пептоне, обладают значительным сходством с известными видами. У изолятов RS-V, RS-H сходство последовательностей гена 16S рРНК достигает внутривидового уровня с Shevanella putrefaciens (98,1 – 98,8%), у RS-MT8 с Pseudoxanthomonas taiwanensis (98,5%), у RS-X5 со Stenotrophomonas maltophila (97,8%) и у RS-V3 с Enterobacter asburiae (97,7%). Однако у умеренно галофильного метилотрофного денитрификатора RS-MM3 филогенетическое сходство с различными видами рода Methylophaga достигает лишь межвидового уровня (95,3 – 96,7%). Фенотипически сходный умеренно галофильный штамм M1K рода Methylophaga был выделен из техногенно-засоленной ризосферной почвы на территории г. Соликамска. Следует отметить, что представители данного рода ранее не выделялись из этого биотопа (Корсакова и др., 2011). Изолят обладал способностью продуцировать биологически активные соединения, способствующие росту растений. При обработке семян яровой пшеницы препаратами умеренно галофильного метилотрофного штамма Methylophaga sp. M1K отмечено стимулирование ростовых процессов, синтеза растительных пигментов и массы корней (Таблица 7).