Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1 Роль V.cholerae nonO1/nonO139 в этиологии ОКИ 17
1.2 Источники и пути передачи инфекции 20
1.3 Серогруппы V.cholerae nonO1/nonO139 21
1.4 Факторы патогенности 23
1.5 Антибиотикорезистентность V.cholerae nonO1/nonO139 26
1.6 Гетерогенность популяций и генетический обмен 28
1.7 Происхождение НАГ-вибрионов 32
Глава 2. Материалы и методы 35
2.1 Штаммы холерных вибрионов неО1/неО139 серогрупп 35
2.2 Питательные среды и условия культивирования 43
2.3 Методы выделения и идентификации НАГ-вибрионов 43
2.4 Метод серотипирования 44
2.5 Метод определения чувствительности к антибиотикам 44
2.6 Метод определения нейраминидазной активности 45
2.7 Метод определения агглютинации эритроцитов 45
2.8 Метод определения чувствительности/устойчивости к Dicty-ostelium discoideum 45
2.9 Определение антибактериальной активности 46
2.10 Молекулярно-биологические методы 46
2.10.1 Детекция генов с помощью ПЦР 46
2.10.2 Секвенирование ДНК 49
2.10.3 Биоинформационый анализ 49
Глава 3 Распространение, этиологическая значимость и фенотипическая характеристика холерных вибрионов неО1/неО139 серогрупп 54
3.1 Анализ заболеваемости ОКИ, вызванными холерными вибрионами неО1/неО139 серогрупп в Ростовской области и республике Калмыкия 54
3.2 Результаты мониторинговых исследований проб воды и гид-робионтов Таганрогского залива на наличие холерных вибрионов 57
3.3 Сравнительный анализ фенотипических свойств представителей разных популяций V.cholerae nonO1/nonО139 58
3.4 Определение чувствительности штаммов V.cholerae nonO1/nonO139 к антибиотикам 62
Глава 4 ПЦР-генотипирование холерных вибрионов неO1/неO139 серогрупп 67
4.1 ПЦР-детекция генетических детерминант факторов патоген-ности и персистенции 67
4.2 Кластерный анализ распределения генов у штаммов холерных вибрионов неО1/неО139 серогрупп 83
Глава 5 Изучение структуры геномов холерных вибрионов неO1/неO139 серогрупп 87
5.1 Полногеномное секвенирование и биоинформационный анализ полученных последовательностей ДНК 87
5.2 Сравнительный биоинформационный анализ генов наиболее значимых факторов патогенности/персистенции и их продуктов 89
5.2.1 Структура и изменчивость MARTX и RtxC 89
5.2.2 Структура и изменчивость генов и белков cholix-токсина 95
5.2.3 Структура и изменчивость протеаз НАГ-вибрионов 100
5.2.4 Структура и изменчивость Сef (CHO cell elongating factor) 101
5.2.5 Структура и изменчивость гемолизина HlyA 104
5.2.6 Структура и изменчивость нейраминидазы (NanH) 105
5.2.7 Структура и изменчивость белков наружной мембраны 107
5.2.8 Структура и изменчивость субъединиц пилей MSHA 109
5.2.9 Структура и изменчивость регуляторных белков ToxR и HapR 114
5.2.10 Контакт-зависимые системы секреции третьего и шестого типов (T3SS и T6SS) 115
5.2.11 Штамм, содержащий профаг preCTX и остров VPI 122
5.3 Мозаичная структура и пластичность генома НАГ-вибрионов 124
Заключение 127
Выводы 135
Список использованной литературы 132
- Гетерогенность популяций и генетический обмен
- Анализ заболеваемости ОКИ, вызванными холерными вибрионами неО1/неО139 серогрупп в Ростовской области и республике Калмыкия
- Кластерный анализ распределения генов у штаммов холерных вибрионов неО1/неО139 серогрупп
- Контакт-зависимые системы секреции третьего и шестого типов (T3SS и T6SS)
Гетерогенность популяций и генетический обмен
Геномы НАГ-вибрионов характеризуются высокой степенью гетерогенности. Они представлены множеством геновариантов, обнаруживаемых при анализе как тотальной ДНК, так и отдельных генов и находящихся в составе кластеров. Популяции, циркулирующие на одних и тех же территориях, включают множество штаммов, различающихся между собой по наличию/отсутствию генетических детерминант факторов патогенности [Ерошенко Г.А. с соавт., 2007; Faruque S.M. et al., 2004; Octavia S. et al., 2013], а также по другим молекулярным характеристикам – риботипам [Dalsgaard A. et al., 1995; Faruque S.M. et al., 2004; Cariri F.A. al., 2009], VNTR-типам [Онищенко Г.Г. с соавт., 2003], MSLT-типам [Octavia S. et al., 2013], PFGE-типам [Sharma C. et al., 1998; Bakhshi B. et al., 2008; Dutta D. et al., 2013], RAPD-PCR-профилям [Theophilo G.N.D. et al., 2006; Фадеева А.В., 2012]. Клональность по одной-двум характеристикам наблюдается редко, только в отдельных случаях. Например, пять tcpA+ клинических штаммов, выделенных в 2003 г. в Калькутте, относились к одному и тому же риботипу, но к разным серогруппам [Сhatterjee S. et al., 2009]; в Лиме (Перу) среди возбудителей вспышки в 1994 г. идентичные ри-ботипы имели все штаммы О12 серогруппы, тогда как 83 % штаммов О10 серо-группы относились к другому риботипу, однако остальных имели уникальные риботипы [Dalsgaard A. et al., 1995]; в Таиланде (Бангкок, 1990-е гг.) выделялись представители многих серогрупп, и среди них были выявлены семь штаммов V.cholerae О37 с общим риботипом, но из них один оказался содержащим плазмиду [Dalsgaard A. et al., 1999]; в Бразилии шесть штаммов (по два относящихся к О6, О26 и О45 серогруппам), были идентичными по RAPD-PCR-профилям [Theophilo G.N.D. et al., 2006]; в Нигерии изолированы четыре клинических штамма с идентичными MLSA- и PFGE-профилями [Marin M.A. et al., 2013]; 10 из 22 токсигенных штаммов из Узбекистана, обладали общими VNTR-генотипом, RAPD-PCR-профилем, набором генов факторов патогенно-сти/персистенции, содержащими идентичные мутации, но при этом относились к разным серогруппам [Онищенко Г.Г. с соавт., 2003; Фадеева А.В., 2012]. Проведение полноценного сравнительного анализа данных, полученных разными авторами с использованием различных подходов практически невозможно. Как правило, не совпадают и результаты филогенетических исследований одних и тех же штаммов с применением неодинаковых методов. Очевидно, это свидетельствует о независимом характере изменчивости разных участков генома.
НАГ-вибрионы, выделяемые из ООС, еще более гетерогенны по сравнению с клиническими и чаще содержат меньшее число детерминант факторов патогенности [Ерошенко Г.А. с соавт., 2007; Фадеева А.В., 2012]. Вместе с тем, все они сохраняют гены, продукты которых обладают двойной функцией, являясь одновременно факторами патогенности и жизнеобеспечения. В частности, к ним относятся гемагглютинин/протеаза, CHO-удлиняющий фактор Cef, гемолизина HlyA [Монахова Е.В., 2012]. Кластер RTX и остров патогенности VPI-2 выявляются не у всех штаммов и могут содержать делеции [Монахова Е.В., 2012]. Вместе с тем, детерминанты токсинов, существенных для проявления патогенных свойств, присутствуют у штаммов с неэндемичных территорий, где заболеваемость населения отсутствует. Например, штаммы, содержащие про-фаг CTX или ген термостабильного токсина, были обнаружены в водоемах не только в Юго-Восточной Азии [Chen A.Z. et al., 2004; Faruque S.M. et al., 2004; Sharma A., Chaturvedi A.N., 2006; Jagadeeshan S. et al., 2009; Bakshi B. et al., 2012; Hasan N.A. et al., 2013; Waturangi D.E. et al., 2013; Li F. et al., 2014; Diep T.T. et al., 2015], Латинской Америки [Theophilo, G. N. D., et al., 2006], но также в США [Dalsgaard A. et al., 2001; Jiang S. et al., 2003; Zo Y.G. et al., 2009; Ceccarelli D. et al., 2015;], центральной Италии [Caldini G. et al., 1997], Германии, Японии, Австралии [Octavia S., 2013], а имеющие кластер T3SS достаточно широко представлены в водных популяциях в разных странах, в том числе и в России [Монахова Е.В., 2012; Hasan N.A. et al., 2013; Islam A. et al., 2013; Cecca-relli D. et al., 2015]. В ООС Австралии и Китая выявлены штаммы с геном cholix-токсина [Islam A. et al., 2013; Li F. et al., 2014]. Зарубежные авторы считают, что НАГ-вибрионы из ООС потенциально опасны независимо от «энде-мичности» их местообитаний, как и от числа имеющихся у них детерминант факторов патогенности. В нашей стране им придают гораздо меньшее значение, вероятно, по причине их постоянного обнаружения практически во всех водоемах при мониторинговых исследованиях, а случаи обусловленных ими заболеваний среди населения прилежащих территорий регистрируются довольно редко. Более того, даже при выявлении больных с подтвержденным диагнозом «ОКИ, вызванная НАГ-вибрионами», не проводится оперативное бактериологическое исследование возможных источников инфекции, направленное на обнаружение в них возбудителей. Отсюда вытекает невозможность сравнения штаммов из ООС с клиническими по фено- и генотипическим признакам. По-видимому, расширенные генетические исследования, в связи с дороговизной и слишком большим числом штаммов, выделяемых из ООС, следует признать актуальными на тех территориях, где регистрируются заболевания.
Популяции НАГ-вибрионов, циркулирующих на определенных террито 31 риях, несмотря на гетерогенность в совокупности содержат значительный набор генов, связанных с патогенностью, персистенцией и антибиотикорези-стентностью и способных передаваться горизонтально. Schuster B.M. et al. (2011) провели расширенный биоинформационный анализ данных MLSA-типирования штаммов из гетерогенной эстуарной популяции, обитающей на северо-востоке США. Ими были использованы несколько компьютерных программ и получены «виртуальные» доказательства наличия в этой популяции процессов рекомбинации. Реальная же способность к горизонтальному переносу генов была показана экспериментально, и не только среди НАГ-вибрионов, но также между представителями неО1/неО139 и О1 серогрупп. Известно, что передача фага CTX не ограничивается «традиционной» TCP-зависимой транс-дукцией и может осуществляться с участием других фагов, а также за счет иных способов [Титова С.В., Монахова Е.В., 2016]. Например, в Калифорнии из прибрежных вод были выделены литические фаги, осуществляющие перенос профага CTX от вибрионов Эль Тор штаммам НАГ-вибрионов [Choi S. et al., 2010]. Представители О141 серогруппы, содержащие профаг CTX классического типа и лишенные способности к образованию его инфекционных вирио-нов, в микрокосмах со специфичным для них литическим фагом в присутствии хитинового субстрата успешно передали его вибрионам биовара Эль Тор путем трансформации [Udden S.M.N. et al., 2008]. Hofer E. et al. (1999) осуществили конъюгативный перенос плазмиды, включающей несколько генов лекарственной устойчивости, от донорного штамма О1 серогруппы антибиотикочувстви-тельным НАГ-вибрионам.
Передаваться горизонтально могут и гены кластера, ответственного за биосинтез О-антигенов (rfb). Yamasaki S. et al. (1999) определили его состав и пришли к выводу, что смена серогрупп происходит не за счет простых мутаций, а включает горизонтальный перенос. Затем Li M. et al. (2002) опубликовали результаты секвенирования данного кластера штамма O37 серогруппы, свидетельствующие в пользу возможности такого переноса. Это предположение экспериментально подтвердили Blokesch M., Schoolnik G.K. (2007), в опытах по передаче О37-специфичных генов посредством трансформации в присутствии хитина ДНК вибриона О37 серогруппы в штамм V.cholerae О1, при этом в геномах полученных рекомбинантов произошла делеция О1-специфичных генов. Basu S., Ghosh R.K. (2005) установили, что при заражении штамма O1 серо-группы умеренным фагом PS166 образуются лизогены, утратившие агглютина-бельность О1-холерной сывороткой, но сохранившие профаг CTX и остров VPI, а потом (2009) среди нетоксигенных клинических НАГ-вибрионов обнаружили два штамма, обладающие способностью к продукции инфекционных частиц этого фага. Однако необходимо отметить, что приоритет в осуществлении конъюгативного переноса генов rfb от НАГ-вибриона токсигенным штаммам O1/O139 серогрупп и в обратном порядке, сопровождавшегося изменениями серогрупповой принадлежности рекомбинантов, принадлежит отечественным авторам [Смирнова Н.И. с соавт., 1996; Smirnova N.I. et al., 1995].
Анализ заболеваемости ОКИ, вызванными холерными вибрионами неО1/неО139 серогрупп в Ростовской области и республике Калмыкия
В Ростовской области (РО) в 1960-70-е годы заболеваемость, вызванная НАГ-вибрионами, носила вспышечный характер, после чего в тех же населенных пунктах периодически регистрировали спорадические случаи заболеваний. Динамика выделения культур V.cholerae nonO1/nonO139 от больных представлена на рисунке 1.
Результаты дальнейших исследований, проведенные с 2000 по 2018 гг. показали, что в инфекционные отделения медицинских учреждений РО поступило 38 больных ОКИ, от которых было изолировано 40 штаммов НАГ-вибрионов. Было установлено, что заболевшие с 2000 по 2018 гг. проживали в населенных пунктах на побережье рек и Азовского моря. В 2000, в 2005 и 2006 гг. было выявлено по одному больному в двух районах области (Ремонтненский, Каменский) и в г. Таганроге. В г. Таганроге зарегистрировано трое больных в 2007 г. и один в 2008 г., такое же количество заболевших выявлено в эти годы и в других населенных пунктах Неклиновского района. В 2009 г. заболело трое человек в Неклиновском районе и один Азовском, а также по двое в 2011 и 2012 гг. в г. Таганрог (рис. 2).
Заболевания регистрировались в летние месяцы с конца мая по конец августа, в подавляющем большинстве в июле и августе. Следует отметить, что в 2014 г. 29,7 % от общего количества зарегистрированных больных (37) было выявлено фактически в течение 35 календарных дней – с 20 июля по 24 августа. Возраст больных в период с 1968 по 1999 гг. варьировал от 4 месяцев до 79 лет. Среди заболевших с 2000 г. преобладали дети от одного года до 9 лет – 60,5 % (23 из 38), а в 2014 г. – 90,1 % (10 из 11). В эпиданамнезе у детей чаще встречается упоминание о купании в различных водоемах. Взрослых развитие диареи связывали с употреблением продуктов питания.
Сравнительный анализ динамики выделения НАГ-вибрионов от людей на территориях РО и республике Калмыкия (РК), граничащих между собой, за 19-летний период представлена на рисунке 3.
На территории РК с 2000 по 2018 гг. от больных ОКИ был изолирован 61 штамм, поступивший в МЖК с ЦПВ Ростовского-на-Дону противочумного института. Заболевшие зарегистрированы в 10 населенных пунктах (г. Элиста, п. Овата, п. Яшкуль, с. Троицкое, п. Чилгир, с/з Утта, п. Нарын, п. Ики-Чонас, п. Комсомольский, п. Кетченеры). Возраст заболевших варьировал от 6 месяцев до 70 лет, дети до 14 лет составили 48,3 %.
По данным историй болезни клиническими проявлениями у больных РО и РК были рвота, диспептические расстройства, боли в эпигастральной области. В подавляющем большинстве случаев превалировали следующие диагнозы: «острая кишечная инфекция», «острый гастроэнтероколит», реже «пищевая токсикоинфекция» со среднетяжелой формой течения.
Таким образом, на территориях РК и РО регистрируется спорадическая заболеваемость ОКИ, вызванными данными микроорганизмами, в летние месяцы с пиком заболеваний в Калмыкии в 2000 и 2005 (соответственно 16 и 13 человек) и Ростовской области в 2014 (14). При этом на территориях данных субъектов из водных ООС кроме НАГ-вибрионов выделялись также нетоксигенные штаммы холерных вибрионов О1 серогруппы, что, с нашей точки зрения, свидетельствует о создании в определенные периоды благоприятных условий для циркуляции V. cholerae разных серогрупп и возможности заражения людей.
Кластерный анализ распределения генов у штаммов холерных вибрионов неО1/неО139 серогрупп
Анализ описанных выше результатов ПЦР-генотипирования 256 штаммов НАГ-вибрионов, циркулирующих в РО и РК, позволил выявить 254 генотипа. С помощью авторского программного обеспечения, встроенного в геоинформационную систему «Холера. Штаммы – VNTR» [Водопьянов А.С. с соавт, 2007] они распределились по 12 кластерам, обозначенных A-L (рис. 5). Один их них (J) был представлен единственным клиническим штаммом (Элиста, 2006), два других (K и L) включали по два штамма. Вошедшие в состав кластера K были выделены от больных в 1976 и 2008 г. в РО, а в кластере L один (Ростов, 1981) существенно отличался от других наличием профага pre-CTX, второй (Таганрог, 1974) не имеет pre-CTX, однако по остальному набору генов близок к нему.
Внутри остальных кластеров штаммы отличались друг от друга наличием/отсутствием одного или нескольких генов, при этом клинические штаммы оказались более разнообразными и вошли в состав всех кластеров, а штаммы из ООС – в кластеры A, B, C, D, E, F вместе с клиническими (рис. 6).
A1 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A15 A16 A17 A23 A29
A30 A31 A33 A34 A35 A36 A37 A38 A39 A40 A41 A42 A43 A44 A45
B1 B3 B17 B18 B19 B2 B20 B21 B22 B23 B24 C1 C2 C4 C5
C6 C7 C8 C13 C14 C15 C16 C18 C19 C20 C21 C22 C23 C24 C25
C26 C27 C28 C29 D1 D11 D8 D9 E10 E2 F1 F4 F5 F6 F7
F8 F9 F10 F11 F12 F13 F14 F16 F18 F19 F2 F20 F21 F22 F23
человек F24 F25 F26 F27 F28 F29 F3 F30 F31 F32 F33 F34 F35 F36 F37
F38 F39 F40 F41 F42 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10
G11 G12 G13 G14 G15 G16 G17 G18 H1 H10 H11 H12 H13 H14 H15
H16 H17 H18 H19 H2 H20 H21 H22 H23 H24 H25 H26 H27 H28 H29
H3 H30 H31 H32 H33 H34 H35 H36 H4 H5 H6 H7 H8 H9
I1 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10 I11 I12 I13 I14 I15 I16
I17 I18 I19 I2 I20 I21 I22 I23 I24 I25 J1 K1 K2 L1 L2
рыба A25 A32 B7 B9
A12 A22 A24 A26 A27 A28 B4 B5 B6 B8 B11 B12 B14 B15 B16
морская вода C9 C10 C11 C12 C17 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D10 D12 D13 D14
D15 D16 D17 D18 D19 D20 E1 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 F15 F17
балластная вода A13 A14 A18 A19 A2 A20 A21 B10 B13 C3
Кластер А представлен холерными вибрионами, выделенными как от людей в 1968, 1974, 2000, 2001, 2003, 2005, 2007, 2014, 2015, 2016 годах, так и из воды Азовского моря в 2012 году и из рыбы в 2011 году. К кластеру В отнесены штаммы от людей 1969, 1975, 2014 гг. выделения, так и из морской и балластной вод и гидробионтов (рис. 7). Корреляции между установленными ПЦР-генотипами и принадлежностью к определенной серогруппе нами не выявлено, штаммы относящиеся к одной серогруппе принадлежали к разным генотипам. Например, 16 клинических штаммов О5 серогруппы, которые были изолированы от больных на обеих территориях попали в кластеры В, С, F, G, Н, I, L.
Заслуживает внимания тот факт, что наборы генов изменялись как у клинических штаммов, выделенных в разные годы, так и у обитателей поверхностных водоемов. Так, культуры, выделенные из морской воды в одной и той же стационарной точке (пляжи «Приморский», «Центральный») с интервалом в одну неделю, часто изменяли генотипы внутри кластеров, а иногда и попадали в разные кластеры (табл. 15).
Мы не исключаем, что в кишечник могут попадать сразу несколько штаммов с разными наборами генов, которыми они обмениваются ими между собой. Ранее было показано, что 33% случаев заболеваний, вызванных родственным видом V. parahaemolyticus, обусловлено генетически и серологически гетерогенной популяцией из-за заражения двумя-тремя разными штаммами [Bhoopong P. et al., 2007]. В настоящее время известен и один случай выделения от одного больного двух штаммов V.cholerae nonО1/nonО139 разных серогрупп [Dalsgaard A. et al., 1999].
Выявление конкретных наборов генов факторов патогенно сти/персистенции у V.cholerae nonО1/nonО139 различных серогрупп позволило с одной стороны, создать индивидуальный «генетический» портрет каждого штамма, с другой стороны, с помощью кластерного анализа объединить культуры со сходными генотипами в один кластер. Установление родственных генотипов у штаммов, изолированных из разных источников, свидетельствует о возможности генетических изменений этих микроорганизмов в зависимости от пребывания в различных экологических нишах (кишечник человека, водная экосистема, гидробионты).
Контакт-зависимые системы секреции третьего и шестого типов (T3SS и T6SS)
Кластер генов T3SS был выявлен у части изученных штаммов еще на этапе ПЦР-детекции ряда входящих в его состав генов. Анализ полных геномов подтвердил эти результаты, однако весь кластер был представлен в геномах фрагментарно, и лишь для двух штаммов (9760 и 9771) удалось собрать его полные коровые последовательности. Тем не менее, было установлено, что отдельные гены могли различаться по длине и аминокислотному составу.
На рис. 26 для примера показаны результаты AlignX-анализа продуктов генов ключевого эффектора-актиномодулятора vopF, которые были найдены в сиквенсах всех девяти T3SS-позитивных штаммов.
Все они также содержали ген другого эффектора, vopX, однако полная его последовательность была найдена в сиквенсах только двух штаммов, и обе были высоко гомологичны таковой vopX штамма AM-19226 (DQ124262), описанного Dziejman M. et al. (2005) и использованной в качестве прототипа.
В обоих собранных нами кластерах присутствовали все гены, имеющие отношение к контакт-зависимой секреции: структурных компонентов vcsN2, vcsC2, vcsT2, vcsR2, toxR2, vcsQ2, vcsU2, vcsV2, vspD, vcsJ2 и эфектора vopF, а также детерминанты гипотетических белков, причастность которых к секреции не установлена. Порядок расположения всех генов соответствовал таковому в T3SS AM-19226 (рис. 27), хотя некоторые отличались по длине, а у обоих наших штаммов между CDS12 и CDS13 присутствовало по одной дополнительной ORF, обозначенных нами как CDS-X. Эти гены были совершенно различны у двух штаммов, однако их продукты были идентифицированы программой Blastp как шапероны, и для обоих в NCBI были найдены гомологи (WP_069212916 для 9960; WP_019829899, KQA43205, OFI72669 и др. для 9771). CDS, идентичная CDS-X штамма 9760, была выявлена также в геноме штамма 19261, для которого полная последовательность кластера не была собрана. Эти данные свидетельствуют в пользу способности изученных штаммов к экспрессии T3SS, которая, по всей вероятности, определяет их патогенные свойства.
Что касается T6SS, то эта система кодируется не одним, а тремя кластерами генов – большим и двумя меньшими, дополнительными. Кроме детерминант структурных компонентов, каждый из них включает гены эффекторов, из которых наиболее существенными являются деградирующий пеп-тидогликан VgrG3, деполимеризующий и ковалентно связывающий актин VgrG1, порообразователь VasX и липаза TseL [Unterweger D. et al., 2014; Joshi A. et al., 2017]. У всех изученных штаммов был выявлен основной (большой) кластер генов, кодирующих структурные компоненты, однако не для всех удалось собрать полную последовательность входящего в его состав гена vgrG3: у 4 штаммов (6, 9798, 950, 19261) он был представлен лишь частично, т.к. его дистальная часть не попала в контиг. Гены vgrG3 всех остальных штаммов, кроме 912, имели разную длину, отличную от таковой прототипа, и содержали различные вставки/делеции, либо были в разной степени усечены за счет преждевременных стоп-кодонов. Тем не менее, в продуктах этих разнообразных измененных генов, кроме усеченных (рис. 28), программой Blastp все же был идентифицирован C-концевой пептидогликан-связывающий домен PBD. Однако кодирующие его последовательности у разных штаммов были изменены настолько, что не узнавались обратным праймером, поэтому в ПЦР были получены отрицательные результаты.
Из-за высокой степени гомологии проксимальных участков трех генов vgrG (1, 2 и 3) и ограничений программы-сборщика собрать vgrG1 не представлялось возможным. Исключение составил единственный штамм 12935. Тогда мы провели Blast-поиск последовательности, кодирующей ключевой актин-связывающий домен ACD (acd-vgrG1) и обнаружили, что она присутствовала в полных геномах всего семи штаммов. У них же и еще четырех (лишенных acd-vgrG1) имелся и ген vasX, тогда как в остальных геномах не было обнаружено даже небольших фрагментов этой последовательности. Этот ген также был представлен несколькимим аллелями, отличными от прототипа и друг от друга; соответственно различались и их продукты (рис. 29).
Последовательность, первые 574 п.н. которой на 94-96 % гомологичны таковой tseL, были выявлены только у трех штаммов, у остальных она вовсе не обнаруживалась. При этом ген, обозначенный нами как tseL-like, имел длину 2024 п.н., и его дистальный участок существенно отличался от прототипа (1926 п.н.). Тем не менее, продукты этих генов были идентифицированы программмой Blastp как белки семейства липаз и содержали те же домены, что и у прототипа. В NCBI найдены их 99 %-ные гомологи (WP_069212757, WP_002043856, EMQ52757). Выявленные нами различия в структуре генов tseL, vasX и дистального участка vgrG3 неудивительны, поскольку их вариабельность характерна для холерных вибрионов не только неО1/неО139, но и О1 серогруппы [Unterweger D. et al., 2014].
T6SS может участвовать в реализации как патогенетического, так и персистентного потенциала. Мишенями ее эффекторов служат не только клетки кишечника и макрофаги человека, но также грамотрицательные бактерии, убивая которых, вибрионы используют их содержимое в качестве дополнительных источников питания. Из данных литературы известно, что для проявления антагонизма по отношению к модельному организму Dictyosteli-um discoideum (служащих «имитацией» макрофагов) необходимы VasX и VgrG1 [Miyata S.T. et al., 2011], а по отношению к бактериям – VasX, VgrG3 и TseL [Unterweger D. et al., 2014], тогда как ACD-VgrG1 не оказывает никакого влияния [MacIntyre D.L. et al., 2010] . Мы провели соответствующие испытания исследуемых штаммов на обеих моделях (см. Материалы и методы, разделы 2.8 и 2.9). Результаты представлены в таблице 16 и на рис. 30 и 31.
Из таблицы можно видеть, что штаммы, содержащие acd-vgrG1 и vasX, обладали выраженным либо умеренным DictioR фенотипом, тогда как у содержащих только vasX он был выражен значительно слабее. Это согласуется с данными Miyata S.T. et al. [2011], показавшим, что VgrG1 оказывает большее влияние на антагонизм по отношению к D. discoideum, чем VasX, однако определенная устойчивость к малым концентрациям амебы все же сохраняется, а штаммы, лишенные обоих генов, становятся чувствительными. В этом процессе участвует еще и VasK, однако у наших штаммов повреждений кодирующего его гена выявлено не было.
Антагонистическая активность в отношении E.coli M-17 у разных штаммов проявлялась неодинаково. Наиболее выраженной она была у штаммов, содержащих все три гена – tseL, vasX и vgrG-3, и практически отсутствовала у штамма 19063, лишенного этих детерминант. Это не противоречит данным Unterweger D. et al., [2014], согласно которым мутанты, содержащие даже один из вышеперечисленных генов, все же убивали кишечную палочку, хотя и менее эффективно, чем исходный штамм V52. Кроме того, бактерицидная активность вибрионов зависит еще от целого ряда факторов, которые мы не учитывали в настоящем исследовании.
Полученные данные позволяют полагать, что далеко не все НАГ-вибрионы используют T6SS для проявления патогенетического потенциала. При этом большинство DityoS вибрионов содержат интактный кластер T3SS (см. табл. 15), и вполне вероятно, что использование обеих систем «нецелесообразно» с энергетической точки зрения. Из изученных T3SS-позитивных штаммов только 9760 активно экспрессировал T6SS, однако вопрос о его реальной способности к экспрессии T3SS остается открытым. Это же относится еще к двум лишенным acd-vgrG1 штаммам (9771, 19261), которые проявляли антагонизм по отношению к D. discoideum гораздо слабее. Что касается бактерицидной активности, то на данном этапе нами показана принципиальная возможность использования некоторыми НАГ-вибрионами T6SS против всего одного штамма кишечной палочки, причем в условиях in vitro, тогда как для определения спектра чувствительной кишечной микрофлоры необходимы дальнейшие исследования. Активную экспрессию этой системы секреции по двум показателям можно считать доказанной для штаммов, содержащих все четыре последовательности, приведенные в таблице 15.