Введение к работе
Актуальность проблемы. Борьба с вредителями сельского и лесного хозяйства,уничтожающими до 20-30% урожая,' является одной из важнейших задач настоящего времени. По ряду биологических и технологических признаков наиболее эффективными продуцентами микробиологических средств защиты растений служат бактерии Bacillus thuringiensls (ВТ), успешно используемые в промышленности ряда стран., Основным положительным свойством бактериальных средств защиты растений является высокая специфичность энтомоцидного действия. Препараты на основе спер и белковых кристаллических включений различных серотипов Bacillus thuringiensls токсичны для представителей отрядов Lepidoptera, Diptera и Coleoptera. На основе некоторых штаммов B.thurlnglensls, продуцирумцих j>-экзотоксин, созданы препараты, 'значительно расширяющие спектр инсектицидного действия B.thurlnglensls.
Совершенствование качества энтомопатогенных препаратов и технологии их производства и применения является исключительно важной задачей. Используемые в производстве штаммы выделены из природных источников и не всегда отвечают технологическим требованиям при промышленном культивировании. В связи с этим, производство осложняется рядом факторов, среди которых необходимо отметить нестабильность" признака токсинообразования и фа-голизис. Причиной фаголизиса может быть как инфицирование фагом извне, так и использование в качестве штаммов-продуцентов лизогешшх культур. В этой связи большую актуальность приобретает проблема создания фагорезистентных высокоактивных продуцентов, включающая необходимость всестороннего изучения физиологии, биохимии и генетики B.thurlnglensls и конкретных взаимоотношений в системе фаг-клетка.
На основе спор, кристаллов и я-экзотоксина штаммов В.thuringiensls subsp.thuringiensls создан препарат битоксибацил-лин, один из ведущих отечественных препаратов, широко применяемый против насекомых отрядов Coleoptera и lepidoptera.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение взаимоотношений в системе фаг-клетка Bacillus thuringiensls для выявления фаговой инфекции в производстве битоксибациллина и разработки мер борьбы с ней на основе создания фагорезистентных штаммов-продуцентов.
В связи с этим были поставлены следующие задачи: I.- Изучить структурные и молекулярно-биологические свойства фагов, выделенных из фаголизисных операций при производстве битоксибациллина ;; 2. Выделить фагорезистентше, технологически значимые продуценты битоксибациллина; 3. Изучить молекулярно-биоло-гическими методами свойства. селектированных фагорезистентшх штаммов; 4. "С использованием полученного фагорезистентного штамма выделить из почвы новый фаг, обладающий широким спектром литического действия; 5. Получить на основе селектированного фагорезистентного штамма акристаллические фагорезнстент-ные мутанты, для использования их в качестве потенциальных реципиентов крксталлкодируодих плазмид.
Научная новизна. Проведен структурный и молекулярно-биоло-гический анализ фагов, выделенных из фаголизисных операций при производстве битоксибациллина. Показано, что наибольшую опасность, для производства представляют фаги ТЬ-2 группы, обладающие высоким относительным урожаем. Установлено, что попеременное использевание в производстве чувствительных и устойчивых к инфекции фагов продуцентов приводит к появлению "модифицированных" фагов, характеризующихся расширенным спектром литического действия. С использованием группы ТЬ-2 фагов выделены 34 фагоустойчивых мутанта штамма Bacillus thuringiensls HI-I77, продуцента битоксибациллина. Показано, что фагоустойчивые мутанты в различной степени ограничивают развитие фагов и сохраняют при этом основные технологические параметры-уровень синтеза эндотоксина, экзотоксина, титр спор. Фагорезистентность отобранных штаммов обусловлена, по-видимому, хромоеомальными мутациями, влияющими на внутриклеточное развитие фагов, что гарантирует стабильность признака фагорезистентности отобранных продуцентов. Изучены плазмидные профили фагорезистентшх штаммов'. Осуществлена- межвариантная транедукния плазмвды рВСІб (Тс* ) в фагарезистентные штаммы. С использованием селектированного фагоустойчивого штамма'НІ-С6, полностью ограничивающего, развитие фагов ТЬ-2 группы, выделен из почвы и изучен новый транедуцирующий фаг Tt9I, обладающий широким спектром литического действия. На основании данных об устойчивости ДНК фага Tt9I к рестриктазам к плавлении ДНК данного фага в широком интервале температур' высказано предположение о возможных аномалиях в составе ДНК фага Tt9I. На основе штамма HI-C6 получены
- З -акристаллические фагоустойчивые реципиенты. Изучены плазмидные профили акристаллических мутантов. Показана роль низкомолекулярной 5,6-МДа плазмиды в регуляции количественной продукции эндотоксина. Установлено, что продукцияр-экзотоксина в штамме НІ-С6- определяется плазмидой, детерминирующей продукцию кристаллических включений.
Практическая значимость работы. Выполненный структурный и молекулярно-биологический анализ фагов ТЬ-2 группы являлся необходимым условием создания фагорезистентных высокотехнологичных штаммов - продуцентов битоксибациллина. Использование в качестве продуцентов биоинсектицида созданных" высокоактивных фагорезистентных штаммов позволит получать препарат высокого качества при более экономичном ведении процесса производства. Селектированные фагорезистентные штаммы могут быть использованы как универсальные доноры фагоустойчивости. Выделенный из почвы новый трансдуцирукщий фаг Tt9I благодаря широкому спектру литического действия и большим размерам может быть использован для генетического картирования. Полученные акристаллические фагоустойчивые мутанты могут быть использованы, в качестве реципиентов плазмид, кодирующих синтез белков с различным спектром инсектицидного действия.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на семинарах лаборатории генетики и селекции знтомопатогенных бактерий ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, на заседаниях кафедры "Биотехнология микробного синтеза" МТИШ, на XIV Конференции по электронной микроскопии (биология и медицина, Москва, 1992).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре работы.
Структура и объем диссертации, диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы. 12 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения, выводов и списка-литературы, включающего 220 наименований, в том числе 183 зарубежных авторов.