Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 Биологические свойства возбудителя сифилиса 11
1.2 Лабораторная диагностика сифилиса 28
1.2.1. Бактериоскопическая диагностика сифилиса 29
1.2.2. Серологическая диагностика сифилиса 30
1.2.3. Молекулярно биологические методы диагностики сифилиса
Заключение 40
Собственные исследования 41
Глава 2. Материалы и методы 41
2.1 Клиническая характеристика больных 41
2.2 Методы исследования 41
Глава 3. Хромато-масс-спектрометрическая оценка нарушений метаболизма в сыворотке крови больных 46
3.1 ГХ-МС-анализ липидных компонентов 47
3.2 ГХ-МС-анализ углеводных компонентов 49
3.3 ГХ-МС-анализ белковых (аминокислотных) компонентов
3.4 Диагностическая значимость хромато-масс-спектрометрических методов определения нарушений метаболизма в сыворотке крови больных 52
3.5 Заключение 53
Глава 4. Хромато-масс-спектрометрический поиск мо-лекулярных маркёров органных поражений
4.1 ГХ-МС-анализ молекулярных маркёров поражения нервной системы (головной мозг) 57
4.2 ГХ-МС-анализ молекулярных маркёров поражения печени
4.3 ГХ-МС-анализ молекулярных маркёров поражения костных структур
4.4 Диагностическая значимость хромато-масс-спектрометрических методов оценки органных метаболитов 64
4.5 Заключение 65
Глава 5. Хромато-масс-спектрометрическая оценка активаторов «кооперативной чувствительности»
5.1 ГХ-МС-анализ лактонов 74
5.2 ГХ-МС-анализ хинолонов 76
5.3 ГХ-МС-анализ фурановых эфиров 77
5.4 Диагностическая значимость хромато-масс-спектрометрических методов оценки активаторов «кооперативной чувствительности» 78
5.5 Заключение 79
Глава 6. Оценка некоторых патогенетических механизмов развития люэтической инфекции
6.1 Роль хромато-масс-спектрометрических методов в комплексной диагностике люэтической инфекции
6.2 Удельный вес основных клинико-лабораторных и хромато-масс-спектрометрических показателей на основании факторного анализа 89
6.3 Заключение 90
Обсуждение результатов 91
Выводы 101
Практические рекомендации 102
Литература 103
Приложения 122
- Биологические свойства возбудителя сифилиса
- ГХ-МС-анализ углеводных компонентов
- ГХ-МС-анализ молекулярных маркёров поражения нервной системы (головной мозг)
- ГХ-МС-анализ лактонов
Введение к работе
АктуаЛЬНОСТЬ Проблемы: Во всём мире отмечается рост числа инфекционных заболеваний, передающихся половым путём (ЗППП). Среди ЗППП наиболее значимым является сифилис. По данным органов ГСЭН заболеваемость сифилисом в 2001 году составила в РФ 240 тыс. случаев. Эпидемиологическая ситуация в стране остаётся крайне напряжённой. Одним из основных мероприятий, направленных на предупреждение заболеваемости сифилисом, является его ранняя диагностика [Приказ МЗ РФ № 87 «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса»]. Несмотря на то, что сифилис известен врачам с античных времён, остаётся много нерешенных проблем связанных с его диагностикой и лечением. В последние годы особенно увеличилось число скрытых форм сифилиса. Так по данным Борисенко К. К. с соавт. (1989) ранний скрытый сифилис стал регистрироваться значительно чаще, чем поздний и неучтённый и составляет до 60-96% всех больных латентной формой сифилиса. По данным Соколовского Е. В, (1995) удельный вес раннего срытого сифилиса в РФ вырос с 1991 по 1994 год в 1,2 раза. Частота регистрации позднего скрытого сифилиса снизилась в 6 раз.
Поскольку Treponema pallidum является очень капризным и прихотливым микробом, серологические исследования продолжают оставаться доминирующим методом лабораторной диагностики сифилиса. Они включают неспецифические и специфические тесты.
К неспецифические тестам (без участия трепонем) относятся реакция Вассермана (РСК с несколькими АГ); также разработаны более чувствительные модификации, например Григорьева-Рапопорта или Вайнштейна-Резниковой, но они менее специфичны. Для предварительных исследований широко используется VDRL-реакция — специализированная флоккуляционная проба на предметных стёклах с использованием кардиолипин-лецитин-холестеринового АГ — модификация реакции Кана и цитохолевой реакции. В качестве метода экспресс-диагностики удобен тест на реагины плазмы, представляющий собой РА частиц угля, нагруженных кардиолипином.
Среди специфических тестов большое значение имеют РИБТ, включающая инкубирование возбудителя с сывороткой пациента в анаэробных условиях, после чего бактерии теряют подвижность (в среднем, через 18 ч), и РА (микроагглютинации) Т. pallidum. В последние 10-20 лет всё большее распространение получают методы иммунофлюоресцентной диагностики сифилиса (особенно непрямой РИФ), постановка которых отличается относительной простотой и достаточно высокой чувствительностью. Наибольшее распространение получила РИФ с адсорбированной сывороткой, включающая предварительное истощение сыворотки пациента инкубацией с АГ штамма Райтера, что приводит к элиминации перекрёстно реагирующих AT, последующее инкубирование с АГ Г. pallidum (штамм Николса) в течение 30 минут при температуре 37 С и внесение ан-тиглобулиновой сыворотки, меченой флюоресцеином.
Результаты серологических реакций зависят от множества причин, которые могут обуславливать появление ложно положительных и ложноотрицательных результатов. Ложноположительные результаты нередко могут регистрироваться у пациентов с соматическими (например, при заболеваниях крови, печени), инфекционными заболеваниями (например, при вирусных гепатитах), диффузными болезнями соединительной ткани, при интоксикациях и других патологических, а также физиологических состояниях (например, при беременности, во время менструаций, при старении и др.). Ложноот-рицательные результаты могут быть обусловлены недостаточно высокой чувствительностью тест-системы и другими причинами. Кроме того, серодиагностика возможна в относительно поздние сроки с момента заболевания, когда у больного в крови появляются AT и занимает много времени. Так постановка РИБТ после получения АГ с последующие чтением результатов занимает 22-24 часа (меланжевый метод), РИФ - в среднем 7 часов, ИФА с предварительной сенсибилизацией планшета АГ - 20-22 часа, без сенсибилизации - 2-3 часа в зависимости от квалификации лабораторного персонала.
Таким образом, неясность происхождения ложноположитель-ных результатов серологических реакций на сифилис, трудности их дифференциации со скрытыми формами сифилиса вызывает необходимость поиска новых критериев дифференциальной диагностики специфической и неспецифической серопозитивности.
Все методы серодиагностики сифилиса основаны на косвенном показателе наличия Т. pallidum - AT к бледной трепонеме в крови пациентов. До настоящего времени нет однозначного объяснения причины серологической резистентности; различий в сроках негативации у больных, получивших однотипное лечение; возникают проблемы установления достоверного диагноза врожденного сифилиса; не разработаны критерии определения жизнеспособности возбудителя сифилиса в организме хозяина.
Перечисленные недостатки серодиагностики сифилиса послужили толчком к разработке молекулярно-генетических методов диагностики сифилиса получивших широкое распространение в последние годы, в частности полимеразная цепная реакция (ПЦР) (Ra-dolf J. D. et al.), поскольку геном Treponema pallidum достаточно консервативен. Запатентованы различные способы ПЦР-диагностики сифилиса. Однако все проводимые исследования в области ДНК-диагностики сифилиса носят экспериментальный характер (Лыкова С. Г., Шахматов Д. А., 1998; Дмитриев Г. А. с соавт., 2002). Несмотря на целый ряд преимуществ ПЦР-диагностики эти методы обладают и существенными недостатками, среди которых необходимо отметить их высокую стоимость, обусловленную дороговизной праймеров для ПЦР-диагностики и высокой стоимостью лабораторного оборудования, что ограничивает применение этих методов в рутинной лабораторной практике. Следует подчеркнуть, что ПЦР-анализ, довольно широко распространенный для диагностики многих инфекционных заболеваний, в том числе ЗППП, для диагностики сифилиса не регламентирован органами здравоохранения и во всем мире имеет пока исследовательский статус.
Следует отметить, что характер развития люэтической инфекции с быстрым проникновением возбудителя в кровь и быстрой генерализацией по организму, сопровождающейся повреждением различных органов и тканей (так называемая люэтическая септицемия) позволяет считать её течение сепсисоподобным с соответствующей клинической и лабораторной оценкой.
Современное развитие физико-химических методов исследования и, в частности хромато-масс-спектрометрии, позволяет определить минимальные количества химических соединений, входящих в состав клеточной стенки и органелл Treponema pallidum, продуктов её метаболизма, как анаэробного микроорганизма; определить наличие в крови больных органных метаболитов, а также ряда сигнальных соединений, запускающих развитие септического состояния в организме.
В связи с вышесказанным, разработка современных недорогих, высокочувствительных и специфических методов лабораторной диагностики сифилиса является актуальной и представляет большое значение для практического здравоохранения.
Цель Исследования. В связи с изложенным целью работы является разработка диагностических критериев развития сифилиса методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии (ГХ-МС) на основе хроматографического определения молекулярных маркёров Treponema pallidum.
Задачи Исследования. Для достижения указанной цели исследования представлялось необходимым решение следующих задач:
1. Изучить особенности развития сифилитической инфекции с оценкой скрытых форм сифилиса и органных поражений.
Отработать лабораторную методику определения молекулярных маркёров Treponema pallidum в биологических жидкостях и тканях организма.
Определить методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии наличие в сыворотке крови больных сифилисом углеводных, липидных и белковых компонентов — фрагментов клеточной стенки и орган ел л Treponema pallidum.
Определить методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии наличие в сыворотке крови больных сифилисом органных метаболитов — молекулярных маркёров поражения ЦНС, печени и костных структур.
Определить методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии наличие в сыворотке крови больных сифилисом сигнальных соединений — лактонов, хинолонов и фурановых эфиров — факторов «кооперативной чувствительности» микробов.
Определить диагностическую значимость, диагностическую эффективность и диагностическую чувствительность лабораторных диагностических критериев на основании хромато-масс-спектрометрических методов определения метаболитов Treponema pallidum, органных метаболитов и сигнальных соединений «кооперативной чувствительности» микробов.
Научная новизна полученных результатов:
Впервые методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии определен характер биохимических изменений сыворотки крови больных сифилисом.
Впервые методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии определены молекулярные маркёры органных поражений (ЦНС, печень, костные структуры) при сифилисе.
Впервые в сыворотке крови больных сифилисом методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии определены активаторы «кооперативной чувствительности» микробов и их субъединицы.
Впервые на основании факторного анализа выстроен приоритетный ряд клинико-лабораторных и ГХ-МС показателей сифилитической инфекции по величине удельного веса.
Впервые определена диагностическая значимость, диагностическая эффективность и диагностическую чувствительность хрома-то-масс-спектрометрических критериев сифилиса.
Практическая значимость исследований. Работа является фрагментом плановой темы НИР кафедры микробиологии с вирусологией и иммунологией Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова: «Экология условно-патогенных микробов и их роль в патологии человека», № госрегистрации 01.200.115343.
ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
Биохимические изменения сыворотки крови при сифилисе характеризуются наличием липидных (летучие жирные кислоты, холестерин и его эфиры; триглицериды; фосфолипиды; Сн-Сзо жирные кислоты; изо- и антиизокислоты), углеводных (D-глюкоза, изомеры глюкозы; D-галактоза, её изомеры; L-фукоза; аминоса-хара и ацетилированные амины глюкозы и маннозы) и аминокислотных (алифатические аминокислоты; оксиаминокислоты; ди-карбоновые аминокислоты и амиды; основные аминокислоты; ароматические аминокислоты; серосодержащие аминокислоты) компонентов, являющихся фрагментами органелл Treponema pallidum. D-галактоза, D-трентол, глюкоза и её циклический изомер — инозитол служат молекулярными маркёрами органных поражений ЦНС при сифилисе.
Ароматические производные жирных кислот (фенилпропионовая и фенилуксусная кислоты), аминокислотные фрагменты, липид-но-белковый комплекс (хроматографически неразделенный) служат молекулярными маркёрами органных поражений печени при сифилисе.
Летучие жирные кислоты, липополисахариды и их субъединицы (Cj3-C2o) служат молекулярными маркёрами органных поражений костей при сифилисе.
Активаторы «кооперативной чувствительности» микробов и их субъединицы — бутиролактон, фуранилэтанол, 2-фуран-метанамин и 4-гидрокси-2-хинолинкарбоксиловая кислота присутствуют в сыворотке крови больных сифилисом.
На основании факторного анализа выстроен приоритетный ряд клинико-лабораторных и ГХ-МС показателей сифилитической инфекции по величине удельного веса. В первую десятку вошли такие ГХ-МС показатели как сфингомиелин (0,978); лизофосфа-тидилхолин (0,966); фосфатидилэтаноламин (0,943); инозитол (0,911); D-галактоза (0,894); циклическая форма глюкозы и изомер глюкозы — углеводные компоненты, а также активаторы «кооперативной чувствительности» — 3-оксодозеноил-лактон (0,886); ди- и тетрагидро-изохинолин (0,854). Такие активаторы «кооперативной чувствительности» как фуранозил-диэфир-бора и бутаноил-лактон заняли соответственно 11 (0,755) и 12 (0,736) места.
7. ГХ-МС критерии сифилитической инфекции имеют высокий уровень диагностической чувствительности (79,6-97,2%), диагностической специфичности (50,0-92,3%), диагностической предсказуемости положительной (61,3-94,7%), диагностической предсказуемости отрицательной (60,9-95,1%) и могут быть использованы в качестве лабораторных диагностических критериев развития сифилиса.
Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии ММА им. И. М. Сеченова.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на: научной конференции кафедры микробиологии ММА им. И. М. Сеченова;
Национальных днях лабораторной медицины России, 20-22 октября 2004 года, Москва;
1-й Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», 26-28 октября 2004 года, Москва; совместной научной конференции кафедры микробиологии ММА им. И. М. Сеченова и клинико-биохимической лаборатории Института хирургии им. А. В. Вишневского РАМН (28 декабря 2004 года, протокол № 10).
ЛИЧНЫЙ ВКЛаД автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов, В работах выполненных в соавторстве, вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической и клинико-бактериологической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрения в практику.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы, в том числе 3 в центральных журналах.
Биологические свойства возбудителя сифилиса
Возбудитель сифилиса Treponema pallidum подвид pallidum относится к роду Treponema. Род Treponema представлен спиральными бактериями длиной от 5 до 20 мкм, которые образуют туго закрученные правильные или неправильные спирали. Грамотрица-тельные, хорошо окрашиваютсл серебрением по Морозову, но плохо по Романовскому-Гимзе.
Представители рода — хемоорганотрофы с бродильным метаболизмом, утилизируют аминокислоты и/или углеводы. По типу дыхания — анаэробы или микроаэрофилы. Ферментативная активность очень низкая: каталаза-, уреаза- и оксидазаотрицательны, реакция Фогеса-Проскауэра отрицательная, не восстанавливают нитраты [Овчинников Н. М., и соавт. 1986].
Для человека патогенны — Т. pallidum, Т. pertenue, Т. bejel, Т. carateum и Т. vincentii. Патогенные трепонемы дифференцируют по патогенности для лабораторных животных, способности сбраживать маннит, утилизировать лактат и образовывать специфические метаболиты. Исследования ДНК-гомологии позволили систематизировать Т. pertenue и Т. bejel ранее считавшиеся отдельными видами, как подвиды Т. pallidum. Выделяют Т. pallidum подвид pallidum, Т. pallidum подряд pertenue и Т. pallidum подвид endemicum [Овчинников Н. М., и соавт. 1986].
Т. pallidum подвид pallidum является возбудителем сифилиса — хронического венерического заболевания с вариабельным цикличным течением. Болезнь поражает все органы и ткани организма. Европейские врачи столкнулись с сифилисом в І493 г. после второй экспедиции Колумба в Новый Свет. Особое распространение заболевание получило во время итальянской кампании Карла VIII в 1494 г., т. к. французские войска включали большое число испанских наёмников. Поэтому заболевание фигурировало под названием «французской или итальянской болезни». О значимости заболевания свидетельствует тот факт, что именно ему Фракасторо посвятил свой первый поэтический трактат (1525), в котором описал заболевание у пастуха Сифилуса, чьё имя стало нарицательным для болезни [Фур-нье Альфред, 1903]. Достаточно быстро была изучена эпидемиология сифилиса. В 1575 г. Амбруаз Паре назвал его «Lues Venera», т. е. «любовная чума». Однако возбудитель сифилиса был выделен только в 1905 г. Шаудинном и Хоффманном, что было затем экспериментально подтверждено И. И. Мечниковым и Э. Ру (1905 г.).
Морфология. Т. pallidum подвид pallidum имеет спиралевидную форму с одинаковыми по высоте завитками, которых может быть до 14 (рис. 1); средние размеры — 6-14x0,2-0,3 мкм, но в культурах размеры могут быть значительно большими (рис. 2); движения разнообразные — от винтообразных до сгибательных. Может образовывать L-формы. Основной способ размножения — поперечное деление, хотя многие авторы предполагают более сложный цикл. Трепонема малоустойчива во внешней среде, гибнет при высыхании, но на холоде в матерчатых тканях может сохраняться до 50 суток. Прогревание при температуре 40 С в течение часа приводит к утере патогенных свойств, при 48 С гибнет за 10 мин. Возбудитель сохраняется в течение 3-6 суток при 25 С в жидкой среде, содержащей редуцирующие агенты, а также в течение 24 ч в крови при температуре 4С [Воробьев А. А. с соавт., 2004].
Культуральные свойства. Факультативный анаэроб; чрезвычайно прихотливый и требовательный микроб. Практически не растёт на искусственных средах. Впервые чистая культура была выделена в 1909 году Я. Г. Шерешевским на полусвернутой лошадиной сыворотке [Овчинников Н. М., и соавт. 1986].
Ногучи для выделенитя чистой культуры использовал посев в глубину асцитического агара. Наибольшее количество штаммов в нашей стране выделили В. М. Аристовский и Р. Р. Гельцер. Эти «казанские штаммы» наряду со штаммом Райтера применяют для приготовления АГ для серодиагностики. Длительное культивирование на искусственных средах вызывает адаптацию к более простым средам, например, среде Китта-Тароци и потерю патогенных свойств [Овчинников Н. М., и соавт. 1986].
Для выращивания бледных трепонем обычно используют МПБ или печёночный бульон с добавлением кусочков печени и яичек кролика. Можно использовать бульон бычьего сердца с тиогли-колятом Na или МПБ с добавлением кроличьей, лошадиной сыворотки или сыворотки человека либо асцитической жидкости. Посевы культивируют в анаэробных условиях при температуре 35 С. Неплохие результаты можно получить, используя метод культивирования по Ногучи [Довжанский С. И., 1993].
На плотных средах мелкие колонии появляются на 3-5 суток культивирования. На среде 199 для культуры клеток с добавлением печёночного бульонаи кроличьей сывороткой оптимальный рост можно наблюдать на 7-9 сутки (рис. 3) [Воробьев А. А. с соавт., 2004].
Биохимические свойства изучены недостаточно. Некоторые штаммы (казанские штаммы I, IV, штамм Рюйтера, ставропольские штаммы VI, VII, VIII и IX) образуют индол и H2S, а казанские штаммы II и V этими свойствами не обладают. Некоторые разжижают желатину; штамм VIII разлагает глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу и маннит с образованием кислоты, а штамм IX разлагает лишь глюкозу; единичные штаммы гемолизируют эритроциты человека [Овчинников Н. М., и соавт. 1986]. Изучая особенности биохимического состава клеточных структур, необходимо учитывать, что они представляют собой сложные конгломераты веществ различной химической природы, соединённые между собой определёнными химическими связями.
Предпринимались попытки расширить знания о биохимическом составе структур клетки за счёт определения содержания в них моносахаров, пентоз, нуклеиновых кислот, белков, аминокислот, липидов.
Выявленные хроматографическими методами исследования моносахара были представлены глюкозой, галактозой, маннозой, арабинозой и их изомерами (непосредственно структурные фракции не содержали галактозу и арабинозу). Наибольшее % содержание в структурах клетки приходится на а- и Р-глюкозу, D-маннозу, входящих в состав глико-липо-протеиновых комплексов [Collart P. et al., 1964; Goldmeier D. et al, 1999].
Антигенная структура остаётся плохо изученной. Диагностическая ценность специфических АГ трепонем связана с белками, а иммуногенная активность с липо протеинами клеточной стенки [Гражданцева А. А. с соавт., 1998; Collart P. et al., 1964]. В состав бактериальной клетки входит Л ПС и белковая фракция, которые обладают разными антигенными свойствами. Полисахарид обладает свойствами видоспецифического АГ. Разными исследователями из клеток были выделены ЛПС, полисахаридные и белковые фракции, которые обладали свойствами АГ в РСК [Пожарская В. О., 1997]. Циркуляция трепонем вызывает образование специфических AT, которые иммобилизуют возбудитель и обусловливают реакции АТ-зависимой цитотоксичности. Их наличие можно выявить в реакции непрямой иммунофлюоресценции. В динамике заболевания также образуются неспецифические продукты реагинового типа (вассер-мановские AT), взаимодействующие с липидами, экстрагированными из клеток млекопитающих [Пожарская В. О., 1997].
ГХ-МС-анализ углеводных компонентов
Липидные, углеводные и аминокислотные компоненты были химически модифицированы с помощью BSTFA (бисилилтрифтор-ацетат) в триметилсилильные соединения.
Хроматографические исследования проводили на хроматографе Hewlett-Packard-5840 с капиллярной кварцевой колонкой длиной 20 м, заполненной неподвижная метилсиликоновой фазой — СР sil 5. Температурный режим программируемый от 50 С до 280 С со скоростью 3 град/мин. Температура испарителя 250 С, газ носитель — гелий. Идентификацию соединений и обработку данных проводили на ЭВМ ГХ-МС системы типа HP-1000.
Для хромато-масс-спектрометрического анализа сигнальных соединений группы лактонов, хинолов и фурановых эфиров нами использовалась хроматографическая система с хроматографом НР-5890 и масс-селективным детектором МСД-НР-5972А, системой обработки данных HP MS Chem Station с программным обеспечением Microsoft Windows 3.1.
Для идентификации соединений использовались спектральные библиотеки Nist и Wiley.
При исследовании углеводных компонентов мы следовали рекомендациям крупного руководства по хроматографическим исследованиям Chromatography. Fundamentals and applications of chromatographic and electrophoretic metods. Part B. Applicationa. 1983, используя триметилсилильные производные Сахаров. Преимущество использования ТМС-эфиров в качестве летучих производных для газожидкостной хроматографии углеводов перед другими методами заключается главным образом в возможности превращения в эти производные Сахаров всех классов, включая аминодезокси- и ацета-мидодезокси сахара, уреновые кислоты, альдоно-лактоны, альдеро-вые кислоты и сложные метиловые эфиры метилгликозидов и N-ацильные производные нейраминовой кислоты.
Метод, включающий метанолиз и последующее ТМС-лирование, представляет интерес для анализа гликопротеидов, гли-козаминогликанов и полисахаридов клеточных стенок бактерий, так как вес моносахаридные компоненты этих полимеров могут быть определены одновременно в форме триметилсилированных производных метилгликозидов. Для таких разделений необходимо программирование температуры в диапозоне 80-250 С.
Высшие лактоны выделялись из сыворотки крови с помощью различных процедур экстракции — без гидролиза, с энзиматическим и кислотным (соляная кислота) гидролизом.
Образцы анализировались методами ВЭЖХ, используя квад-рупольный масс-селективный детектор с ионной ловушкой и ГХ-МС методы. Идентификация метаболитов основывалась на MS, MS-MS и MS -масс-спектрах. Использовались различные способы ионизации: электроспрей и химическая ионизация при атмосферном давлении. Методами ВЭЖХ определено семь метаболитов лактонов. Сравнительный анализ методов ГХ-МС и ВЭЖХ-МС анализа показывает определённые преимущества ГХ-МС метода с возможностью быстрого скринингового исследования биологического материала на основе селективных ионов.
Альдонолактоны и альдоновые кислоты определялись также с помощью метода капиллярного электрофореза. Показана возможность одновременного разделения кислотных и основных метаболитов в 30 мМ ацетате натрия с рН 4,0. Однако количественное определение всех компонентов группы альдоновых кислот, альдонолак-тонов и других метаболитов лактонов было затруднено, так как они экстрагируются при различных значениях рН. Количественная экстракция в этил ацетат для кислотных метаболитов осуществляется при рН 1-3, а наиболее полная экстракция альдонолактонов происходит при рН 9-11.
При минимальных концентрациях определяемых соединений проводилось предварительное концентрирование и разделение метаболитов с помощью системы для капиллярного электрофореза «Капель-105». Все определения выполнены на не модифицированном капилляре (Ьэр=50 см) при длине волны детектирования 220-240 нм. Ввод проб осуществлялся гидродинамически при 30 Мбар в течение 20 сек. Состав и рН воздушного электролита влиял на электрофоре-тическую подвижность компонентов, степень разрешения и селективность.
Статистическая обработка. Статистическую обработку результатов исследования проводили на ЭВМ Pentium. Статистическая обработка данных клинико-лабораторных исследований проводилась с применением многомерной статистики — корреляционного, факторного и кластерного анализов — по программе Гарвардского университета BMDP-2M для биомедицинских исследований. Также использовался пакет прикладных программ Excel версия 7.0, раздел программ «Анализ данных». Различия между сравниваемыми величинами признавались статистически достоверными при уровне значимости р 0,05 по критерию Стыодента.
При корреляционном анализе использовался коэффициент Юла, который высчитывался с помощью таблицы сопряжённости, а также с помощью корреляционной матрицы программ биомедицинских исследований Гарвардского университета BMDP-2M.
Величина коэффициента корреляции указывала на связь между факторами: от 0 до 0,3 — слабой силы, от 0,3 до 0,7 — средней силы, от 0,7 до 0,9 — сильную взаимозависимость, 1 — полную (функциональную) связь. В работе анализировались только статистически достоверные данные.
Для оценки диагностической значимости разработанных ГХ-МС критериев, использовали унифицированные критерии пригодности лабораторных тестов для диагностики определенной формы патологии, применённые R. Galen и S. Gambino (1975) и В. В. Меньшиковым (1982) основанные на решении теоремы Байеса (расчет вероятности распределения результатов исследования).
Диагностическая чувствительность, диагностическая специфичность, диагностическая предсказуемость положительная, диагностическая предсказуемость отрицательная рассчитывались следующим образом:
ГХ-МС-анализ молекулярных маркёров поражения нервной системы (головной мозг)
Течение сифилиса, как и любого другого инфекционного заболевания прежде всего обусловлено свойствами и взаимодействием микроба Treponema pallidum и организма, происходящая в определённых условиях среды. Основную роль в клиническом течении сифилиса играет состояние организма, причём факторы, снижающие или повышающие иммунный статус организма, могут соответствующим образом усиливать или ослаблять патогенное действие Treponema pallidum, а иногда успешно защитить человека от заражения сифилисом.
Успешному противостоянию организма человека инфицированию сифилисом способствует наличие у части здоровых людей в сыворотке крови термолабильных трепонемостатических и трепоне-моцидных соединений, а также, возможно генетически обусловленной невосприимчивостью отдельных лиц к инфекции. Организм человека, являющийся средой обитания для попавших в него Treponema pallidum, активно воздействует на их вирулентность, что приводит к возникновению авирулентных форм, сохранению и размножению возбудителя. Несмотря на потерю вирулентности, эти формы Treponema pallidum в организме человека сохраняют жизнеспособность в течение всей его жизни. При неблагоприятных условиях эти формы Treponema pallidum вновь становятся вирулентными и вызывают активные проявления сифилиса.
Возможно, что эти особенности взаимодействия микроба и организма отчасти объясняют длительное бессимптомное течение сифилиса.
Распространение Treponema pallidum в начале болезни не вызывает какой-либо клинической симптоматики, однако, под влиянием антигенных свойств возбудителя уже с самого начала болезни реактивность организма подвергается глубоким изменениям. Это проявляется с одной стороны, повышению защиты организма по отношению к возбудителю (иммунитет), а с другой стороны — изменением чувствительности тканей к Treponema pallidum (аллергия). Эти два феномена следует рассматривать как две стороны одного и того же биологического процесса — изменению реактивности организма под влиянием сифилитической инфекции. Обладая одной причинной связью, они имеют различное, то параллельное, то противоположное развитие, обуславливающее богатую и разнообразную гамму клинических, физиологических и патоморфологических изменений, т. е. эволюцию сифилитической инфекции. Указанные выше особенности эволюции сифилитического процесса предполагают различные варианты его клинического течения.
Длительное бессимптомное течение приобретённого сифилиса может продолжаться достаточно долго, у этих больных отсутствуют ранние активные формы заболевания, и оно диагностируется, как правило, случайно на основании положительных серологических реакций уже в стадии позднего скрытого сифилиса или в стадии ней-росифилиса и сифилиса внутренних органов. М. В. Митич (1987) считает этот вариант течения сифилиса столь же частым и характерным, как обычный классический сифилис, подробно описанный Ri-cord в 1838 году.
Универсальный аналитический метод ГХ-МС с его высокой информативностью, чувствительностью и специфичностью, позволил нам охарактеризовать некоторые патогенетические механизмы течения инфекционного люэтического процесса. Вышесказанное хорошо иллюстрируют следующие клинико-лабораторные примеры: На рис. 6.1 представлена хроматограмма липидных компонентов сыворотки крови больного М., серопозитивного с наличием сифилитической инфекции и очагов поражения костей с периосталь-ной реакцией. ГХ-МС методами идентифицированы следующие соединения: 10,99 — Сш-жирная кислота; 11,08 — Сіг-жирная кислота; 16,35 — С]8:о-стеариновая кислота; 16,58 — С]8:1-олеиновая кислота; 17,26 — этиловый эфир гексадеканоевой кислоты; 18,20 — С]8;2-линолевая кислота; 22,78 — С2о:4-арахидоновая кислота. Пример 2. На рис. 6.2 представлена хроматограмма ЛЖК и фенилкарбо-новых кислот сыворотки крови больного К., серопозитивного, с наличием сифилитической инфекции и безжелтушной формой сифилитического гепатита. ГХ-МС методами идентифицированы следующие соединения: 3,63 — пропионовая кислота; 4,02 — масляная и изомасляная кислота; 6,17 — изовалериановая кислота; 15,60 — фенилуксусная кислота; 16,34 — С8;0-стеариновая кислота; 19,00 — фенилпропионовая кислота; 22,77 —липидно-белковый неразделённый комплекс. Пример 3. ГХ-МС методами идентифицированы следующие соединения: 6,40 — фосфорная кислота; 11,34 — D-галактоза; 13,61 — инозитол; 16,34 — N-диметилоктил-амин; 17,76 — D-трентол. Пример 4. На рис. 6.4 представлена хроматограмма аминокислотных компонентов сыворотки крови больного В., серопозитивного, с наличием сифилитической инфекции, явлениями люэтической септицемии. ГХ-МС методами идентифицированы следующие соединения: 16,31 — норвалин; 16,54 — глутаминовая кислота; 16,58 — лизин; 17,52 — пурин; 18,11 — орнитин; 18,18 — тирозин; 18,48 — триптофан; 18,93 — фенилаланин; 19,34 — аминоглюкоза; 20,02 — гек-ситол; 20,44 — аминосахар; 22,71 — неидентифицированное соединение (белково-липидный комплекс).
ГХ-МС-анализ лактонов
Проблема диагностики сифилиса связана, прежде всего, с большой распространённостью заболевания, возможностью поражения любых органов и тканей, наличием скрытых форм заболевания.
Привлечение в диагностический арсенал методов газовой хроматографии и масс-спектрометрии позволяет с высокой степенью достоверности определить наличие поражения органов и систем при отсутствии положительных серологических реакций и выраженных клинических проявлений болезни. Диагностические возможности методов ГХ-МС анализа мы использовали по трём направлениям: 1. хроматографический и ГХ-МС анализ биохимических изменений метаболизма в сыворотке крови больных с определением липид-ных компонентов, углеводных компонентов и аминокислотных компонентов; 2. хроматографический и ГХ-МС поиск сигнальных соединений для реализации микробами «кооперативной чувствительности» — лактонов, хинолонов и фурановых эфиров. 3. хроматографический и ГХ-МС поиск молекулярных маркёров органных поражений (ранние стадии заболевания), в частности молекулярных маркёров поражения нервной системы (головной мозг), печени и костных структур. Определяя люэтическую инфекцию, как инфекционный процесс, развивающийся по септическому типу с появлением возбудителя в крови (так называемая люэтическая септицемия), развитием органных поражений (висцеральный сифилис) с поражением нервной системы, печени и костных структур, с интоксикацией и выраженной лихорадкой, мы стремились последовательно разрабатывать методические приемы хроматографического анализа соответственно развитию люэтического инфекционного процесса. По мнению С. А. Писаржевского (1999), сепсис —это состояние инфицированности организма, при котором резко усиливаются катаболические процессы в крови, определяются жизнеспособные микробы, резко повышается количество токсических микробных метаболитов, продуктов повреждения и деструкции тканей, а также медиаторов воспаления, а показатели активности эффекторного звена иммунитета снижены. По нашему мнению, развитие инфекционного люэтического процесса вполне соответствует вышеприведенному определению. Методами ГХ-МС анализа нами исследованы сыворотки крови 117 больных сифилисом. Из 117 больных положительные серологические пробы (ИФА, РП, РПГА) установлены у 76 пациентов, отрицательные — у 41 пациента. Поражение костей и костных структур выявлены у 28 из 117 больных (23,9%), поражения кожи (пурпура, экзематозные и пустулёзные высыпания) — у 28 из 117 больных (23,9%), поражения печени (гепатит) — у 20 из 117 больных (17,0%), нарушения сердечнососудистой системы (гипертоническая болезнь, ИБС, миокардит) — у 23 из 117 больных (19,6%), поражения нервной системы — у 23 из 117 больных (19,6%), поражения ЛОР-органов (гайморит, гайморо-этмоидит) — у 13 из 117 больных (11,1%), хронический цистит — у 12 из 117 больных (10,2%). Приступая к ГХ-МС определению нарушений метаболизма в сыворотке крови больных при сифилисе, мы исходили из основного постулата молекулярной медицины — положения о том, что для каждой болезни каждого патологического проявления организма имеется молекулярная мишень, которую можно использовать как для диагностики заболевания, так и для лекарственного воздействия [Пальцев М. А., 2002; 2004]. Использование современных технологических и инструментальных разработок существенно расширяет возможности молекулярной диагностики. Практически все патогены могут быть диагностированы методами молекулярной биологии, причём более точно и в более короткие сроки, чем это можно сделать с помощью классических микробиологических методов. Мы исходили из того, что каждый микроб (в том числе и Treponema pallidum) имеет свой специфический молекулярный маркёр. Привлечение в арсенал методов лабораторной диагностики сифилиса ГХ-МС позволяет с высокой степенью достоверности определить наличие Treponema pallidum в организме по наличию специфического молекулярного маркёра. Рассматривая биохимические изменения сыворотки крови под влиянием сифилитической инфекции, мы оценивали соотношение липидных, углеводных и аминокислотных компонентов сыворотки крови, которые составили: липидные компоненты — 88,90-89,80% (средн. 89,35±7,13%); углеводные компоненты — 2,79-2,89% (средн. 2,84±0,38%); аминокислотные компоненты — 7,31-8,31% (средн. 7,81±0,85%). В состав липидных компонентов входили традиционные метаболиты анаэробных грам отрицательных бактерий — летучие жирные кислоты (суммарно от 1,64±0,23 ммоль/л до 3,33±0,47 ммоль/л), а также холестерин и его эфиры (суммарно от 12,87±2,29 ммоль/л до 13,45±1,94 ммоль/л); триглицериды — от 5,55±0,52 ммоль/л до 7,81±1,22 ммоль/л; фосфолипиды (от 12,87±2,29 ммоль/л до 13,45±1,94 ммоль/л); C14-C20 жирные кислоты (суммарно от 1,26±0,41 ммоль/л до 4,12±0,38 ммоль/л); изо- и антиизокислоты (суммарно от 1,12±0,33 ммоль/л до 1,21±0,55 ммоль/л).
В состав углеводных компонентов входили: D-глюкоза и изомеры глюкозы (суммарно от 0,4б±0,06 ммоль/л до 0,63±0,012 ммоль/л); D-галактоза и её изомеры (суммарно от 0,270±0,0192 ммоль/л до 0,322±0,0542 ммоль/л), L-фукоза и аминосахара (соответственно от 0,14±0,015 ммоль/л до 0,18±0,019 ммоль/л и от 0,19±0,021 ммоль/л до 0,23±0,018 ммоль/л), ацетилированные амины глюкозы и маннозы (соответственно от 0,0060±0,00002 ммоль/л до 0,0064±0,00003 ммоль/л и от 0,0048±0,00005 ммоль/л до 0,0052±0,00006 ммоль/л).
В состав аминокислотных компонентов входили: алифатические аминокислоты (суммарно от 1,161±0,1708 ммоль/л до 1,237±0,1709 ммоль/л); оксиаминокислоты (суммарно от 0,24±0,013 ммоль/л до 0,25±0,015 ммоль/л); дикарбоновые аминокислоты и амиды (от 0,8862±0,0932 ммоль/л до 0,93 68±0,1033 ммоль/л); основные аминокислоты (от 0,53±0,061 ммоль/л до 0,бЗ±0,66 ммоль/л); ароматические аминокислоты (от 0,246±0,0838 ммоль/л до 0,282±0,0999 ммоль/л); серусодержащие аминокислоты (от 0,14б±0,017 ммоль/л до 0,154±0,020 ммоль/л).
Следующая группа диагностических критериев связана с существованием так называемой «кооперативной чувствительности» микробов или «чувством кворума» (quorum sensing). Считая сифилис септикоподобным состоянием с наличием возбудителя в крови, наличием люэтических метастазов в органах и тканях, температурной реакцией, мы предложили использовать наличие активаторов «кооперативной чувствительности» в сыворотке крови для оценки риска генерации люэтической инфекции.
Известно, что генетический механизм реализации «кооперативной чувствительности» позволяет патогенным бактериям рационально использовать свой болезнетворный потенциал, определяя системой quorum sensing момент включения генов патогенности только после достижения бактериями определенной плотности, при которой синтезирующееся количество факторов патогенности гарантирует успешное развитие инфекционного процесса. Активаторами «кооперативной чувствительности» являются низкомолекулярные соединения группы лактонов, хинолонов и фурановых эфи-ров бора.
