Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Систематика, биология и экология коринебактерий (обзор литературы) 9
1.1. Общая характеристика рода Corynebacterium .9
1.2 Взаимодействие коринебактерий с организмом человека 17
1.3. Взаимодействие коринебактерий с микроорганизмами 24
1.4. Роль коринебактерий в норме и при инфекционной патологии .27
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 35
2.1. Общая характеристика, методы выделения и идентификации штаммов, использованных в работе 35
2.2. Методы изучения биологических свойств коринебактерий
2.2.1. Метод изучения антилизоцимной активности коринебактерий .36
2.2.2. Метод определения антикомплементарной активности коринебактерий 40
2.2.3. Метод определения лизоцимной активности коринебактерий .41
2.2.4. Метод определения чувствительности коринебактерий к антибиотикам 42
2.2.5. Метод определения каталазной активности .42
2.2.6. Метод определения продукции бактериями ингибиторов каталазы 43
2.2.7. Метод определения антагонистической активности коринебактерий .44
2.2.8. Метод определения влияния микроорганизмов на способность образовывать биопленки 46
2.2.9. Метод определения продукции лактобациллами перекиси водорода
2.2.10. Метод определения влияния коринебактерий на антагонистическую активность лактобацилл 48
2.2.11. Метод определения адгезивной способности коринебактерий 49
2.3. Методы статистической обработки полученных результатов 51
ГЛАВА 3. Видовой состав и биологические свойства коринебактерий, определяющие их взаимодействие с макроорганизмом 52
ГЛАВА 4. Биологические свойства коринебактерий, определяющие их взаимодействие с доминантными микроорганизмами .88
ГЛАВА 5. Биологические свойства коринебактерий, определяющие их взаимодействие с ассоциативными микроорганизмами .100
Заключение 109
Выводы .122
Список литературы
- Взаимодействие коринебактерий с микроорганизмами
- Роль коринебактерий в норме и при инфекционной патологии
- Метод определения антикомплементарной активности коринебактерий
- Биологические свойства коринебактерий, определяющие их взаимодействие с доминантными микроорганизмами
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Коринебактерии – разнообразная группа микроорганизмов, занимающих различные биотопы человека. В вагинальном биотопе коринебактерии являются представителями резидентной микрофлоры и находятся на втором месте по частоте встречаемости после лактобацилл.
Вступая в симбиотические взаимодействия с организмом хозяина, доминантными и ассоциативными микроорганизмами, коринебактерии участвуют в формировании ассоциативного симбиоза репродуктивного тракта женщин, являясь частью единой микроэкологической системы человека. Однако роль коринебактерий в занимаемом биотопе до сих пор не определена. Коринебактерии, как ассоцианты могут входить в состав бактериальных сообществ и выступать в роли патогенов (Belmares et al., 2007; Zasada et al., 2010; Bernard et al., 2012; Dez-Aguilar et al., 2013; и др.). С другой стороны, известна их роль как доминантов в реализации феномена колонизационной резистентности (Черкасов, 2011; Кремлева, 2013; и др.).
Коринебактерии выживают в биотопе как в условиях постоянного воздействия факторов врожденного иммунитета, так и при воздействии различных антибиотических веществ при проводимой антибиотикотерапии (Одинцова, 2002). Данная способность реализуется у коринебактерий благодаря наличию биологических свойств, определяющих их взаимодействие с макроорганизмом (наличие секретируемых факторов персистенции, антибиотикорезистентности, адгезивной способности).
Колонизируя вагинальный биотоп, коринебактерии взаимодействуют с другими членами сообщества: представителями нормофлоры и условно-патогенными микроорганизмами. Известно, что вагинальные штаммы коринебактерий проявляют способность ингибировать каталазу микроорганизмов, в частности Staphylococcus aureus, тем самым, повышая их чувствительность к пероксиду водорода лактобацилл (Сгибнев, 2002).
В тоже время, литературные данные относительно антагонистической активности коринебактерий к условно-патогенным микроорганизмам в вагинальном биотопе весьма противоречивы (Мартикайнен, 1997; Одинцова, 2002; Бухарин и др., 2012).
Таким образом, определение роли коринебактерий в формировании, поддержании и функционировании ассоциативного симбиоза репродуктивного тракта женщин можно понять через призму исследования их биологических свойств, определяющих их взаимодействие с макроорганизмом, доминантными и ассоциативными микроорганизмами.
Вышеизложенное явилось основанием для формулирования цели и задач настоящего исследования.
Цель настоящей работы – изучение биологических характеристик коринебактерий, определяющих формирование ассоциативного симбиоза репродуктивного тракта женщин в норме и при дисбиозе.
Основные задачи исследования:
1. Определить видовой состав и частоту встречаемости коринебактерий в
вагинальном биотопе и сравнить качественные и количественные характеристики в
норме и при дисбиозе.
2. Изучить биологические свойства (антилизоцимную активность,
антикомплементарную активность, каталазную активность, продукцию ингибиторов
каталазы, антибиотикорезистентность) коринебактерий, выделенных из
репродуктивного тракта женщин в норме и при дисбиозе.
-
Исследовать адгезию коринебактерий к фибронектину и к вагинальным эпителиоцитам, а также изучить влияние на адгезию биотических и абиотических факторов (pH, температуры, ультрафиолетового облучения, трипсина, маннозы, хлорамфеникола).
-
Исследовать взаимодействие вагинальных коринебактерий и лактобацилл в реализации окислительного механизма антагонистических отношений бактерий.
-
Оценить влияние коринебактерий на прирост планктонной культуры и биопленкообразование аллохтонных микроорганизмов вагинального биотопа.
Научная новизна.
Впервые, с позиции ассоциативного симбиоза, проведено комплексное изучение биологических характеристик коринебактерий, изолированных из репродуктивного тракта здоровых женщин и женщин с микроэкологическими нарушениями. Дана таксономическая характеристика исследуемых бактерий в зависимости от микроэкологического состояния вагинального биотопа. Охарактеризован спектр биологических свойств коринебактерий, выделенных в условиях нормо- и патоценоза, включающий факторы персистенции, каталазную активность, ингибиторы каталазы, антибиотикорезистентность, лизоцимную активность, адгезивную способность.
Изучена адгезивная способность вагинальных изолятов коринебактерий к фибронектину человека и описана зависимость адгезивной способности выделенных микроорганизмов от физико-химических (рН, температура, УФО) и биологических факторов (трипсин, манноза, хлорамфеникол). Установлена роль фибронектина в адгезии коринебактерий к вагинальным эпителиоцитам. Определено увеличение индекса и показателя адгезии у всех исследуемых штаммов после обработки вагинальных эпителиоцитов фибронектином (Положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке № 2014117850).
Впервые выявлено усиление и потенцирование коринебактериями антагонизма доминантов – пероксидпродуцирующих лактобацилл к ассоциантам (S. aureus). Данный эффект характеризует особенности бактериального антагонизма доминантной и ассоциативной микрофлоры, в основе которого лежит
окислительный механизм. Выявлено, что реализация окислительного механизма антагонизма зависит от выраженности продукции перекиси водорода и ингибиторов каталазы и чаще проявляется у коринебактерий с высокими значениями ингибиторов каталазы и лактобацилл со средними значениями продукции перекиси водорода.
При исследовании межбактериальных взаимодействий установлено разнонаправленное влияние коринебактерий на прирост планктонной культуры и биопленкообразование условно-патогенных микроорганизмов (S. aureus и Escherichia coli). Экзометаболиты коринебактерий, выделенных от здоровых женщин, подавляли биопленкообразование S. aureus и E. coli, тогда как экзометаболиты коринебактерий, выделенных при микроэкологических нарушениях, подавляли прирост планктонной культуры.
Теоретическая и практическая значимость.
Полученные в работе данные расширяют представление о роли коринебактерий в формировании, поддержании и функционировании ассоциативного симбиоза репродуктивного тракта женщин и раскрывают механизмы межбактериального взаимодействия с участием коринебактерий в реализации колонизационной резистентности вагинального биотопа.
Практическая ценность работы характеризуется возможностью отбора доминирующих видов коринебактерий в качестве пробиотических микроорганизмов на основе их биологических свойств (факторов персистенции, лизоцимной активности, антибиотикорезистентности, адгезивной способности, способности ингибировать каталазу аллохтонных микроорганизмов).
Для повышения адгезивной способности коринебактерий к вагинальным эпителиоцитам может быть использован разработанный «Способ усиления адгезии коринебактерий к вагинальный эпителиоцитам», основанный на предварительной обработке вагинальных эпителиоцитов раствором фибронектина человека, приводящей к увеличению индекса и показателя адгезии исследуемых микроорганизмов (Положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке № 2014117850).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Коринебактерии – гетерогенная группа микроорганизмов, обладающая
устойчивостью к факторам врожденного иммунитета хозяина,
антибиотикорезистентностью, высокой адгезивной способностью к фибронектину,
что определяет их колонизирующую способность и сохранение в ассоциативном
симбиозе репродуктивного тракта женщин в условиях нормо- и патоценоза.
2. Доминирующие виды коринебактерий участвуют в поддержании
колонизационной резистентности репродуктивного тракта женщин за счет
потенцирования антагонистической активности лактобацилл по отношению к
ассоциативным микроорганизмам и подавления биопленкообразования ассоциантов.
Апробация работы и публикации.
Основные положения работы доложены на VI-VIII Российских научных конференциях «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009, 2012, 2015); 2 Международном конгрессе по пробиотикам «Санкт-Петербург-Пробиотики-2009» (Санкт-Петербург, 2009); II Всероссийской молодёжной научной школе-конференции "Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах" (Оренбург, 2014).
По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 5 в научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах и содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов, три главы собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 35 отечественных и 158 иностранных научных источников. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 18 рисунками.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора.
Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы в рамках гос. задания Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Формирование и функционирование микробных симбиозов в живых системах», № гос. регистрации 01201067427; по программе фундаментальных исследований УрО РАН проект № 12-У-4-1023 «Симбиотические взаимодействия микроорганизмов и хозяина как биологическая основа колонизационной резистентности».
Научные положения и выводы полностью базируются на результатах собственных исследований автора.
Взаимодействие коринебактерий с микроорганизмами
Коринебактерии - разнообразная группа грамположительных бактерий, занимающая различные биотопы тела человека. Их изолируют из сыра, молока, почвы, овощей и фруктов. Коринебактерии играют существенную роль в процессах превращения углерод- и азотсодержащих веществ биосферы, поскольку они разлагают соединения, не использующиеся большинством других микроорганизмов (углеводороды, гумус, лигнин, синтетические вещества-гербициды, инсектициды и др.) Многие представители этих бактерий имеют большое значение для промышленности и сельского хозяйства. С. glutamicum используются в промышленном производстве лизина, аргинина, треонина, изолейцина, валина, серина, триптофана, фенилаланина и гистидина [123]. C. kutsheri рекомендуют использовать в промышленности для разрушения водонефтяных пленок [172], C. casei, C. variabile используют при производстве сыра [117, 157].
Коринебактерии входят в состав микрофлоры различных биотопов тела человека и животных. Выделяют патогенные коринебактерии роль, которых в развитии инфекции доказана. Типичными представителями являются C. diphtheriae, С. ulcerans, С. pseudotuberculosis [133, 161, 164]. Данные бактерии вызывают развитие дифтерии и дифтериеподобные заболевания у человека. Кроме того, выделяют недифтерийные или условно-патогенные коринебактерии, которые являются частью резидентной микрофлоры человека и их роль в развитии инфекции окончательно не ясна [47]. Авторы рассматривают отдельных представителей данной группы микроорганизмов не только как участников в формировании микробиоценозов и обеспечении колонизационной резистентности различных биотопов тела человека, но и в качестве микроорганизмов перспективных для пробиотикотерапии [18, 96]. В вагинальном биотопе коринебактерии встречаются независимо от возраста женщины и микроэкологического состояния биотопа. Данные микроорганизмы занимают второе место по частоте встречаемости после лактобацилл [15]. Роль коринебактерий в занимаемом биотопе до сих пор неопределенна. Одни исследователи считают, что коринебактерии могут входить в состав бактериальных ассоциаций и не только поддерживать воспалительный процесс, но и в некоторых случаях являться его причиной [46, 162], другие -утверждают о том, что представители данной группы микроорганизмов участвуют в формировании экологического барьера влагалища и в обеспечении устойчивости микробиоценоза вагинального биотопа [18, 20, 21].
Поскольку нарушения микрофлоры репродуктивного тракта женщин являются причиной инфекционно-воспалительных заболеваний, инфекционных осложнений беременности и родов, а также бесплодия, вопрос о роли коринебактерий в формировании колонизационной резистентности и развитии инфекции остается важной проблемой теоретической и клинической медицины.
Несмотря на относительно длительную историю изучения рода Corynebacterium и многочисленные попытки систематизировать накопленные данные и представить их классификацию, последняя до сих пор подвергается постоянному пересмотру и расширению [48].
Термин коринеформные бактерии был впервые введен в 1896 г. Леманом и Нейманом для обозначения возбудителя дифтерии и объединял большую группу близких по морфологическим и биохимическим свойствам микроорганизмов. Термин "коринеформные" был связан с плеоморфной палочковидной формой этих грамположительных бактерий.
В определителе Берджи [23] на основании морфологических и биохимических свойств род Corynebacterium объединял морфологически близкие виды, существенно различавшиеся, однако, по хемотаксономическим признакам (например, составу клеточных стенок и нуклеотидному составу ДНК). Он включал C. diphtheriae и другие виды, патогенные для человека и животных, а также виды фитопатогенных и сапрофитных коринебактерий. Позже проведенные хемотаксономические исследования позволили найти общие черты среди коринеформных бактерий в целом, а также дифференцировать между собой отдельных их представителей: Turicella, Arthrobacter, Brevibacterium, Dermabacter, Rothia, Exiguobacterium, Oerskovia, Cellulomonas, Cellulosimicrobium, Microbacterium, Curtobacterium, Leifsonia, Arcanobacterium, Gardnerella, в том числе и род Corynebacterium [98, 99, 112].
Проведенные в последние годы исследования по таксономии рода Corynebacterium с использованием методов генетики и молекулярной биологии (определение нуклеотидного состава ДНК, гибридизация нуклеиновых кислот) [37], метода анализа нуклеотидных последовательностей в рибосомальных РНК [100, 186], газожидкостной хроматогорафии клеточных жирных кислот [68, 85], полного сиквенса генома бактериальной клетки [169, 174], масс-спектрофотометрии [37, 102] позволили получить новую информацию о характеристике известных и выявить ряд новых видов бактерий рода Corynebacterium: C. aurimucosum sp. nov., C. aquatimens sp. nov., C. humireducens sp. nov., C. pilbarense sp. nov., C. pyruviciproducens sp. nov., C. timonense sp. nov. and C. massiliense sp. nov. [38, 39, 111, 173, 175, 191].
На основе современной систематики, а также по классификации Берджи, род коринебактерии входит в семейство Corynebacteriaceae, порядок Actinomycetales, класс Actinobacteria, тип Actinobacteria, царство Бактерии [23, 48] и включает 88 видов. Большинство видов выделено от человека и являются возбудителями случайных и крайне редких инфекций или представителями резидентной микрофлоры различных биотопов. Кроме того, коринебактерии присутствуют в микрофлоре животных и птиц, а также источником выделения являются объекты окружающей среды (Таблица 1).
Роль коринебактерий в норме и при инфекционной патологии
Для определения продукции пероксида водорода у лактобацилл использовали модифицированный С.В. Черкасовым с соавторами [33] метод Wilks M. et аl. [188], основанный на выявлении окисления тетраметилбензидина (ТМБ) в присутствии пероксидазы хрена.
Штаммы лактобацилл культивировали сутки в бульоне МРС, трижды отмывали, делали взвесь бактериальных клеток 109 КОЕ/мл в жидкой среде, содержащей КН2РО4 – 2,5 г/л, MnSO4 – 0,05 г/л, MgSO4 – 0,2 г/л, глюкозу – 20 г/л и инкубировали при t=37С 7 ч. Затем взвеси центрифугировали для осаждения бактериальных клеток и отбирали супернатанты, в которых определяли пероксид водорода. Параллельно для построения калибровочной кривой готовили раствор перекиси водорода в указанной жидкой среде в следующих концентрациях: 0 мкмоль/мл; 0,027 мкмоль/мл; 0,108 мкмоль/мл; 0,43 мкмоль/мл; 0,86 мкмоль/мл; 1,72 мкмоль/мл; 3,44 мкмоль/мл. Готовили раствор ТМБ, для этого ТМБ растворяли в 0,37% HCl в соотношении 10 мг ТМБ к 1мл раствора кислоты, затем добавлением дистиллированной воды к полученному раствору получали рабочую концентрацию ТМБ 200 мкг/мл. Готовили раствор пероксидазы хрена в цитратном буфере (рН=6,0) в концентрации 12 нг/мл.
Для определения концентрации пероксида водорода в лунки 96 луночных планшет раскапывали по 100 мкл супернатантов штаммов лактобацилл и по 100 мкл калибровочных растворов пероксида водорода, затем во все лунки добавляли по 50 мкл раствора ТМБ и по 50 мкл раствора пероксидазы хрена. Лунки инкубировали в термостате при t=37С 5-7 мин и останавливали реакцию окисления ТМБ добавлением 50 мкл 10% раствора H2SO4. Замеряли оптическую плотность опытных и контрольных лунок (=492 нм). На основании данных оптической плотности контрольных лунок строили калибровочную кривую и определяли концентрацию пероксида водорода в супернатантах исследуемых штаммов лактобацилл. Для эксперимента было отобрано 3 штамма Lactobacillus аcidophilus (L. аcidophilus №1 с высокой степенью пероксид продукции 0,62 мкмоль/мл, L. аcidophilus №2 и №3 со средней и низкой степенью пероксид продукции 0,44 и 0,01 мкмоль/мл соответственно).
Определение влияния коринебактерий на антагонистическую активность лактобацилл определяли по методу Черкасова С.В. с соавторами [33].
Метод осуществляли следующим образом. Культивировали коринебактерии в 2% мясопептонном бульоне в микроаэрофильных условиях при 37С (НПО «Питательные среды», Махачкала) 24 часа, а лактобациллы в бульоне МRS («Sifin», Германия) 16 часов. Супернатанты коринебактерий отделяли от бактериальных клеток центрифугированием при 3000об/мин в течение 15 минут, и стерилизовали добавлением 0,2 мл хлороформа. Супернатанты лактобацилл отделяли от бактериальных клеток центрифугированием при 3000об/мин в течение 15 минут, дважды отмывали и инкубировали в жидкой среде, содержащей КН2РО4 – 2,5 г/л, MnSO4 – 0,05 г/л, MgSO4 – 0,2 г/л, глюкозу – 20 г/л (среда N2) при 37С в течение 8 часов. После чего однократно центрифугировали при 3000об/мин в течение 15 минут и в эксперименте использовали надосадочную жидкость. В качестве контроля использовали 2% мясопептонный бульон и среду (N2), обработанные хлороформом. Для изучения влияния супернатантов коринебактерий на антагонизм пероксид продуцирующих лактобацилл к S. aureus, готовили взвесь 105КОЕ/мл тест-штамма S. aureus, из суточной агаровой культуры бактерий на 0,9% растворе NaCl. К 0,1мл микробной взвеси добавляли 0,9 мл супернатантов коринебактерий (в контрольных пробах использовали соответственно 2% мясопептонный бульон и взвесь 105КОЕ/мл S. aureus). Смеси инкубировали при 37С 60 мин. После чего к 0,1 мл смеси добавляли 0,9 мл супернатанта лактобацилл. Инкубировали при 37С 60 мин. В завершении к 0,2 мл взвеси добавляли 2 мл 2% мясопептонного бульона и культивировали при 37С в микроаэрофильных условиях. О влиянии супернатантов коринебактерий на антагонизм пероксид продуцирующих лактобацилл к S. aureus судили по приросту биомассы S. aureus исходя из оптической плотности бульонных культур на фотометре через 24 часа культивирования. Расчет антагонистической активности (АА) можно произвести по формуле: АА = ОДк - ОДоп) 100% ОДк , где ОДк - оптическая плотность индикаторной культуры за 24 часа роста под влиянием культуральной жидкости лактобацилл; ОДоп - оптическая плотность индикаторной культуры за 24 часа роста в опыте, при действии культуральной жидкости исследуемого штамма. Антагонистическую активность исследуемых штаммов выражали через процент угнетения прироста тест - культуры под влиянием культуральной жидкости антагониста.
Для эксперимента выделенные коринебактерии культивировали в 2% мясо-пептонном бульоне (МПБ, НПО «Питательные среды», Махачкала) при 37С в течение 24 часов. Культуры трижды отмывали центрифугированием (3000об/мин, 15 минут) в 0,9% растворе NaCl. Готовили взвесь бактериальных клеток 108 КОЕ/мл на цитратно-фосфатном буфере рН 4,5. (Буфер получали смешиванием двух растворов: раствор А: содержал 22,9 мл Na2HP04 12 Н20, (35,8 г Na2HP04 12 Н20 в 0,5 л дистиллированной воды) и раствор Б: содержал 27,1мл С6Н8О7 Н2О (10,5 г цитрата в 0,5 л дистиллированной воды).
Метод определения антикомплементарной активности коринебактерий
Таким образом, при определении адгезии исследуемых штаммов к фибронектину, фиксированному на полистироловых планшетах, было установлено, что способностью адгезии к фибронектину обладали 100% штаммов, выделенных от здоровых женщин и 66,7% штаммов, выделенных от женщин с микроэкологическими нарушениями. Наиболее выраженная способность к адгезии была у штаммов C. minutissimum, C. amycolatum, выделенных от здоровых женщин. Минимальной адгезивной способностью проявлял вид C. afermentas, выделенный при микроэкологических нарушениях.
Полученные результаты были сопоставимы с данными при изучении адгезивной способности коринебактерий на модели вагинальных эпителиоцитов. Так, коэффициент адгезии, определенный планшетным методом у высокоадгезивных штаммов C. minutissimum, C. amycolatum составил 38,3% и 30,6%, что соответствовало индексу адгезии, определенному с использованием модели вагинальных эпителиоцитов, который был равен 24,6 и 16,7 бактер. кл/эпител. соответственно. У низкоадгезивного штамма C. afermentans, выделенного при микроэкологических нарушениях, коэффициент адгезии, определенный планшетным методом, был равен 5,7%, что соответствовало 2,9бактер. кл/эпител, определенным с использованием модели вагинальных эпителиоцитов. Разработанный метод, позволяет адекватно оценить адгезивную способность вагинальных коринебактерий, поскольку сравнение его с исследованием адгезии на модели эпителиоцитов показало сопоставимые результаты. По – видимому, этот метод может быть применен не только к коринебактериям, так как ранее было показано использование фибронектина в оценке адгезивной способности S.aureus, Lactobacillus iners и т.д. [110, 114].
В целом, как видно из результатов, следует отметить, что у женщин с микроэкологическими нарушениями чаще встречаются низкоадгезивные и среднеадгезивные штаммы при отсутствии высокоадгезивных. Наличие при дисбиозе низкоадгезивных штаммов в вагинальном биотопе, вероятно, может являться причиной развития дисбиотических состояний. Так как считают, что для реализации феномена колонизационной резистентности в вагинальном биотопе необходимо присутствие высокоадгезивных штаммов, таких как лактобациллы [31].
Нами впервые было описано явление усиления адгезивной способности коринебактерий к вагинальным эпителиоцитам после обработки последних фибронектином, которое выражалось в увеличении индекса и показателя адгезии исследуемых микроорганизмов.
С практической точки зрения это может быть использовано для различных биотехнологических и медицинских целей, в том числе и для колонизации пробиотическими штаммами вагинального биотопа с целью коррекции дисбиотических и воспалительных состояний репродуктивного тракта женщин, а также для создания моделей инфекционного процесса.
Полученные данные свидетельствуют об участии коринебактерий в формировании ассоциативного симбиоза репродуктивного тракта женщин. По-видимому, фибронектин следует рассматривать не только как матриксный белок, но и как фактор, способствующий адгезии бактерий к эпителиоцитам человека. Фибронектин, повышая колонизационный потенциал коринебактерий, позволяет конкурировать исследуемым бактериям за сайты адгезии с аллохтонными микроорганизмами, что фактически является аргументом в пользу их участия в реализации колонизационной резистентности хозяина, и определяет перспективы использования этого белка в целях повышения колонизирующей способности пробиотиков.
Проведено комплексное изучение биологических свойств непатогенных коринебактерий выделенных у здоровых женщин и женщин с микроэкологическими нарушениями. Описан видовой состав, факторы персистенции (антилизоцимная, антикомплементарная активности), антибиотикорезистентность, определена природа поверхностных адгезинов коринебактерий ответственных за процесс адгезии, изучена способность адгезии к фибронектину человека и к вагинальным эпителиоцитам. Предложен способ усиления адгезии бактерий к вагинальным эпителиоцитам.
Выявлено увеличение видового разнообразия коринебактерий при микроэкологических нарушениях репродуктивного тракта женщин. Вне зависимости от микроэкологического состояния, доминирующими видами в популяции коринебактерий были виды C. minutissimum, C. amycolatum, C. group JK.
Выявлено возрастание антилизоцимной и антикомплементарной активностей коринебактерий при микроэкологических нарушениях, что вероятно отражает их адаптивные изменения и определяет возможность сохранения в вагинальном микробиоценозе как в условиях нормо -, так и патоценоза.
Определено наличие у коринебактерий устойчивости к различным антибиотическим веществам. Данное свойство, вероятно, является фактором адаптации для коринебактерий и определяет возможность сохранения и персистенции их в вагинальном микробиоценозе как в условиях нормоценоза, так и при микроэкологических нарушениях в условиях проводимой антибиотикотерапии.
Изучена адгезивная способность вагинальных изолятов коринебактерий к фибронектину человека и выявлена зависимость адгезивной способности от рН среды. Адгезивная способность к фибронектину у вагинальных изолятов коринебактерий была максимальной при низких значениях рН и зависела от микроэкологического состояния, при котором микроорганизмы были выделены.
Выявлена зависимость адгезивной способности коринебактерий от физико-химических (температура, УФО) и биологических (трипсин, манноза, хлорамфеникол) факторов. Снижение адгезии исследуемых штаммов к фибронектину под влиянием температуры, ультрафиолетового облучения, трипсина, хлорамфеникола и маннозы свидетельствует о роли белковых и маннозо-зависимых структур, которые могут связываться не только с фибронектином, но и с углеводами. Выявлена зависимость адгезивной способности коринебактерий к вагинальным эпителиоцитам от микроэкологического состояния биотопа. В условиях нормоценоза встречаются низкоадгезивные, среднеадгезивные и высокоадгезивные штаммы. Микроэкологические нарушения характеризуются преобладанием низко- и среднеадгезивных штаммов коринебактерий, при отсутствии высокоадгезивных.
Впервые показана роль фибронектина в адгезии бактерий к вагинальным эпителиоцитам. Фибронектин повышает адгезивную способность коринебактерий в вагинальным эпителиоцитам.
Биологические свойства коринебактерий, определяющие их взаимодействие с доминантными микроорганизмами
Суммируя описанные результаты, следует отметить, что реализация окислительного механизма антагонизма зависит от выраженности продукции перекиси и выраженности ингибиторов каталазы и чаще проявляется у коринебактерий с высокими ингибиторами каталазы и у лактобацилл со средними значениями продукции перекиси. В реализации окислительного механизма принимают участие штаммы коринебактерий относящиеся к видам C. minutissimum, C. vitarumen, C. striatum. Явление потенцирования антагонизма лактобацилл коринебактериями по отношению к аллохтоннным микроорганизмам проявляется как в условиях нормо-, так и патоценоза.
Вероятно, такой тип межбактериальных отношения является платформой для формирования стабильного микробного сообщества в вагинальном биотопе и направлен на поддержание колонизационной резистентности репродуктивного тракта женщин.
Явление бактериального антагонизма широко распространено и лежит в основе формирования микробных биоценозов во всех открытых полостях, на поверхности тела человека [4], не исключением является и женский репродуктивный тракт. Бактериальный антагонизм является основополагающим фактором, обусловливающим колонизационную резистентность.
В вагинальном биотопе коринебактерии находятся в тесном взаимоотношении, как с представителями резидентной микрофлоры, так и с условно-патогенными микроорганизмами, населяющими различные биотопы тела человека, и играют неотъемлемую роль в формировании микробиоценозов. Результирующей этих взаимодействия может явиться формирование нормо- или патоценозов.
Ранее была показана роль коринебактерий в поддержании гомеостаза вагинального микробиоценоза за счет потенцирования антагонистической активности пероксидпродуцирующих лактобацилл. Однако опираясь на полученные данные невозможно в полной мере оценить роль коринебактерий в поддержании и функционировании ассоциативного симбиоза репродуктивного тракта женщин.
Открытым остается вопрос о взаимодействии коринебактерий с другими членами вагинального сообщества. Литературные данные о влиянии коринебактерий на условно-патогенные микроорганизмы в вагинальном биотопе весьма противоречивы [20, 21, 33].
Таким образом, изучение биологических свойств коринебактерий через призму взаимодействия с ассоциативными микроорганизмами, вероятно, позволит расширить представление о роли данных микроорганизмов в вагинальном микробиоценозе и оценить их вклад в поддержании колонизационной резистентности репродуктивного тракта женщин.
В связи с этим, целью нашего исследования явилось изучение влияния экзометаболитов коринебактерий на биологические свойства представителей условно-патогенной микрофлоры. В качестве тест-культуры были выбраны E. coli и S. aureus (коллекция ИКВС УРО РАН).
В результате проведенных исследований установлено, что экзометаболиты коринебактерий оказывали разнонаправленное влияние на биологические свойства условно-патогенных бактерий.
Большинство исследуемых культур коринебактерий - 70% независимо от микроэкологического состояния биотопа, при котором были выделены, подавляли прирост биомассы S. aureus. В отношении E. coli подобного эффекта замечено не было. Напротив, 60% штаммов оказывали стимулирующее, а 40% индифферентное действие на прирост биомассы E. coli (Рисунок 14).
Выраженность антагонистической активности коринебактерий по отношению к S. aureus зависела от состояния биоценоза, при котором были выделены исследуемые микроорганизмы.
Коринебактерии, выделенные у здоровых женщин, подавляли прирост S. aureus в среднем на 13,1±1,1%, штаммы, выделенные при микроэкологических нарушениях на 16,4±2,2% (р 0,05). Важно, что при микроэкологических нарушениях не только расширялся видовой состав коринебактерий, но и появлялись штаммы с выраженной антагонистической активностью. Наряду с тем, что у доминирующих видов С. minutissimum и С. amycolatum, выделенных при микроэкологических нарушениях антагонистическая активность возрастала с 11,6±2,9% до 16,9±2,2% и с 12,05±1,6% до 19,5±6,6% (р 0,05) соответственно, отдельные штаммы проявляли высокую антагонистическую активность по сравнению со средними значениями в группе. Полученные результаты представлены в Таблице 10.
Таким образом, вне зависимости от микроэкологического состояния биоценоза коринебактерии оказывали дифференцированное влияние на прирост биомассы Е. coli и S. aureus. В отношении Е. coli влияние экзометаболитов коринебактерий на прирост биомассы было стимулирующим или индифферентным, в отношении S. aureus преимущественно подавляющим. Антагонистическая активность коринебактерий выделенных при микроэкологических нарушениях по отношению к S. aureus была достоверно выше по сравнению со штаммами, выделенными от здоровых пациенток. При этом возрастание антагонистической активности прослеживалось как у единичных видов коринебактерий, так и у доминирующих. Полученные результаты согласуются с литературными данными. Ранее было показано, что антагонистическая активность коринебактерий подвержена регуляции со стороны других условно-патогенных микроорганизмов [27].