Характеристика препаратов капсульного антигена чумного микроба, выделенных из генетически различающихся штаммов-продуцентов Коссе, Людмила Владимировна

Введение к работе

Актуальность проблемы:

Опасность чумной инфекции в' современном мире определяется наличием обширных природных очагов чумы в различных регионах мира , в том числе и на. территории России. Необходимость создания новых' и усовершенствования существующих диагностических и вакцинных препаратов объясняет интерес к изучению видоспецифических антигенов чумного микроба с протективными свойствами .

Капсульний антиген чумного микроба является главным иммуногеном при чуме (Butler Т, 1983, Chen Т.Н. et al,1972).Однако практически не ивучена возможность использования в качестве молекулярных вакцин препаратов капсульного антигена из нетипичных штаммов- продуцентов, которые полученны генноинженернымм.методами. Такой подход к изучению капсульного антигена возбудителя чумы является перспективным, поскольку расширяет набор модельных штаммов с fra-генами для изучения особенностей синтеза и секреции F1 и определения участия генетических элементов чумного микроба в формировании различных структурных и функциональных свойств капсульного антигена.

Считается, что синтез капсульного антигена детерминируется 65 МД плазмидой pYT Y.pestis (Проце-нко 0. А. .и др., 1981; Заренков М. И. и др. ,1984). Описаны штаммы чумного микроба, дефицитные по этой плаэмиде. Отсутствие капсульного антигена у pYT- штаммов определялось в серологических реакциях с -антителами к 'F1.B' литературе отсутствуют данные о попытках выделения из pYT-штаммов препаратов,методически аналогично F1, и изучении их свойств.

По общепринятому мнению, капсульний антиген чумного микроба является строго видоспецифичным. Тем не менее, в литературе имеются данные - об обнаружении F1 у некоторых других микроорганизмов ( Апарин Т.Ей др. ,1989) и антител к нему в сыворотках животных, не контактировавших с чумой ( Басова ЕНи др. ,1982). В одних случаях это связывают с неточной идентификацией чумного микроба, в других- с . возможностью гипердиагностики чумы. Однако до сих пор причины такой возможности не объяснены. 3

Целью работы является определение перспектив использования
генно-инженерных штаммов с fга- генами плаэмиды pYT Y. pest is,
препаратов капсульного антигена чумного микроба, выделенных ие
них, и монорецепторных сывороток к F1 в практике и научных иссле
дованиях. ..'.-'

Ив поставленной цели вытекают следующие задачиг

3. Определить уровень продукции капсульного антигена чумного микроба у экспериментальных штаммов-продуцентов с fга-генами и изучить его фиэико-₁ химические, иммун'охимические и иммуногенные свойства. * '

4. Провести сравнительный анализ свойств капсульного антигена чумного микроба, полученного из Y. pestis EV 76, и препаратов,выделенных ив бескапсульных штаммов чумы методами аналогичными получению F1. '.''

3. Выяснить вопросы специфичности детерминант капсульного антигена Y. pestis, используя моцоклональные антитела и поливалентные сыворотки к F1 и гетерологичные. сыворотки к антигенным комплексам, полученным аналогично F1 из энтеробактерий.

4. Изучить влияние методов инактивации бактериальной массы,и способов выделения F1 на свойства этого антигена.

Научная новизна."

Впервые нами были получены - штаммы К. pneumoniae 1017 KL- и С. freundii 19/3808 КМ-1 -продуценты капсульного антигена чумного микроба. Пре'параты F1 из трансконъюгантов., характеризовались повышенной серологической активностью и протективностью.

из штаммов У. pest js,' не оодершцнх pYT/Fra+плазмиды, и
природных штаммов .некоторых видов энтеробактерий выделены
препараты с. серологической специфичностью F1 и сходными с
капсульным антигеном Y. pe3tis >': протективными

свойствами. Продемонстрировано участие хромосомы чумного микроба в синтеве вещества а диагностической детерминантой капсульного антигена и роль плаэмиды pYT в продукции F1. '

Показано наличие в препарате капсульного антигена чумного микроба , по крайней мере, двух зпитопов. Один из них являлся '4 конфэрмациеяно-заьиеимым и определялся лишь y.Fl из бактерий чу-

мы с полным набором плаэмид. Вторая антигенная детерминанта сохранялась в условиях диссоциации препарата F1 и не являлась специфической для вида Y. pest is. '

Моноклональные антитела к F1, как экспериментальные, так и входящие в состав коммерческих диагностикумов, реагируют с общей для некоторых представителей, сем.Enterobacteriaceae антигенной детерминантой. Показано, что их использование имеет ограничения в диагностике чумы. '..''.

Определено влияние антигенных комплексов из бактерий К. pneumoniae на антителообразование 'к некоторым антигенам чумного микроба. Впервые изучена возможность использования препаратов, выделенных из К. pneumoniae, как потенциальных иммуностимуляторов при чумной инфекции.

Практическая значимость: Штаммы трансконъюгантов К. pneumoniae- 1017-KL и С. freundii 19/3808 КМ-і могут служить моделями для изучения синтеза , секреции F1 и источниками получения F1 с повышенной иммуногенностью в безопасных условиях.' Эти штаммы депонированы в музее живых культур института "микроб". Подана заявка на патентование штамма С. freundii 19/3808 КМ-1.

Для дальнейших исследований предложены препараты антигенов из природного штамма' К. pneumoniae, так .как показаны их адъювантные свойства в отношении некоторых антигенов чумного микроба и тенденция к увеличению эффективности действия вакцины Y. pestis EV 76. ..:...,"-.'. у .

Оформлено рационализаторское предложение по способу дополнительной очистки препарата F1 методом препаративного изоэлектрофо-кусирования для увеличения степени его гомогенности.

На основе полученных данных о наличии обшей антигенной
детерминанты у капсульного антигена чумного микроба и у
антигенных препаратов других бактерий поставлена проблема
разработки методических рекомендаций по возможности использования
диагностикумов с высокой чувствительностью к F1 в случаях
исследования дезинтегрированных клеток микроорганизмов и органов
животных. ' . . ,6

Положения, выносимые на защиту: ' 1. Продукция капсульного антигена чумного микроба на поверхность клетки детерминируется плазмидой pYT. Хромосомные гены чумного микроба ответственны ва синтез вещества с серологической специфичностью капсульного антигра.

2. Б составе препаратов капсульного антигена чумнэго микроба обнаружены две антигенные детерминанты, которые отличаются структурной организацией и видовой специфичностью. Диагностическая антигенная детерминанта капсульного антигена является общей для не-

которых представителей энтеробактерий и реагирует с моноклональ-ными антителами к F1.

5. Антигенный комплекс К. pneumoniae, полученный ивоэлектическим осаждением в pi 4,2, обладает адъювантным действием при совместном введении с некоторыми антигенами Y. pestis. ;'

6. Препарат капсульного антигена чумного микроба , -полученный по-общепринятым методикам, не является гомогенным, методы инактивации бактериальной массы и.способы выделения препаратов влияют на иммунологические свойства препаратов F1 из чумного микроба.

Апробация работы: -Основные результаты работы доложены на конференции, молодых ученых и специалистов " Эпидемиология, микробиология и иммунология бактериальных и вирусных инфекций", (-г. Ростов-на-Дону,-" 1989) ,на научно- практической конференции молодых ученых " Механизмы интеграции биологических систем. Проблема адаптации ",( г. Ставрополь,1989) на ежегодных конференциях молодых ученых и специалистов Ростовского противочумного института.

Структура диссертации:

Материал,И8ложен-на 132 страницах, разделен на 7 глав,' иллюстрирован 12 таблицами и 20 рисунками, список использованной литературы содержит 218 нименований.

В работе было использорано 7'штаммов Y. pestis, различеадихся по плаэмидному составу и фенотипу ': EV 76 (pYT+, Fra-»), TS б" (pYT+.Fr- .).231 (pYT+,Fra+),556 (pYP.Fra-) .TRU(pYT-.Fra-) ,1230-a

(pYT+, Fra+-)« Б штаммов трансконъюгантов ,получивших плазмиду pYT в составе коинтегративной'конъюгативной плаэмиды pLS 759 через промежуточный донорный штамм Y.' pestis TS (pLS7E9) -Е.coli С-і,Е.со1і X 926-1,К. pneumoniae 1017 KL,C. freundii 19/3808 КМ-1,и исходные реципиентнне штаммы Е. coli С, Е.сбіі X 925,' К. pneumoniae 1017, С. freundii 19/3808.

Выращивание бактерий осуществляли при температурах 28* и 37 О и комбинированно на плотных и жидких средах'ЛХАТ, LB в течение различного времени ( от 1 до 3 суток).Для инактивации использовали БХ фенол и ацетон. '..'

Препараты антигенов из бактерий' всех указанных штаммов выделяли по известным методикам получения F1: методу Baker (1G62) или иэоэлектрнческим осаждением. Препарат F1 из вакцинного штамма дополнительно очищали с помощью гель-фильтрации и препаративного иэоэлектрофокусирования. .'

Ко всем препаратам ( кроме выделенных И8 трансконъюгантов Е. ооіі), были получены экспериментальные кроличьи сыворотки. Для анализа экспрессии Fi у траксконъюгантоз Е. noli иммунизацию животных проводили клетками штаммов С-І. и X 925-1. Общее количество опытных кроликов' составляло 52.Схемы иммунизации варьировали по длительности циклов и использования адъювантоз в различных сочетаниях, однако', количество циклов было равно 3, две первые инъекции были проведены на полном и неполном адьюзанте Фрейнда соответственно подкожно,последующие внутривенно.

При исследовании адъювантного эффекта антигенного комплекса из К. pneumoniae! КРУ Для некоторых антигенов, 100 ют этого препарата смешивали со 100 мкг препаратов F1, *'мышного"токсина и мембранных белков псевдотуберкулеэного микроба. Контролем-служили сыворотки кроликов, полученные от животных, иммунизированных этими не препаратами без смешивания с препаратом КР. Адъюванткый эффект препарата КР сравнивали с действием . полного адъюзанта фрейнда .

Кроме полученных нами экспериментальных сывороток, в работе были использованы 36 коммерческих и экспериментальных. сывороток( лошадей, кроликов) j производства Иркутского и Саратовского-ПЧК. ?

Моноклоналыше антитела к F1 были любезно, предоставлены сотрудником лаборатории МКА Ростовского противочумного института ' Колгановой Е. R

Химический состав препаратов определяли используя известные ' методики: наличие белков по методу Lowry (1951) в модификации Dulley (1976), углеводов- по методу Dibous (1956). \Лш,идные ком-' поненты определяли качественно * по окрашиванию Суданом черным, а молекулярную-массу препаратов- по калибровочной кривой после электрофореза по Laeranl і (1970) о маркерными "белками *HpMU"Serva". Для . оценки злектрофоретической подвижности нативного препарата антигена электрофорез проводили по Davis (1968).

Аналитическое изоэлектрофокусирование осуществляли в 5% полиачриламидном геле с 2% амфолинов диапазона 1/3 рН 3,6-10 и 2/3 рН 3,5-6 согласно рекомендациям Остермана (1983).

Реакции гемагглютинации ( РНГА, Рнат,- Рнаг, РТПГА) проводили микрометодом по общепринятым методикам с"антигенным и антительным полм- и моноклональным диагностикумом производства Среднеазиатского ІЇЧИ .

Реакции диффузионной преципитации ставили . по методу. 0uchterlony(1978) в \%- агаре или 1,6 % агарозе на фосфатном буфере, рН 7,3. В работе использовали обычный и модифицированный вариант иммунодиффузии. Суть модификации заключалась в. добавлении к агароьному гелю 0,1% дсдецилоудьфата натрия ( SDS). который присутствовал в сыворотках в. той же концентрации и в препарате антигенов в количестве 2%.

Классы иммуноглобулинов в сыворотках животных определили с использованием метода Suzuki (1974) при их обработке 2Ь-меркаптоэтанолом и постановке реакции иммунодиффизии с препаратами F1 в обычных и диссоциирующих условиях, а-также в иммуноблот-тинге с конъюгатами' к определенному классу иммуноглобулинов мыши ( А, М,,G) фирмы "Amursham" в дот-варианте. Дот- блоттинг и вестерн-блогтинг проводили по методу Towbin(19V9). '

Фігоцитарнье реакции макроорганиема на введение препаратов антигенов изучали в культуре перитонеальных макрофагов морских 6" свинок in vitro по методике, описанной Куклевой с соавт(1988).

Протективность препаратов антигенов исследовали на белых мышах и морских свинках. Определяли % выживших животных и средни» продолжительность жизни при введении -200 DCL вирулентного штамма чумного микроба через 21 день после предварительной иммунизации препаратами антигенов.

Для выяснения иммуностимулирующего влияния препарата КР из К. pneumoniae на. действие вакцинного штамма Y. pestis «EV 76 использовали смесь, состоящую из препарата КР или водного экстракта клеток вакцинного штамма, в различных концентрациях, Заражающая доза вирулентного штамма Y. pestis 231 была равна 200 DCL. Рассчет иммунизирующего эффекта и статистическую обработку результатов вели по формулам, предложенным Ашмариным (1962).

При изучении видовой специфичности капсульного антигена чумного микроба оценили динамику накопления антител к. F1 у кроликов после .их иммунизации препаратами из природных штаммов К. pneumoniae и С. freundii. Кроме того, белых мышей инфицировали бактериями этих штаммоз и бескапсульногоштамма Y. pestis 558 Otten и вакцинного штамма Y, pestis EY 75. Через 21 день после заражения у усыпленных эфиром животных забирали кровь, лимфоузлы, селезенку и печень. Органы гомогенизировали. растиранием а ' ступке к экстрагировали физиологическим раствором. В сыворотке определяли наличие антител к F1, в суспензии органов -антиген F1 с помощью гемагглютинационных тестов с поли - и моноклональныи диагностккумами производства Среднеазиатского ПЧИ.