Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 16
1.1. Колоректальный рак 16
1.2. Кишечная микрофлора и их вклад в патогенез онкологических заболеваний 19
1.3. Возможные механизмы участия кишечной флоры в развитии колоректального рака 26
1.3.1. Индукция воспалительных процессов микрофлорой кишечника 27
1.3.2. Бактериальные токсины и их роль в возникновении колоректального рака 30
1.4. Генетическая обусловленность факторов вирулентности бактерий 35
1.5. Факторы микробного происхождения в предотвращение развития опухолей 37
1.5.1. Экзотоксины 37
1.5.2. Рибонуклеазы 38
1.5.3. Колицины 40
1.6. Заключение 45
Экспериментальная часть 46
Глава 2. Материалы и методы 46
2.1. Используемые в экспериментальной работе материалы 46
2.1.1. Биоптаты слизистой толстой и прямой кишки 46
2.1.2. Клеточные культуры 46
2.1.3. Фермент 47 2.2. Методы исследований 47
2.2.1. Среды и условия культивирования бактерий 47
2.2.2. Идентификация бактерий 47
2.2.3. Определение антагонистической активности выделенных бактерий по отношению к E. coli K12 50
2.2.4. Определение устойчивости выделенных бактерий к антибиотикам
2.2.5. Определение гемолитической активности бактерий 51
2.2.6. Определение рибонуклеазной активности 51
2.2.7. Характеристика состава парамагнитных центров клеток E. coli К12 под действием РНКазами 53
2.2.8. Оценка цитотоксичности культуральной жидкости бактерий по отношению к опухолевым клеткам кишечника HuTu 56
2.2.9. Молекулярный анализ генетических детерминант, контролирующих адгезивную, гемолитическую и токсигенную активности у E. coli 56
2.2.10. Выделение и характеристика плазмидной ДНК E. coli 58
2.2.11. Статистическая обработка результатов 59
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение 60
3.1. Структура бактериального сообщества эпителия прямой кишки пациентов с колоректальным раком 60
3.2. Культивируемые бактерии, выделенные из образцов биоптатов пациентов с колоректальным раком
3.3. Антагонистическая активность выделенных бактерий по отношению к E.coli K12
3.4. Гемолитическая активность изолированных бактерий 71
3.5. In vitro чувствительность выделенных бактерий к антибиотикам 71
3.6. Рибонуклеазная активность бактерий 74
3.6.1. Рибонуклеазная активность выделенных бактерий на бесфосфорной среде 74
3.6.2. Рибонуклеазная активность культуральной жидкости E. сoli 77
3.7. Генерация активных форм кислорода клетками E. coli К12 под действием РНКазы - биназы. 78
3.8. Цитотоксичность стерильной культуральной жидкости выделенных E. coli после 16 ч культивирования 79
3.9. Молекулярный анализ генетических детерминант, контролирующих адгезивную, гемолитическую и токсигенную активности у E. coli 80
3.10. Выделение и характеристика плазмидной ДНК E. coli 85
Обсуждение 89
Заключение 95
Список литературы 97
- Возможные механизмы участия кишечной флоры в развитии колоректального рака
- Биоптаты слизистой толстой и прямой кишки
- Характеристика состава парамагнитных центров клеток E. coli К12 под действием РНКазами
- Антагонистическая активность выделенных бактерий по отношению к E.coli K12
Возможные механизмы участия кишечной флоры в развитии колоректального рака
С самого рождения человека его желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) населен микроорганизмами, преимущественно бактериями, различающимися морфологически, физиологически и структурно. Последние данные свидетельствуют о том, что в кишечном тракте человека содержится около 1014 бактерий порядка 1000 различных видов, важных для обеспечения переваривания пищи, контроля кишечного эпителиального гомеостаза и здоровья человека, а также подавлении роста патогенных микроорганизмов. [Hooper et al., 2001, Arthur et al., 2011; Vollaard et. al., 1994; Theriot et. al., 2014]. Огромное разнообразие генетического потенциала, содержащегося в кишечной микрофлоре, обеспечивает значительный арсенал метаболических ферментов, которые помогают хозяину в пищеварении, получении энергии и синтезе витаминов. Микробы поставляют большую часть витамина К и водорастворимых витаминов, необходимых хозяину [Guzman et al., 2013]. Обширные исследования показали, что кишечная микрофлора необходима для нормального развития и созревания иммунной системы. Стерильные мыши-гнобиоты, лишённые полностью каких-либо микробов, имеют значительно неразвитость иммунной системы и слизистого барьера [Mazmanian et al., 2005; Tlaskalova-Hogenova et al., 2011]. Из-за медленной перистальтики кишечника и слабощелочного рН (8,5– 9,0) толстая кишка является основным местом микробной колонизации в организме человека. В толстой кишке заселяется преобладающая часть всех видов колонизирующих бактерий. 99,9% из них являются облигатными анаэробами [Hao et al., 2004], включая Bacteroides, Eubacterium, Bifidobacterium, Fusobacterium, Peptostreptococcus и Atopobium. Факультативных анаэробов примерно в 1000 раз меньше, в основном это представители Lactobacilli, Enterococci, Streptococci и Enterobacteriaceae. [Tlaskalova-Hogenova et al., 2004; Rastall et al.,2004; Mai, 2004]
В настоящее время получен большой набор метагеномных данных микрофлоры кишечника населения разных стран. Каталог превалирующих генов микроорганизмов кишечника представлен по данным метагеномного анализа фекальных образцов 124-х европейцев. Функция и структура кишечной микрофлоры были определены в большой группе населения США. Различия в составе микрофлоры были обнаружены между европейскими, североамериканскими, африканскими и индийскими группами населения. Данные по метагеномам других наций, включая Ирландское, Корейское и Китайское население, постоянно пополняются. В России метагеномные исследования человека только начинаются [Tyakht et al., 2013].
В работе Tyakht с соавт. [Tyakht et al., 2013 ] представлены результаты анализа кишечной микрофлоры фекальных образцов населения некоторых районов России. Хотя таксономический анализ показал, что распространенные бактериальные таксоны аналогичны тем, которые найдены в западноевропейской и североамериканской популяции, авторы обнаружили особые группы населения сельских районов Восточной России, у которых доминируют филы Firmicutes и Actinobacteria, и редко встречаются представители Bacteroides, что связано преобладанием растительных углеводов в пище. У жителей Татарстана преобладают бактерии филы
Firmicutes родов Roseburia, Coprococcus, Faecalibacterium и Ruminococcus (каждый составляет 15-25% относительной численности). Предполагают наличие оригинального подтипа микрофлоры у Российского населения, отличающегося от других стран [Tyakht et al., 2013]. Микрофлора кишечника человека представляет собой последний открытый «орган» человеческого тела. В зависимости от контекста и восприимчивости хозяина она может стать фактором риска заболеваний [Shanahan, 2012]. На протяжении последних нескольких лет в ряде научно-исследовательских работ кишечный микробиоценоз был определен как один из ключевых факторов развития КРР [Caitriona et al., 2013]. Канцерогенез в кишечнике вызван присутствием потенциально вредных или отсутствием защитных микробов; продукцией канцерогенов, генерируемых микробами; индукцией воспаления и модуляцией иммунной системы; индуцированной пролиферацией клеток и ингибированием различных сигнальных путей, ответственных за запуск апоптоза [Tlaskalova-Hogenova et al., 2014]. Наиболее встречаемые бактерии, вовлеченные в развитие КРР, это Streptococcus bovis, Helicobacter pylori, Escherichia coli, Bacteroides и Fusobacterium; часто встречаемыми вирусами являются Polyomavirus, вирус Эпштейна-Барра, Cytomegalovirus, вирус папилломы человека и др. [Yao et al., 2013]. Механизм, связанный с вкладом микроорганизмов в патогенез КРР, остается неясным; сообщения о конкретных патогенных микроорганизмах, которые напрямую вызывают заболевание, отсутствуют. Направление перспективных исследований сосредоточено на анализе метагенома, метатранскриптома и метапротеома микроорганизмов, связанных с КРР [Yao et al., 2013].
Биоптаты слизистой толстой и прямой кишки
Из отобранных биоптатов выделили тотальную ДНК с применением набора Quiamp DNA miniKit 50 (Qiagen - Германия) согласно инструкциям производителя. Общее количество ДНК в полученном растворе оценивали с использованием Qubit dsDNA BR assay kit and a Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA). Для амплификации фрагментов длины 500-bp бактериальных генов 16S рРНК с тотальной ДНК методом ПЦР в термоциклере The FastStart High Fidelity PCR System (Roche, Branford, CT) использовали пару праймеров: 16S рРНК-специфичные праймеры – 27F (5 49 GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3) и 533R (5TA CCG CGG CTG CTG
GCA C-3). Эти пары праймеров созданы с добавлением слитого линкера и последовательности 10 нуклеотидов, так называемым штрих-кодом в 5 -конце прямого праймера и последовательности слитого линкера на 5 конце обратногопраймера. (http://oklbb.ezbiocloud.net/oklbb_file/1001/1/4/1001_Technical_Note_454_ampli con_primer_design_2.pdf). Для каждого образца проводили ПЦР в трёх независимых повторностях и объединяли продукты для дальнейшего исследования. Полученные ПЦР-продукты очищали с Agencourt AMPure XP system (Beckman Coulter, Brea, CA), их качество было проверено с помощью DNA kit и Agilent 2100 Bioanalyzer системы (Santa Clara, Калифорния). Количественное измерение и подготовку ампликонов образцов проводили в соответствии с Руководством по GS Junior Amplicon Library Preparation Method Manual (Roche). Бактериальные ПЦР-продукты объединяли отдельно и затем подвергали эмульсионной ПЦР с использованием набора Lib-L emPCR Kit (Roche). (http://454.com/downloads/my454/documentation/gs junior/method-manuals/GSJunior_AmpliconLibraryPrep-RevJune2010.pdf) 454-пиросеквенирование проводили на пластинах GS Junior picotiter plate в соответствии с рекомендациями производителя. Анализ полученых данных и сортировки мультиплекс-идентификаторов проводили с помощью программного обеспечения GS Junior software. Бактериальные последовательности были дополнительно обработаны и проанализированы с помощью программного пакета QIIME 1.8.0 software package (http://qiime.org/) в соответствии с протоколами QIIME. Для сравнения бета разнообразия микробных сообществ в образцах использовали взвешенный (количественный) и невзвешенный (качественный) UniFrac с координационным анализом (PCoA) [Lozupone, et al., 2005, 2011; Krzanowski, 2000], реализуемым в QIIME.
Под термином «бета-разнообразие» понимается измерение уровня различий в видовом разнообразии между различными сообществами разных образцов. Чем выше бета разнообразие, тем больше сообщества различаются.
Филогенетический метод UniFrac, который измеряет расстояние между различными сообществами на основе содержаемых в них клонов, использован для одновременного сравнения многих образцов, поскольку он удовлетворяет техническим требованиям к дистанционной метрике и используется в соответствии со стандартной многомерной статистикой PCoA.
Исследуемые культуры E. coli засевали методом газона на питательную среду в чашке Петри. Посевы инкубировали при 37С в течение суток. Затем переносили исследуемые культуры в виде вырезанного участка с агаром на новые чашки Петри, где заранее газоном была засеяна 6-часовая бульонная культура E.coli K12. Результат учитывали через 24 ч инкубации при 37С по зонам подавления роста штамма E.coli K12 вокруг исследуеммых культур.
Тест на чувствительность к антибиотикам проводили методом диффузии препарата с дисков. Стандартизированные инокуляты бактерии (1– 2x108 КОЕ/мл) высевали на чашки с агаризованной средой Мюллера-Хинтона [Bauer et al., 1966]. 8 коммерческих пропитанных антибиотиком бумажных фильтров в форме диска помещали на поверхность агара. Чашки инкубировали 18-24 ч при 37C. Измеряли диаметры зон ингибирования вокруг каждого диска и сравнивали со стандартами, описанными в инструкции производителя (Oxoid Ltd, UK) (таблица 6). Диаметр зон ингибирования соответствует чувствительности изолятов и степени диффузии антибиотика в агаризованную среду.
Характеристика состава парамагнитных центров клеток E. coli К12 под действием РНКазами
Отличительной особенностью прибора является возможность проводить эксперименты в широком диапазоне температур (4.2-800К), благодаря имеющимся температурным приставкам. Так как некоторые типы парамагнитных центров доступны для наблюдения только в низкотемпературном диапазоне, исследования проводились преимущественно при температурах 4.2-77К. Заморозка образцов происходила в силу технических особенностей эксперимента (влага в образцах понижает добротность СВЧ резонатора и нарушает правильный режим работы спектрометра) и для увеличения интенсивности (I) сигналов (I 1/T).
Для исследования замороженных образцов суспензии производились серии экспериментов при Т = 77К, в этом случае они в процессе опыта помещались непосредственно в жидкий азот. Для этого использовался кварцевый сосуд Дьюара, носик сосуда вместе с погруженным внутрь образцом вставлялся в резонатор спектрометра.
Сосуд Дьюара герметично закрывался специально подготовленной «пробкой» для исключения растворения в жидком азоте кислорода, дающего широкую линию поглощения ЭПР (6000 Э), что проявляется в виде наклона базовой линии спектров. После этого сосуд Дьюара с образцом помещался в резонатор спектрометра для проведения измерений.
При определении уровня активных форм кислорода (АФК) использовали спиновый зонд – циклический гидроксиламин N-(1-гидрокси-2,2,6,6-тетраметилпипередин-4-ил-)-2-метилпропанамид гидрохлорид (TMT-H). Для приготовления базового раствора зонда к охлаждённому раствору 0.9% NaCl добавляли 10мМ TMT-H и 3 мM десфероксамина. Раствор хранился при 0С и был использован в течение одного эксперимента.
Десфероксамин (сидерофор, связывающий железо) необходим для ослабления окисления TMT-H, катализируемого ионами переходных металлов (содержащихся в растворе NaCl в следовых концентрациях). Финальная концентрация после разбавления базового раствора составляла 1 мМ. В каждом эпсперименте проводилось контрольное измерение рабочего раствора (без добавления образца), с целью выявления возможного аутоокисления зона.
Клетки аденокарциномы кишечника человека HuTu (США) выращивали как монослойную культуру при 37C. По истечении 24 ч инкубирования опухолевые клетки HuTu высевали в 12-луночные планшеты (GBO, Германия) и добавляли 300 мкл стерильной культуральной жидкости (КЖ) (полученной фильтрованием через бактериальный фильтр) после 16ч роста бактерий. В качестве негативного контроля использовали стерильную среду ЛБ, в качестве позитивного - КЖ Bacillus pumilus, продуцента биназы, обладающей цитотоксичностью. После 48 ч роста обработанные клетки из каждой лунки собирали для дальнейшего анализа на апоптоз.
Апоптотические изменения клеток фиксировали с помощью проточного цитофлуориметра FACSCanto II (BD, США) с использованием красителя мероцианина-540, как это описано в [Laakko et al., 2002]. Обработку результатов проводили с помощью программы FACSDiva Software (BD).
Молекулярный анализ генетических детерминант, контролирующих адгезивную, гемолитическую и токсигенную активности у E. coli Геномную ДНК из культур микроорганизмов выделяли с применением набора «ДНК-сорб Б», (ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ). Образцы хранили при -20С. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на амплификаторе MJ Mini Gradient Thermal Cycler (Bio-Rad, США). Детекцию результатов ПЦР-анализа осуществляли методом горизонтального электрофореза в 2,5% агарозном геле в буфере ТBE (рН 8,0), содержащем этидий бромид с последующей визуализацией результатов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (=310 нм). Размеры фрагментов ДНК оценивали в сравнении со стандартными ДНК маркерами.
В работе использованы реактивы для молекулярно-биологических исследований производства ООО «ДНК-синтез» (Россия), НПО «СибЭнзим» (Россия) и Applied Biosystems (США).
Бактерии в 15мл жидкой среды ЛБ инкубировали 16 часов при 37oC и принудительной аэрации при 200rpm. Для выделения плазмид использовали набор Gen JET Plasmid miniprep Kit кат. №: К0503 (Fermentas) согласно инструкции производителя. Проводили электрофоретический анализ полученных растворов плазмид в 1% агарозном геле в буфере ТБЭ (рН 8,0), содержащем этидий бромид с последующей визуализацией результатов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (=310 нм). Размеры плазмидной ДНК оценивали в сравнении со стандартными ДНК маркерами. Также проводили молекулярный анализ плазмид на генетические детерминанты, контролирующие адгезивную, гемолитическую и токсигенную активности (см. пункт 2.2.9). 2.2.11. Статистическая обработка результатов
Статистический анализ проводили с использованием стандартных методов математической статистики в программе Microsoft Excel 2007. Эксперименты проводили в трехкратной повторности. Критерий вероятности Р 0.05 принимали достаточным для достоверной разницы групп данных.
Антагонистическая активность выделенных бактерий по отношению к E.coli K12 71
В настоящей работе мы провели сравнительный анализ микробных сообществ, ассоциированных с онкотрансформированным и прилежащим неповрежденным эпителием прямой кишки человека при КРР. У слизистой оболочки прямой кишки развиты крипты. После предоперационного промывания кишечника в этих криптах еще остаются бактерии. Эти связанные с эпителием микробные сообщества являются примером наиболее плотно ассоциированных с тканями, но не внутриклеточно развивающимися естественными микробными сообществами. Микробы, ассоциированные с эпителием, непосредственно взаимодействуют с организмом хозяина, а микробы просвета кишечника, анализ которых производят, главным образом, в фекалиях, воздействуют на организм хозяина через метаболический обмен с ним. Известно, что состав сообществ микроорганизмов в просвете кишечника сильно варьирует в зависимости от особенностей питания, диеты, места проживания индивидуума и пр. [Brown et al., 2012; Scott et al., 2013]. Практический опыт свидетельствует о том, что трудности с трактовкой результатов бактериологического исследования кала возникают преимущественно в связи с широким диапазоном варьирования их даже у практически здоровых индивидуумов, а также быстрой изменчивостью показателей у одного и того же больного при повторных исследованиях без какой-либо закономерности [Ткач с соавтор., 2014]. Кроме того, видовое разнообразие пристеночной микрофлоры значительно варьирует на протяжении длины кишечника и существенно отличается от состава микрофлоры фекалий [Ткач с соавтор., 2014; Arumugam, 2011]. Анализ биоптатов позволяет отражать содержание пристеночной, криптовой микрофлоры кишечника, которые на наш взгляд более стабильны у индивидуального организма по сравнению с внутрипросветной (полостной) микрофлорой. Метагеномные исследования состава микрофлоры кишечника позволили описать полный состав микробного сообщества кишечника, выявив доминирование определенных групп бактерий. В структуре микробных сообществ эпителия кишечника пациентов с КРР нами установлено, что у больных КРР преобладают филы Firmicutes и Bacteroidetes, а содержание филы Actinobacteria низкое (рис. 3). Выявлены различия между отдельными пациентами; различия структур сообществ, плотно связанных с малигнезированным и прилежащим неповрежденным эпителием, исключительно количественные (рис. 4).
В микробном сообществе, выделенном с малигнезированного эпителия, повышено содержание фил Proteobacteria и Fusobacteria. Особенно повышен уровень представителей родов Leptotrichia sp. (на 11,1%), Fusobacterium sp. (на 3,3 %), Gemella sp. (на 4,9%). Понижено содержание фил Firmicutes и Bacteroidetes. Максимально понижено содержание Bacteroides sp.(на 19,1%), Ruminococcaceae (на 8,1%), Sutterella sp.(на 6,4%) по сравнению с этими бактериями, выделенными с нормальной эпителиальной ткани (табл. 9). Существует много доказательств, подтверждающих, что род Leptotrichia представляет собой группу бактерий, приобретающих новые патогенные свойства и связанных с широким спектром инфекций у человека. У пациентов, от которых выделяется этот род бактерий, часто ослаблен иммунитет [Eribe et al., 2008]. По нашим данным, наблюдается сочетанное повышение Leptotrichia sp. и Fusobacterium sр., что согласуется с результатами работы Ren L Warren с соавторами [Warren et al., 2013].
Harold и его коллеги [Harold et al., 2012] предложили модель «водитель – пассажир» для колоректального рака, то есть КРР может быть инициирован бактериями «водителями», которые в конечном счете увлекают за собой в определенные ниши бактерии «пассажиры», способствуя развитию рака, либо затормаживая процесс туморогенеза. Бактериальные «водители» и «пассажиры» имеют различные временные роли в патогенезе [Harold et al., 2012]. Количественные различия структур сообществ могут быть объяснены с привлечением этой гипотезы. В нашей работе выявлен ряд патогенных бактерий, а именно энтеротоксигенные представлители вида B. fragilis, родов Fusobacterium, Pseudomonas, Klebsiella, и пр. Эти патогены отчасти могут быть представителями вышеупомянутых «водителей», конкурируя с коменсальными бактериями и влияя на прогрессию КРР. Кроме того, считают, что у здоровых людей практически отсутствуют патогенные бактерии, напр. представители родов Fusobacterium, Leptotrichia, Klebsiella pneumoniae, и др. в кишечнике[Tyakht et al., 2013; Старостина и др., 2012]. Согласно нашим результатам (табл. 9; табл. 13), именно эти бактерии выявлены у пациентов с КРР, причем наблюдается особое обогащение родом Fusobacterium в тканях опухоли.
Бактерии, являющиеся непосредственно проонкогенными, способствуют ремоделированию иммунного ответа и бактериального сообщества слизистой оболочки толстой кишки, что впоследствии продвигает онкогенез КРР. В настоящей работе выявлены штаммы E. coli, несущие островок поликетидных синтаз pks-генов, кодирующих колибактин, и cnf1-генов, кодирующих цитотоксический некротизирующий фактор 1 (табл. 16). В отличие от комменсальных или непатогенных штаммов E. coli, которые эффективно и быстро разрушаются макрофагами через 24 часа после заражения, E. coli, тесно связанные с опухолью толстой кишки, были способны противостоять действию макрофагов благодаря способности к внутриклеточной репликации и сохранению внутри клетки-хозяина в течение 72 ч после заражения [Raisch J., 2015]. При этом показано, что такие штаммы могут вызвать однонитевые разрывы ДНК [Nougayrde et al.,2006]. E. coli через цитотоксический некротизирующий фактор 1 может по различным путям приводит к пролиферации клеток эпителия и ангиогенезу, который является важной составляющей опухолевого роста [Alistair et al., 2002].