Характеристика патогенности Enterococcus faecalis в условиях дисбаланса редокс-системы у женщин с урогенитальным хламидиозом Красная Юлия Владимировна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 13

1.1. Значение энтерококков в патологии человека 13

1.2. Современное состояние проблемы урогенитального хламидиоза 19

1.3. Значение редокс-системы в развитии патологического процесса 25

1.4. Со стояние иммунитета при хламидийной инфекции 29

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 36

2.1. Характеристика больных 36

2.2. Методы исследования 38

2.3. Методы статистического анализа данных 54

ГЛАВА 3. Клинико-лабораторная характеристика пациенток с урогенитальным хламидиозом 55

3.1. Клинические проявления урогенитального хламидиоза 55

3.2. Данные лабораторных и инструментальных исследований 60

ГЛАВА 4. Характеристика патогенности enterococcus faecalis, выделенных из урогенитального тракта женщин при УГХ 64

4.1. Особенности микробиоценоза репродуктивного тракта здоровых женщин и пациенток с урогенитальным хламидиозом

4.1.1. Микрофлора здоровых женщин 64

4.1.2. Микробиоценоз урогенитального тракта у пациенток с урогенитальным хламидиозом

4.2. Молекулярно-генетическое выявление трудно- и некультивируемых условно-патогенных микроорганизмов 70

4.3. Биологические свойства клинических изолятов энтерококков 77

4.3.1. Культурально-биохимические свойства Е. faecalis 77

4.3.2. Молекулярно-генетические основы патогенно сти клинических изолятов Е. faecalis 79

ГЛАВА 5. Состояние редокс-системы при урогени тальном хламидиозе 89

5.1. Состояние не ферментативной подсистемы антиокси-дантной защиты 89

5.2. Оценка системы перекисного окисления липидов эритроцитов и плазмы крови 91

5.3. Показатели антирадикальной защиты у женщин с урогенитальным хламидиозом 93

5.4. Изменение уровня регуляторных белков (R-белки), при хламидийной инфекции 98

ГЛАВА 6. Иммунный статус женщин с урогенитальным хламидиозом 101

6.1. Особенности клеточного иммунитета у обследованных женщин 101

6.1.1. Количественные показатели клеточного иммунитета 101

6.1.2. Изучение функциональной активности клеточного иммунитета 104

6.2. Характеристика показателей гуморального иммунитета у больных урогенитальным хламидиозом 106

6.3. Показатели функциональной активности нейтро-фильных гранулоци- 109 тов 6.4. Содержание циркулирующих иммунных комплексов. 113

6.5. Цитокиновый профиль 114

Заключение 122

Выводы 140

Практические рекомендации 142

Перечень принятых сокращений 143

Список литературы

• Современное состояние проблемы урогенитального хламидиоза
• Методы статистического анализа данных
• Данные лабораторных и инструментальных исследований
• Молекулярно-генетическое выявление трудно- и некультивируемых условно-патогенных микроорганизмов

Введение к работе

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

В последние годы проблема этиологической значимости условно-патогенных микроорганизмов, в том числе и энтерококков, в развитии инфекционных заболеваний становится все острее (Бондаренко В.М. «Острова» патогенности бактерий // Журнал микробиологии. 2004. №4.С.67-74.). Установлено, что представители рода Enterococcus занимают одну из лидирующих позиций в качестве причины нозокомиальных и оппортунистических инфекций. В 10-20% случаев энтерококки выделяют из гноя интраабдоминальных абсцессов, в 8-14% - случаях - при раневых нозокомиальных инфекциях (НКИ), в 30% случаев при постгемодиализной бактериемии и при инфекциях мочевыводящих путей (Валышева И.В. Генетическая характеристика вирулентного потенциала энтерококков кишечной микробиоты человека// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.2012. №4. С.44- 48.). Среди аэробных грамположительных микроорганизмов энтерококки занимают первое место при хирургических инфекциях (Asghar А.Н. Frequency and antibiotic susceptibility of gram-positive bacteria in Makkah hospitals// Ann.Saudi.Med. 2011. V.31. №5. Р.462-468.). В РФ энтерокковые инфекции приобрели характер серьезной медико-социальной проблемы. Масштабы этой патологии и огромный экономический ущерб еще не изучены и не осознаны в полном объеме (Вершинин А.Е. Генетическая идентификация как способ выявления патогенных и симбиотических штаммов энтерококков // Журнал микробиологии. 2008. №5. С.50-53.). Обнаружение у больного энтерококков часто ставит неразрешимые вопросы перед клиницистами в плане определения врачебной тактики (Бондаренко В.М., Суворов А.Н. Симбиоти-ческие энтерококки и проблемы энтерококковой оппортунистической инфекции // Журнал микробиологии. 2008. №3. С. 14-27.).

Известно, что тяжесть течения энтерококковой инфекции, как и всех других, вызванных условно-патогенными возбудителями, зависит, с одной стороны, от наличия факторов патогенности у микроорганизма, с другой стороны, от состояния иммунного статуса макроорганизма (Долгушин И.И. Роль нейтрофилов в формировании микробиоценоза слизистых оболочек // Вестник новых медицинских технологий. 2009. Т. XVI, №1. С.20-22.). Выявлены различия в степени выраженности патогенных свойств возбудителя в моно - и микстинфекциях (Бухарин ОВ. Роль доминантной микрофлоры в механизмах защиты вагинального биотопа женщин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2013. №6. С. 100-105.).

Согласно данным ВОЗ (2007) урогенитальный хламидиоз (УГХ) является одним из самых распространенных заболеваний, передаваемых половым путем. Ежегодно в мире регистрируется около 100 миллионов новых случаев хламидийной инфекции (Позняк А.Л, Сидорчук С.Н., Захаркин Ю.Ф. Терапия хронической трихомонадной инвазии у больных с микст-хламидийной мочеполовой инфекцией // Журнал инфектологии. 2009.Т. 1. №4. С.60-65.). Для возбудителя урогенитального хламидиоза доказана этиологическая роль в развитии острых и хронических заболеваний различной локализации с большим спектром осложнений. Однако роль С. trachomatis в инфекционной па-

тологии человека еще не оценена в должной мере (Перепанова Т.С. Неослож-ненная инфекция мочевых путей // Consilium-medicum. 2003.№5.С.1-4; Mayaud P. Approaches to the control of sexually transmitted infections in developing countries: old problems and modern challenges II Sexually Transmitted Infections. 2004. Vol.80. P. 174-182.).

Носительство хламидий приводит к развитию таких патологических состояний как аутоиммунные реакции, хромосомные аберрации, способствует возникновению смешанных хламидийно-вирусных и хламидийно-бактериальных инфекций (Серов В.Н., Баранов И.И. Лечение урогенитальных инфекций у женщин в современных условиях // РМЖ «Акушерство и гинекология». 2004. Т. 12, №8. С. 135-141.). Урогенитальный хламидиоз является одной из главных предотвратимых причин бесплодия, особенно среди женщин (Рудакова Е.Б., Семенченко СИ., Панова О.Ю. Инфекционная патология нижнего отдела половых путей женщины и бесплодие (обзор литературы) // Гинекология. 2004. Т.6. №3. С. 132-136; Haggerty C.L. Epidemiology, pathogenesis and treatment of pelvic inflammatory disease II Expert Review of Anti-Infective Therapy. 2006. N4. Vol.2. P.235-247.).

Установлено, что урогенитальный хламидиоз характеризуется высоким удельным весом микст-инфекций (Введенская Э.В., Абайтова Н.Е. Распространенность специфических и неспецифических воспалительных заболеваний урогенитального тракта // Тезисы научных работ I Российского конгресса дерматовенерологов. СПб., 2003. Т.1. С.99.). Так, по данным В.А. Лебедева и А.И. Давыдова (Лебедев В.А., Давыдов А.И. Урогенитальный хламидиоз // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2012. №1(2). С.25-31) хламидийная моноинфекция наблюдается только у 2-20% пациентов. Показано, что важным кофактором развития патологического процесса в урогени-тальном тракте женщин является микробиота данного биотопа, в связи с чем при диагностике урогенитальных инфекций следует обращать внимание на наличие и персистентность сопутствующих условно- патогенных бактерий (Шварцкова Т. А., Цыганко Е.В. Частота встречаемости Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum в Екатеринбурге II Генодиагностика инфекционных болезней: сборник тезисов V Всероссийской научно - практической конференции. М., 2004. Т.2. С. 18-20.; Гончарова Н.Н. Особенности фетоплацентарного комплекса при беременности, осложненной хроническим урогенитальным хламидиозом: автореф. дис. канд. мед. наук: 14.00.01 / Н.Н. Гончарова. Томск, 2006. 19 С; Мотавкина Н.С. Бушуева Е.Н. Биоценоз условно-патогенных бактерий и возбудителей урогенитальных инфекций передающихся половым путем, в генезе гуморальных иммуноде-фицитов // Тихоокеанский медицинский журнал. 2006. №3. С.40-42.). В то же время данный вопрос при урогенитальном хламидиозе остается открытым.

В последние годы все больше исследователей наряду с классическими общепринятыми механизмами развития воспаления признают роль свободнора-дикальных кислородных и липидных процессов редокс-системы («redox-oxidation-reduction system» - окислительно-восстановительная система) в патогенезе многих заболеваний. Нарушение редокс-баланса приводит к возникновению окислительного стресса, ключевым событием которого является гиперпродукция активных форм кислорода (Меньшикова Е.Б., Ланкин В.З.,

Зенков Н.К. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты/М.: «Слово», 2006. 556 С). Изменение равновесия между процессами перекисно-го окисления липидов и антиоксидантной активности приводит к необратимым повреждениям молекул липидов, белков, нуклеиновых кислот и, в конечном счете, к гибели клеток (Жаворонок Т.В., Носырева О.Л., Помогаева А.П. Механизмы антиперекисной защиты и система глутатиона при острой иерсиниозной инфекции // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2006. №2. С.28-32.; Padayatty S.J. Vitamin С as an Antioxidant: Evaluation of Its Role in Disease Prevention II Journal of the American College of Nutrition. 2003. Vol.22. P18-35.;Halliwell, B. Oxygen toxiciti, oxygen radicals, transition metals and disease II Biochemistry. 2004. Vol.215. P. 1-14.). При чрезмерной выраженности этого процесса возможно местное повреждение тканей и развитие системных эффектов (Жаворонок Т.В., Носырева О.Л., Помогаева А.П. Механизмы антиперекисной защиты и система глутатиона при острой иерсиниозной инфекции // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2006. №2. С.28-32.; Padayatty S.J. Vitamin С as an Antioxidant: Evaluation of Its Role in Disease Prevention II Journal of the American College of Nutrition. 2003. Vol.22. P. 18-35.; Halliwell B. Oxygen toxiciti, oxygen radicals, transition metals and disease II Biochemistry. 2004. Vol.215. P. 1-14.).

В литературе накоплено достаточно сведений о том, что образование свободных радикалов является одним из универсальных патогенетических механизмов при различных типах повреждения: воспалении, старении, канцерогенезе, химическом, лекарственном и радиоактивном повреждении тканей, атерогенезе, кислородной и озоновой токсичности (Журавлева Т.Д., Суплотов С.Н. Возрастные особенности свободнорадикального окисления липидов и антиоксидантной защиты в эритроцитах здоровых // Вопросы медицинской химии. 2003. №5. С. 17-18.; Воскресенский С.К., Жутаев И.А. Антиоксидантная система, онтогенез и старение// Вопросы медицинской химии. - 2004. -№1. - С. 14-27.; Klebanoff S.J. Myeloperoxidase: role in neutrophil - mediated toxicity II Molecular Biology and Infectious Diseases. 2006. Vol.24. P.283-289.). Однако роль-редокс-системы в патогенезе урогенитального хламидиоза в условиях изменения патогенного потенциала микробного консорциума урогенитального тракта до сих пор остается мало изученной.

Исследователями, изучающими микробные сообщества, не в полной мере изучено изменение видового спектра и патогенности сопутствующей микро-биоты урогенитального тракта у больных урогенитальным хламидиозом и роль редокс-системы в этиопатогенезе урогенитального хламидиоза в условиях изменения патогенного потенциала микробного консорциума урогенитального тракта. Не установлена степень деструкции клеточных мембран и уровень регуляторных белков (R- белков) при урогенитальном хламидиозе.

Цель исследования

Изучить патогенность клинических изолятов Enterococcus faecalis и состояние редокс-системы у женщин с урогенитальным хламидиозом.

Задачи исследования

1. Дать характеристику клинико-лабораторных проявлений урогени-тального хламидиоза у женщин.

2. Выявить особенности видового состава и колонизационной резистентности микробиоты репродуктивного тракта женщин, больных урогени-тальным хламидиозом.

3. Определить частоту встречаемости генетических детерминант па-тогенности у штаммов Enterococcus faecalis, выделенных из репродуктивного тракта женщин, больных урогенитальным хламидиозом.

4. Провести сравнительное изучение редокс-системы, а также связанных с ней степени деструкции клеточных мембран и состояния иммунитета в группах больных урогенитальным хламидиозом при наличии и отсутствии в микробном консорциуме репродуктивного тракта Enterococcus faecalis с повышенным патогенным потенциалом.

Методология и методы исследования

В основу диссертационного материала положен принцип изучения и анализа фактического материала. Для достижения поставленной цели диссертации и решения задач исследования в работе использовали следующий комплекс методов: клинический, инструментальный, лабораторный, аналитический и статистический. Методики исследования, состоящие из нескольких этапов с использованием соответствующих методов исследования, подробно изложены во второй главе диссертации.

Степень достоверности, апробация результатов и личное участие автора

Достаточный массив фактических данных, избранный дизайн и методы исследования, адекватные сформулированным в работе целям и задачам, корректный и разносторонний статистический анализ обеспечили достоверность полученных результатов, сформулированных выводов, положений и рекомендаций.

Диссертация выполнена в соответствии с планом научной работы ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет», регистрационный номер 01201178149 «Механизмы развития инфекций, передаваемых половым путем при участии симбионтной микрофлоры».

Основные положения работы доложены на 47-й межрегиональной научно-практической конференции «Артериальная гипертония: ретроспектива и современность. Проблемы выживаемости в 21 веке» (г. Ульяновск, 2012), на VIII международной научно-практической конференции «Дни науки - 2012» (Чешская Республика, г. Прага), на Российской конференции с международным участием «Высшее сестринское образование в системе Российского здравоохранения» (г. Ульяновск, 2012), 48-й межрегиональной научно-практической медицинской конференции медицинских работников (посвященная 70-летию образования Ульяновской области) «Наука и медицина XXI века: традиции, инновации, приоритеты» (Ульяновск, 2013), 49-й Межрегиональной научно-практической медицинской конференции «Медицина и современность. Теория, практика, перспективы» (Ульяновск, 2014).

Личный вклад автора состоит в непосредственном участии на всех этапах диссертационного исследования. Тема и план диссертации, ее основные идеи и содержание разработаны совместно с научными руководителями на основании целенаправленных исследований. Автор принимал непосредственное участие в клиническом обследовании больных и в лабораторных исследованиях. Лично проводил оценку клинического течения урогенитального хлами-диоза, а также результатов бактериологических и молекулярно-генетических исследований. Автором подробно исследованы активность редокс-системы, особенности микробиоценоза урогенитального тракта у больных УГХ, генетические детерминанты факторов патогенности клинических изолятов Е. faecalis. Автором самостоятельно сформирована база данных и проведено обобщение полученных результатов. Материал был обработан с помощью современных методов статистического анализа.

Положения, выносимые на защиту

5. У 61,5% пациенток урогенитальный хламидиоз, вызванный Chlamydia trachomatis, выявлен в виде моноинфекции, у 38,5% - в сочетании с возбудителями других инфекций, передающихся преимущественно половым путем. Воспалительные заболевания репродуктивного тракта женщин, вызванные С. trachomatis, в большинстве случаев (51,6% обследованных) протекают бессимптомно. Однако при объективном осмотре у большинства обследованных выявлены неспецифические клинические признаки воспалительного процесса - серозно-гнойные выделения (58,8%), гиперемия и отек слизистой оболочки наружного отверстия уретры (40,1%), отечность и гиперемия слизистой оболочки шейки матки 29,7%.

6. Урогенитальный хламидиоз у женщин сопровождается расширением видового спектра патогенных и условно-патогенных представителей микробного консорциума урогенитального тракта с доминированием условно - патогенного вида Enterococcus faecalis на фоне сокращения нормофлоры (Lactobacillus spp.) и повышением количественных показателей трудно- и не-культивируемых видов.

7. При урогенитальном хламидиозе происходит повышение уровня патогенности клинических изолятов Enterococcus faecalis, что проявляется достоверным увеличением числа особей с нуклеотидными последовательностями генов, детерминирующие экспрессию факторов патогенности: esp (адгезия, колонизация), cylmA (активация цитолизина) и asa (поверхностный бе-лок-адгезин).

8. При урогенитальном хламидиозе отмечается дисбаланс редокс-системы, проявляющийся повышением липопероксидации в тканях и повреждением клеточных мембран. Изменения в системе перекисное окисление липидов - антиоксидантная система сопровождается нарушением клеточного, гуморального, цитокинового звеньев иммунитета и системы фагоцитоза. Выявленные изменения способствуют реализации патогенного потенциала условно-патогенных представителей микробного консорциума урогенитального тракта, в частности Enterococcus faecalis и оказывают влияние на течение и исход заболевания.

Научная новизна работы

Впервые показано, что при урогенитальном хламидиозе происходит повышение уровня патогенности условно-патогенного представителя микрофлоры урогенитального тракта - Е. faecalis, что проявляется достоверным увеличением числа особей с нуклеотидными последовательностями генов esp (адгезия, колонизация), asa (поверхностный белок-адгезин) и cylmA (активация цитолизина, бактериоциногенность), детерминирующими экспрессию факторов патогенности. У пациенток с урогенитальным хламидиозом выявлены основные направления изменений микробного консорциума, проявляющиеся в расширении видового спектра и частоты встречаемости патогенных и условно-патогенных видов (с доминированием условно-патогенного микросимбионта Е. faecalis) на фоне сокращения нормофлоры урогенитального тракта.

Впервые установлено, что в эритроцитах и плазме крови больных урогенитальным хламидиозом происходит активация свободнорадикальных процессов, сопровождающаяся снижением содержания антиокислительных факторов, способствующих высвобождению токсинов и медиаторов воспаления. Полученные результаты свидетельствуют о патогенетической роли дизрегу-ляции редокс-системы в деструкции клеточных мембран у больных УГХ, что подтверждается выявленной сильной положительной достоверной корреляционной взаимосвязью между уровнем МДА и R-белков у обследованных больных, особенно при урогенитальном хламидиозе, характеризующимся повышением патогенности энтерококков (г=+0,82; р=0,031).

Получены новые данные об иммунологической перестройке у обследованных женщин при урогенитальном хламидиозе. Выявлен выраженный дисбаланс клеточного и гуморального звеньев иммунной системы, а также цитоки-нового профиля, что способствует реализации патогенного потенциала условно-патогенного компонента микробного консорциума урогенитального тракта, в частности Е. faecalis и хронизации воспалительного процесса.

Теоретическая и практическая значимость работы

В теоретическом плане результаты исследования показывают усиление патогенного потенциала Е. faecalis у больных УГХ. Выявленный дисбаланс редокс-системы у пациенток с урогенитальным хламидиозом при выявлении энтерококков с высоким патогенным потенциалом в урогенитальном тракте сопровождается активацией деструкции мембран клеток. При этом развивается дисбаланс клеточного и гуморального звеньев иммунной системы.

В практическом плане возможна оптимизация диагностики и повышения эффективности лечебных мероприятий при УГХ путем внедрения в работу лабораторий кожно-венерологических диспансеров бактериологического и молекулярно-генетического исследования материала из половых путей для обнаружения факторов патогенности с целью последующего назначения этиотропного лечения. Обнаруженный дисбаланс редокс-систем при УГХ позволяет использовать определение показателей перекисного окисления липи-дов и антиоксидантной защиты, а также R-белков для характеристики степени тяжести заболевания, прогноза течения и оценки эффективности проводимого лечения.

Внедрение результатов исследования в практику

Разработано и внедрено в практику комплексное клинико-лабораторное обследование больных УГХ, включающее изучение патогенного потенциала микрофлоры урогенитального тракта и активности редокс-системы для оценки тяжести и прогнозирования течения заболевания, а также эффективности лечения (Акт о внедрении от 12 сентября 2013 г, выдан ГУЗ «Областной клинический кожно-венерологический диспансер» г. Ульяновска).

Материалы работы используются в диагностической и лечебной работе ГУЗ «Областной клинический кожно-венерологический диспансер» г. Ульяновска (Акт о внедрении от 12 сентября 2013 г.) и внедрены в учебно-педагогический процесс преподавания дерматовенерологии и микробиологии студентов медицинского и педиатрического факультетов, а также клинических ординаторов и интернов факультета последипломного образования и научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» (Акт о внедрении от 01 октября 2013 г.).

Издана монография для врачей, интернов и ординаторов, студентов медицинских вузов «Роль редокс-системы в патогенезе урогенитального хлами-диоза» (г. Ульяновск: УлГУ, 2013). Изданы практические рекомендации для врачей, интернов и ординаторов, студентов медицинских вузов «Клинико-диагностическое значение редокс-системы при урогенитальном хламидиозе у женщин» (г. Ульяновск: УлГУ, 2013).

Публикации

Соискатель имеет 15 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 14 научных работ общим объемом 8,78 печатных листов, в том числе 5 публикаций (5 статей) в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций. Соискателем опубликованы 6 работ в материалах межрегиональных, всероссийских и международных конференций, 1 статья в международном журнале, 1 монография, изданы 1 практические рекомендации.

Структура и объем диссертации

Современное состояние проблемы урогенитального хламидиоза

Урогенитальная хламидийная инфекция является одной из главных предотвратимых причин бесплодия, особенно среди женщин. У 40% пациенток с нелеченым хламидиозом развиваются клинически выраженные воспалительные заболевания органов таза [ 160; 101 ;243;70]. Прямые и непрямые затраты в связи с этим, например, в США, составляют более 1 миллиарда долларов, причем 80% из этой суммы приходится на женскую часть населения [279].

Исследования, проведенные зарубежными и отечественными исследователями, показали, что С. trachomatis выявляется в шейке матки и мочеиспускательном канале у 5-20% женщин, обследованных в женских консультациях и в венерологических лечебных учреждениях [142;182;203;77;267]. Наиболее часто хламидийная инфекция регистрируется у женщин с частой сменой половых партнеров. По данным литературы частота хламидийных цервицитов у женщин, имеющих беспорядочные половые сношения, в 20-25 раз превышает число случаев цервицита той же этиологии среди женщин, имеющих одного полового партнера и избегающих случайных половых связей [6;253].

При урогенитальной хламидийной инфекции могут наблюдаться незначительные признаки воспаления, не сопровождающиеся образованием эрозий, лимфоидных фолликулов или слизисто-гнойными выделениями [7;192;252].

Установлено, что хламидий вызывают широкий спектр заболеваний различных органов и систем: дыхательной, мочеполовой, нервной, а также поражения сосудов, лимфоузлов, органов желудочно-кишечного тракта [53;85;111;241]. Они могут иметь как острое, так и хроническое течение [54;85;111;241;276]. Возбудителем урогенитального хламидиоза является Chlamydia trachomatis серотипов D, Е, F, G, Н, I, J, К, который имеет многоэтапный жизненный цикл развития с несколькими формами существования, различающимися по морфологическим и биологическим свойствам [132; 255].

Важной особенностью данного микроорганизма является его одновременное существование в нескольких формах, некоторые из которых не реагируют на антибактериальную терапию (внеклеточное элементарное, перси-стентное, внутриклеточное элементарное и критическое тельце). Внеклеточная форма возбудителя является высоко инфекционной, имеет вид сферы диаметром 0,15-0,2 мкм, метаболически неактивна. Из внутриклеточных форм наиболее важным является ретикулярное тельце (имеет структуру типичных грамотрицательных бактерий, размером около 1 мкм, метаболически активное, чувствительно к действию антибактериальных средств) [64;248;245;278].

Заражение человека происходит пассивно, путем фагоцитоза «элементарного тельца». Стадии болезни, развивающиеся после инфицирования хла-мидиями, опосредованы иммунным ответом. В большинстве исследований, касающихся механизмов заражения хламидиозом, показана важность иммунного ответа для освобождения от инфекции [8;35;273].

Защитная система организма часто не воспринимает хламидии как чужеродный объект, так как облигатный внутриклеточный жизненный цикл может приводить к маскировке генов и делает возбудителя недоступным для циркулирующих антител. Пептиды, входящие в состав белков наружной мембраны хламидии не включаются в презентирование иммунной системе [38;20;281]. Выявление УГХ зачастую вызывает затруднения из-за отсутствия патогномоничных симптомов [88;254].

Хламидии обладают способностью изменять свой цикл превращений одной формы в другую в результате воздействия различных факторов, что свидетельствует об их высокой пластичности [16;185;135]. По данным Л.К. Глазковой (1999) хламидии при персистенции теряют антигены наружной мембраны белковой и полисахаридной природы, определяющие их типо- и видоспецифичность. В результате изменения антигенной структуры они приобретают так называемый «белок теплового шока» (HSP-60). Установлено, что он в значительной мере идентичен антигену клеточных мембран человека, в результате чего иммунная система не воспринимает антигены хламидии как чужеродные и не дает на них естественную иммунную реакцию. Это не только способствует хронизации хламидийной инфекции, но и в значительной мере затрудняет лабораторную диагностику хламидиозов. Это обусловливает широкое распространение инфекции, персистенцию ее в организме, преимущественно субклиническое течение заболевания [29;179;232;239].

Несмотря на существование принципов лечения женщин, больных уро-генитальным хламидиозом, до настоящего времени не учтены и не реализованы все возможности макроорганизма, что и определяет большой процент рецидивов заболевания [121;80].

Исследователями установлено, что некоторые антитела к липополиса-харидам хламидии обладают аутоантигенными свойствами и перекрестно реагируют с плазменными липидами [210]. Такие реакции приводят к накоплению продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и вызывают развитие дефицита антиоксидантов, что снижает эффективность применяемых стандартных схем лечения [108; 196].

В патогенезе урогенитального хламидиоза имеет значение непосредственное действие возбудителя на инфицированные клетки эпителия и повреждения окружающих тканей гидролитическими лизосомальными ферментами, выбрасываемыми из инфицированных клеток в период размножения микроорганизма. В результате размножения возбудителя и его патогенного действия на месте первичного очага возникают отек и гиперемия слизистой оболочки, нарушается целостность эпителиального слоя с частичной десква-мацией клеток, определяется лимфоидная субэпителиальная и более глубокая инфильтрация, формируется воспалительный экссудат, возникают функциональные нарушения [100;130;260].

По мнения большинства исследователей интенсивность патологического процесса при восходящей инфекции зависит от таких факторов, как предварительная сенсибилизация организма, степень вирулентности инфицирующего штамма и реактивность иммунной системы организма больного [167;122;133].

Важной особенностью инфекций, передающихся преимущественно половым путем, является сочетание нескольких возбудителей у одного пациента. Полученные Э.В. Введенской, Н.Е. Абайтовой и И.В. Хавановой (2004) данные позволяют утверждать, что урогенитальный хламидиоз характеризуется высоким удельным весом микст-инфекций. Они в свою очередь могут являться причиной развития вторичного бесплодия, перинатальной инфекции, невынашивания плода у женщин [97;171;97;235;268].

Методы статистического анализа данных

Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) Образование циркулирующих иммунных комплексов представляет собой важным показателем активности патологического процесса. Длительная персистирующая инфекция может стать причиной повышенной концентрации ЦИК в крови. Выявление уровня ЦИК производили преципитацией из сыворотки крови (0,3 мл) комплексов антиген-антитело в 3,75% растворе ПЭГ-6000, приготовленном с использованием 0,1 М боратного буфера (рН 8,4), при комнатной температуре с последующим (через 60 мин) фотометрическим определением плотности преципитата при длине волны 450 нм. Метод определения фагоцитарной реакции лейкоцитов крови

Оценку функциональной активности полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови проводили в тесте с микробной тест-культурой [111]. Фагоцитарная активность лейкоцитов определялась при помощи процентного отношения активных, участвовавших в фагоцитозе лейкоцитов, к общему числу подсчитанных нейтрофильных лейкоцитов.

Методы оценки ферментативной активности нейтрофилов Тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест)

Определение функциональной активности полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови осуществляли в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест), отражающий степень активизации кислородоза-висимых механизмов бактерицидной активности нейтрофилов [143].

Каплю крови на предметном стекле смешивали с раствором нитросинего тетразолия (Sigma, США), инкубировали при 37 в течение 30 минут. Определяли уровень спонтанного (базального) и стимулированного продиги-озаном (0,2 мг на 1 мл фосфатного 0Д5М буфера) НСТ Затем в предварительно окрашенном мазке просчитывали количество нейтрофилов, содержащих гранулы формазана. Подсчет клеток осуществляли в микроскопе «Эрга-вал» (Германия) с увеличением 10x100 [175].

Определение активности миелопероксидазы в нейтрофильных гранулоцитах (Allen R.C., Stephens J.T Jr., 2011)

С целью определения уровня активности миелопероксидазы в нейтрофильных гранулоцитах готовили мазки крови, наносили на них в темноте сначала первую буферно-инкубационную смесь в течение 2 мин. с последующим промыванием дистиллированной водой, затем вторую буферно-инкубационную смесь в течение 2 мин. с последующим промыванием дистиллированной водой. Первая буферно-инкубационная смесь приготовлена на основе медного купороса, к 1 г которого добавляли буферную смесь до 100 мл, а для второй смеси использовали основной бензидин, 10 мг которого растворяли в 1-1,5мл 960 этилового спирта, затем разбавляли 10 мл дистиллированной воды. Далее мазки высушивали и окрашивали 0,5% раствором нейтрального красного в течение 0,5-1 мин. По количеству окрашенных гранул в цитоплазме нейтрофилов судили об активности миелопероксидазы.

Метод определения активности катионных белков нейтрофильных гранулоцитов

Катионные белки определяли с помощью лизосомально-катионного теста (ЛКТ). Для этого готовили препараты крови, окрашенные зеленым азуром А и определяли средний цитохимический коэффициент (СЦК) в зрелых нейтрофилах. В каждом препарате крови подсчитывали не менее 100 клеток и определяли по формуле значение СЦК.

В норме все нейтрофильные гранулоциты крови содержат лизосомаль-но-катионные белки (ЛКБ), то есть процент протеинположительных нейтрофилов составляет 95-100%, а средний цитохимический коэффициент составляет в норме около 1,9.

Методика выявления щелочной фосфатазы Активность ЩФ определяли методом азосочетания по Кеплоу, принципом которого является расщепление щелочной фосфатазой а-нафтил-фосфата с освобождением а-нафтола, образующего с соями диазония нерастворимый окрашенный в коричневый цвет осадок в местах локализации фермента. Высохшие на воздухе мазки фиксировали в 10% растворе формалина при температуре 0-50С в течение 30 с. На высохшие мазки наносили буфер-но-инкубационную среду и оставляли мазки при комнатной температуре на 8-10 мин., затем ополаскивали в проточной воде в течение 10 с. Инкубационную среду готовили перед употреблением: 35 мг а-нафтилфосфата, 35 мг прочного синего RR, 35 мл буферного раствора. После инкубации производили докрашивание гематоксилином Майера в течение 3-4 мин. и высчитывали СЦК (средний цитохимический коэффициент). При проведении исследований применялась оценка результатов по М.Г. Шубич, Б.С. Нагоеву (1980).

Методика выявления кислой фосфатазы

Готовили мазки крови, фиксировали в парах 40% формалина 1-3 минуты и инкубировали в буферно-инкубационной смеси. Для приготовления буферной смеси к 0,2 М раствора янтарной кислоты добавляли 12 мг ЭДТА и 0,2 М NaOH, доводили рН до 5,0, затем в инкубационную смесь добавляли 0,6612 мл буферной смеси для обеспечения рН 5,0.

Инкубацию проводили в темноте 2 ч., промывали дистиллированной водой, высушивали и дополнительно окрашивали мазки крови 0,5% вод-ным раствором метиленового синего в течение 0,5-1 мин. и по количеству окрашенных гранул красно-коричневого цвета в цитоплазме нейтрофилов, ядра которых докрашены в голубой цвет. Образовавшийся комплекс (азокраситель) окрашивал кислую фосфатазу, содержащуюся внутри в виде гранул в цитоплазме нейтрофильных гранулоцитов [200]. По их количеству определяли процент активности фермента кислой фосфатазы и средний цитохимический индекс.

Количественное определение уровня цитокинов с помощью специфических антител является сегодня самым распространенным способом детекции этих белков [167]. Нами применялся набор реактивов фирмы «Bender Medsystems» (Австрия) для определения цитокинов методом проточной цитометрии.

Изучали спонтанную и индуцированную способность лейкоцитов крови секретировать IL-ip, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, фактор некроза опухоли-а (FNO-a) и гамма интерферон (IFN-y). В качестве мутагена использовали ФГА. Для определения продукции про- и противовоспалительных цитокинов постановку ИФА проводили в соответствии с методическими рекомендациями производителя.

Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили с определением t-критерия Фишера-Стьюдента с использованием пакета программ Statistica 6.0. Оценку достоверности полученных результатов, не подчиняющихся закону нормального распределения, проводили с использованием непараметрического метода - определения критерия по Манну-Уитни. Различия считали достоверными при уровне статистической значимости р 0,05.

Данные лабораторных и инструментальных исследований

Высохшие на воздухе мазки фиксировали в 10% растворе формалина при температуре 0-50С в течение 30 с. На высохшие мазки наносили буфер-но-инкубационную среду и оставляли мазки при комнатной температуре на 8-10 мин., затем ополаскивали в проточной воде в течение 10 с. Инкубационную среду готовили перед употреблением: 35 мг а-нафтилфосфата, 35 мг прочного синего RR, 35 мл буферного раствора. После инкубации производили докрашивание гематоксилином Майера в течение 3-4 мин. и высчитывали СЦК (средний цитохимический коэффициент). При проведении исследований применялась оценка результатов по М.Г. Шубич, Б.С. Нагоеву (1980).

Методика выявления кислой фосфатазы Готовили мазки крови, фиксировали в парах 40% формалина 1-3 минуты и инкубировали в буферно-инкубационной смеси. Для приготовления буферной смеси к 0,2 М раствора янтарной кислоты добавляли 12 мг ЭДТА и 0,2 М NaOH, доводили рН до 5,0, затем в инкубационную смесь добавляли 0,6612 мл буферной смеси для обеспечения рН 5,0.

Инкубацию проводили в темноте 2 ч., промывали дистиллированной водой, высушивали и дополнительно окрашивали мазки крови 0,5% вод-ным раствором метиленового синего в течение 0,5-1 мин. и по количеству окрашенных гранул красно-коричневого цвета в цитоплазме нейтрофилов, ядра которых докрашены в голубой цвет. Образовавшийся комплекс (азокраситель) окрашивал кислую фосфатазу, содержащуюся внутри в виде гранул в цитоплазме нейтрофильных гранулоцитов [200]. По их количеству определяли процент активности фермента кислой фосфатазы и средний цитохимический индекс.

Определение уровня цитокинов Количественное определение уровня цитокинов с помощью специфических антител является сегодня самым распространенным способом детекции этих белков [167]. Нами применялся набор реактивов фирмы «Bender Medsystems» (Австрия) для определения цитокинов методом проточной цитометрии.

Изучали спонтанную и индуцированную способность лейкоцитов крови секретировать IL-ip, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, фактор некроза опухоли-а (FNO-a) и гамма интерферон (IFN-y). В качестве мутагена использовали ФГА. Для определения продукции про- и противовоспалительных цитокинов постановку ИФА проводили в соответствии с методическими рекомендациями производителя.

Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили с определением t-критерия Фишера-Стьюдента с использованием пакета программ Statistica 6.0. Оценку достоверности полученных результатов, не подчиняющихся закону нормального распределения, проводили с использованием непараметрического метода - определения критерия по Манну-Уитни. Различия считали достоверными при уровне статистической значимости р 0,05.

Клинические проявления урогенитального хламидиоза Было обследовано 296 женщин с хроническим урогенитальным хлами-диозом. Проведенные исследования показали, что в ряде случаев УГХ сочетался с другими урогенитальными инфекциями, такими как гонорея, трихо-мониаз, микоплазмоз и вирусные инфекции (таблица 3). Таблица 3 - Результаты ПЦР-исследования влагалищного содержимого у женщин с урогенитальным хламидиозом (%)

N. gonorrhoeae 1,4+0,8 Trichomonas vaginalis 3,0+2,2 Из таблицы видно, что наиболее часто ассоциантом урогенитального хламидиоза являлся урогенитальный герпес (32 пациента), затем в порядке убывания частоты встречаемости можно отметить микоплазменную инфекцию (23 больных) и папилломавирусы (19 человек).

В ходе исследований 62 женщин из группы сравнения 10 человек были исключены из исследований, в связи с обнаружением в ПЦР-исследованиях вирусов герпеса и остроконечных кондилом. Полученные данные сравнивали с результатами исследования 52 практически здоровых женщин, репрезентативных по возрасту.

При клиническом обследовании женщин репродуктивного возраста с изолированным течением урогенитального хламидиоза (182 пациентки) установлено, что 51,6% обследованных (94 женщины) не предъявляли жалоб, характерных для воспалительных процессов в урогенитальном тракте. Только 82 обследованные женщины (48,4%) основной группы отмечали незначительные субъективные расстройства.

Установлено, что больше половины (51,6%) обследованных основной группы субъективных признаков заболевания не испытывали. У остальных женщин отмечались незначительные субъективные ощущения, наиболее частыми из которых являлись: чрезмерная влажность половых органов (76 обследованных), зуд и жжение в области урогенитального тракта (58 женщин), частые позывы к мочеиспусканию (42 пациентки), скудные слизистые выделения (39 женщин) и боли при мочеиспускании (таблица 4). Таблица 4 - Субъективные симптомы урогенитального хламидиоза у женщин

Пациентки обращались за медицинской помощью по рекомендации половых партнеров, либо для сдачи анализов с целью обследования. Однако при сборе анамнестических данных часто выявлялся факт длительного самостоятельного лечения воспалительных процессов мочеполовой системы. При объективном осмотре у 91,8% женщин (167 человек) были выявлены признаки воспаления в урогенитальном тракте, и только у 15 пациенток (8,2%) отсутствовали какие-либо изменения в нижних и верхних отделах мочеполовой системы, характерные для хламидиоза (таблица 5). Таблица 5 - Клинические симптомы урогенитального хламидиоза у женщин

Из всех клинических проявлений урогенитального хламидиоза наиболее часто встречались серозно-гнойные выделения (117 пациенток), ггиперемия и отек слизистой оболочки наружного отверстия уретры (95 обследованных), боли и тяжесть внизу живота (83 больных), отечность и гиперемия слизистой оболочки шейки матки (75 женщин). Значительное количество обследованных отмечали нарушения генеративной и половой функций (58 и 23 пациенток). Отсутствие объективных симптомов наблюдалось лишь у 15 женщин. 3.2. Данные лабораторных и инструментальных исследований

У всех обследованных женщин с урогенитальным хламидиозом изменений в моче и крови (лейкоцитоз, СОЭ, показатель гемоглобина, количество эритроцитов) не наблюдалось. Кольпоскопическая картина характеризовалась отеком и гиперемией слизистой оболочки, в 12-и случаях - наличием мелких папул, расположенных на передней губе шейки матки. В подслизистой ткани определялись резко расширенные сосуды.

Далее было проведено изучение основных характеристик влагалищного содержимого, таких как степень чистоты, интенсивность роста микробиоты, количество лейкоцитов, интенсивность образования слизистого отделяемого и способность влагалища к слущиванию эпителия (таблица 6).

Установлено, что в группе обследованных с урогенитальным хламидиозом не встречались женщины с I и II степенью чистоты влагалищного содержимого при доминировании пациенток с IV степенью. В группе сравнения более половины обследованных имели I и II степени частоты влагалищного содержимого, IV степень частоты у данных женщин встречалась почти в 11 раз реже, чем при УГХ.

Проведенные исследования выявили также существенные отличия интенсивности роста микробиоты урогенитального тракта у здоровых женщин и у пациенток с УГХ. Установлено, что более половины здоровых женщин имело скудную микробиоту и лишь три - обильную. Среди обследованных основной группы, напротив, почти половина пациенток имело обильную микробиоту.

Увеличение интенсивности роста микробиоты сопровождалось повышением содержания лейкоцитов в исследуемом материале, более интенсивным образованием слизистого отделяемого и пониженной способностью влагалища к самоочищению, которая зависит от функциональной активности яичников, так как вырабатываемые ими гормоны обеспечивают постоянную десквамацию и цитолиз поверхностных клеток.

Молекулярно-генетическое выявление трудно- и некультивируемых условно-патогенных микроорганизмов

Однако, ШУЮ Enterococcus faecalis и Corynebacterium spp. во влагалищном биотопе был выше в 2,0 и 1,7 раза, а в цервикальном отделяемом в 2,2 и 1,8 раза, по сравнению с группой здоровых женщин (р 0,05).

У здоровых женщин в биотопе влагалища доминировала нормальная микробиота, представленная, в основном, лактобациллами. Они, проявляя высокую степень колонизационной резистентности, являются одним из основных факторов поддержания межвидового баланса микроорганизмов данного биотопа. Показатели частоты встречаемости и плотности колонизации в обоих биотопах условно патогенных микроорганизмов не превышали значений нормоценоза.

Следовательно, при урогенитальном хламидиозе происходило снижение частоты встречаемости и колонизационной плотности нормофлоры на фоне повышения данных показателей у представителей условно-патогенной микрофлоры репродуктивного тракта. Наиболее часто встречающимся видом при дисбиотических нарушениях микробиоценоза влагалища, развивающимся при УГХ, являлся условно патогенный вид Enterococcus faecalis.

Молекулярно-генетическое выявление трудно- и некультивируемых условно-патогенных микроорганизмов Микробиологическое исследование позволяет идентифицировать микроорганизм до вида и определить чувствительность выделенного штамма к лекарственным препаратам. Однако этот метод не лишен ряда недостатков, так как условно-патогенная микрофлора, главным образом, представленная облигатно-анаэробными и факультативно-анаэробными микроорганизмами, для культивирования требует высококачественные селективные питательные среды, специализированные лаборатории, оснащенные необходимым лабораторным оборудованием для выращивания анаэробов, специальной подготовки медицинского персонала лаборатории. Метод ПЦР с детекцией результата по окончании реакции (по конечной точке) позволяет быстро и эффективно выявить искомый патогенный или условно-патогенный микроорганизм, минуя стадию культивирования и выделения чистой культуры.

В связи с этим, помимо бактериологического метода, для количественной оценки труднокультивируемых и некультивируемых условно-патогенных микроорганизмов применяли тест-систему Фемофлор-16, с использованием PCR Real time, реактивы производства ООО «НПО ДНК-Технология» (Россия). При помощи данного метода выявляли труднокультивируемые и некультивируемые факультативно- и облигатно анаэробные компоненты микрофлоры урогенитального тракта, которые могут являться этиологическим фактором развития бактериального вагинита и вагиноза, такие как Enterobacerium spp., Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia, Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Sneathia spp., Leptorichia spp., Fusobacterium spp., Megasphaera spp., Veilonella spp., Dialister spp., Lachnobacterium spp., Clostridium spp., Mobiluncus spp., Corynebacterium spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium vaginae; Mycoplasma hominis, Ureaplasma spp., Candida spp. Кроме того определяли количество Lactobacillus spp. (доля их в норме составляет более 80%).

Интерпретация результатов проведенного исследования проводили в 4 этапа: I этап. Оценка взятия биоматериала и общей бактериальной массы.

Контроль взятия материала (КВМ): для получения адекватных результатов исследования КВМ брали в количестве более 104 ГЭ/образец при условии lg (ГЭ/образец) 4,0. Если КВМ был менее 104 ГЭ/образец, то lg (ГЭ/образец) 4,0 - материала для исследования недостаточно, в таком случае в соответствии с рекомендациями производили повторное взятие материала. Общую бактериальную массу (ОБМ) выражали через показатель общей бактериальной обсемененности. В норме значение ОБМ составляет 105 5-109 ГЭ/образец или lg (ГЭ/образец) 5,5-9,0. Если ОБМ меньше 106 ГЭ/образец, то lg (ГЭ/образец) 6,0, т.е. общая бактериальная обсемененность влагалища низкая. Часто низкое значение ОБМ у женщин репродуктивного возраста является следствием применения антибактериальных препаратов. В этом случае исследование рекомендуется повторить не ранее чем через 1-2 недели после окончания курса терапии.

При нормоценозе относительное количество Lactobacillus spp. выше -0,1 lg ( 80%): нормоценоз. При умеренном дисбиозе относительное количество Lactobacillus spp. находится в интервале от -0,7 до -0,1 lg (20-80%). При выраженном дисбиозе относительное количество Lactobacillus spp. ниже -0,7 ( 20%). III этап. Оценка количественного соотношения условно-патогенных фа культативно-анаэробных и облигатно-анаэробных микроорганизмов. Проводили при умеренном или выраженном дисбиозе влагалища. Относительное количество микроорганизма менее -2,0 lg ( 1,0%) - незначительно повышенный уровень. Относительное количество микроорганизма от -2,0 до -1,0 lg (1-10%) - умеренно повышенный уровень. Относительное количество микроорганизма более -1,0 ( 10%) - значительно повышенный уровень. IV этап. Оценка наличия Mycoplasma hominis и грибов рода Candida. Далее приведены примеры результатов изучения урогенитальной микрофлоры у обследованных женщин при помощи теста Фемофлор 16 с наличием дисбиоза (рисунок 8 а, б) и при нормоценозе (рисунок 9). На рисунке 8а видно повышенное количество Gardnerella vaginalis/ Prevotella bivia/Porphyromonas spp. (лунка Fl), Eubacterium spp. (лунка Gl), Sneathia spp./ Leptotrichia spp./ Fusobacterium spp. (лунка HI), Lachnobacte-rium spp./ Clostridium spp. (лунка B2). Образцы в лунках El {Staphylococcus spp.), A2 (Megasphaera spp./ Veilonella spp./ Dialister spp.), D2 (Peptostrepto-coccus spp.) и E2 (Atopobium vaginae) имели количественные показатели в пределах нормы. Другие виды анаэробной микрофлоры урогенитального в образцах исследуемого материала не обнаруживались. 12.01.2015