Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1 История открытия и изучения псевдотуберкулеза 16
1.2 Цитотоксической некротизирующий фактор Y. pseudotuberculosis 35
Глава 2. Материалы и методы исследования 45
2.1 Материалы исследования 45
2.2 Методы исследования 53
2.2.1 Бактериологические методы 53
2.2.2 Молекулярно-генетические методы 54
2.2.3 Биохимические методы 58
2.2.4 Биологические методы 59
2.2.5 Статистические методы 60
Глава 3. Результаты исследования 62
3.1 Характеристика штаммов Y. pseudotuberculosis 62
3.2 Генотипирование исследованных штаммов Y. pseudotuberculosis по системе MLST-типирования 65
3.3 Характеристика генов факторов патогенности Y. pseudotuberculosis 70
3.4 Молекулярно-генетическая характеристика штаммов Y. pseudotuberculosis 75
3.5 Выявление и характеристика гена cnfY в штаммах Y. pseudotuberculosis 79
3.6 Клонирование полноразмерного гена cnfY и выделение CNFY 84
3.7 Изучение биологических свойств CNFY на моделях эукариотических клеток 87
Глава 4. Заключение 93
Выводы 99
Список литературы 100
- История открытия и изучения псевдотуберкулеза
- Цитотоксической некротизирующий фактор Y. pseudotuberculosis
- Генотипирование исследованных штаммов Y. pseudotuberculosis по системе MLST-типирования
- Изучение биологических свойств CNFY на моделях эукариотических клеток
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Псевдотуберкулез – острое инфекционное заболевание, вызванное
грамотрицательными бактериями Yersinia pseudotuberculosis относящихся к роду
Yersinia семейства Enterobacteriaceae. Бактерии уникальны по многим
показателям, их отличает разнообразие биологических свойств и факторов
патогенности [Панин и соавт., 2013; Atkinson S. and Williams P., 2016; et al., 2017]. Род включает в себя 17 видов, среди которых патогенными для
человека являются три: Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica. Согласно
санитарным правилам СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с
микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», утвержденным главным государственным санитарным врачом РФ № 4 от 28 января 2008 года, с изменениями, внесенными возбудитель псевдотуберкулеза относится к III группе патогенных бактерий. В 90-х годах XX столетия было выдвинуто предположение, что несколько десятков тысяч лет назад Y. pseudotuberculosis стал прародителем нового высоковирулентного эпидемического клона Y. pestis, который вызывает особо опасное заболевание – чуму [Achtman M. et al., 1999].
В настоящее время псевдотуберкулез регистрируется в крупных городах разных стран, в частности, во Франции et al., 2016], Новой Зеландии [Williamson D.A. et al., 2017], Японии J. and K., 2016]. В Российской Федерации по данным Роспотребнадзора в последние годы наблюдается снижение заболеваемости псевдотуберкулезом, которое возможно обусловлено как изменившимися социальными факторами, так и неэффективной диагностикой инфекции.
В 1950-60х годах на Дальнем Востоке РФ возникли вспышки неизвестного ранее заболевания с особым клинико-эпидемическим проявлением в виде дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки (ДСЛ). После установления этиологии этой болезни [Грунин И.И. и соавт., 1960] началось активное изучение его возбудителя – Y. pseudotuberculosis, и его роли в эпидемическом процессе.
Основными свойствами Y. pseudotuberculosis, связанными с патогенностью,
на начальном этапе инфекционного процесса, являются адгезивность,
инвазивность и токсигенность, которые реализуются уже в первые минуты
попадания возбудителя в организм [Тимченко Н.Ф., 2004; et al., 2016;
et al., 2017]. Токсигенность бактерий псевдотуберкулеза обусловлена
продукцией нескольких токсинов, кодируемых генами хромосомы и плазмидой
вирулентности (plasmid Yesinia Virulence – pYV): термостабильного летального
токсина (ТСТ), термолабильного летального токсина (ТЛТ), внешнего
мембранного белка III системы секреции (Yersinia outer protein – YopE),
суперантигена (Y. pseudotuberculosis mitogen – YPM), факторов, нарушающих
проницаемость сосудов и цитотоксического некротизирующего фактора
(cytotoxic necrotizing factor Y. pseudotuberculosis – CNFY). [Пашин А.Ю. и соавт.,1984; Тимченко Н.Ф., 2006; Недашковская Е.П. и соавт., 1995; Разник С.Д., 1999; Rosquist R. et al., 1991; Carnoy C. et al., 2000; Lockman H.A. et al.,2002; et al., 2016; et al., 2017; et al., 2017].
В 2002 году впервые было опубликовано сообщение о том, что штаммы Y. pseudotuberculosis продуцируют CNFY [Lockman Н.А. et al., 2002]. Авторами была зарегистрирована в базе данных GenBank нуклеотидная последовательность гена cnfY штамма Y. pseudotuberculosis YPIII (AF324349), использованного в исследовании. Последующие работы [Hoffmann C. еt al., 2004; Blumenthal B. et al., 2007; et al., 2013], опубликованные в литературе до сегодняшнего дня, раскрыли особенности структуры молекулы гена cnfY штамма YPIII, кодирующего токсин CNFY.
Как известно, CNFY принадлежит к уникальной группе
высокомолекулярных цитотоксинов молекулярной массой около 115 кДа [Blumenthal B. еt al. 2007]. Ген, кодирующий белок CNFY, является участком геномной ДНК бактерий псевдотуберкулеза [Blum G. et al., 1995; Knust Z. and Schmidt G., 2010]. Основное действие цитотоксина направленно на Rho белки эукариотических клеток – подсемейство небольших ГТФ-связывающих протеинов, регуляторов актинового цитоскелета [Oswald E. et al., 1994; Aktories
K., 1997]. После проникновения CNFY в клетку и отщепления его Rho-модифицирующего домена (С-конца) происходит дезаминирование остатка глутамина в позиции 63 с образованием глутаминовой кислоты. Подобное изменение аминокислоты вызывает образование доминирующего активного Rho белка, не способного гидролизовать ГТФ. В дальнейшем такое изменение в аминокислотной последовательности приводит к активации Rho ГТФ-аз и репликации клеточной ДНК без сопутствующего клеточного деления, что дает эффект «многоядерности» [Knust Z., Schmidt G., 2010]. Многоядерная клетка (multinucleate cell) – это клетка, содержащая более одного ядра и образующаяся в результате митоза (или серии митозов), который не сопровождается цитотомией (образованием дочерних клеток) [Арефьев В.А., Лисовенко Л.А., 1995].
При изучении биологического действия CNFY in vivo было выявлено, что токсин вызывал длительное воспаление и образование некротического очага при внутрикожном его введение [Caprioli A. et al., 1983]. Кроме того, в процессе развития инфекции, вызванной Y. рseudotuberсulosis, у мышей линии BALB/c цитотоксин способствовал распространению возбудителя в органах и тканях [Mou S. et al., 2012; et al., 2013].
К моменту планирования темы диссертационной работы не было данных о наличии гена cnfY в штаммах Y. pseudotuberculosis, циркулирующих на территории РФ и вызывающих дальневосточную скарлатиноподобную лихорадку (ДСЛ), а также о его роли в развитии этого заболевания.
Степень разработанности темы исследования
Результаты исследований, полученные ранее сотрудниками НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова совместно с сотрудниками ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, показали, что клинико-эпидемическое проявление псевдотуберкулеза в виде ДСЛ связано с конкретной группой штаммов Y. pseudotuberculosis, принадлежащих к серотипам О1b и O3, определенным мультилокусным сиквенс типам (multilocus sequence typing – MLST) – ST2, ST26, ST32 сиквенс типы и характеризующихся аллелями генов факторов патогенности с инвазивной и токсической функциями (ген inv,
кодирующий инвазин – аллель 1, ген yadA, кодирующий фактор адгезии YadA – аллель 1, ген yopE, кодирующий белок YopE III системы секреции – аллель 1), наличием плазмиды вирулентности pYV, а также у значительной части штаммов имеется дополнительная плазмида Y. pseudotuberculosis молекулярной массой 82 MДa – pVM82 [Сомов ГП. и соавт., 1985; Шубин Ф.Н. и соавт., 1985,1993; Гинцбург А.Л. и соавт., 1988; Адгамов Р.Р. и соавт., 2010; Ермолаева С.А. и соавт., 2010; Тimchenko N.F. et al., 2010, 2013].
К началу наших исследований нами было опубликовано несколько работ по
изучению CNFY [Персиянова Е.В. и соавт., 2013; Timchenko N.F. et al., 2012]. При
анализе последовательности гена cnfY у большинства штаммов
Y. рseudotuberculosis, изолированных от больных псевдотуберкулезом/ДСЛ людей, грызунов и из объектов внешней среды на Дальнем Востоке, Сибири и Северо-западной части РФ, была выявлена делеция фрагмента, кодирующего функциональный Rho-домен, размером 946 п.н., а также обнаружена делеция во втором домене cnfY гена, размером 300 п.н. [Timchenko N.F. et al., 2012].
С помощью ионно-обменной хроматографии на колонке с DEAE-целлюлозой и высокоэффективной гельфильтрации на колонке Superose 6 был выделен белок из штамма Y. pseudotuberculosis 2517, серовар O3 (Pasteur Institute of Epidemiology and Microbiology, Франция). В результате исследования методом масс-спектрометрии выделенный белок был идентифицирован как CNF Y. pseudotuberculosis молекулярной массой 114479 дальтон [Персиянова Е.В. и соавт., 2013].
Цель исследования – установить особенности структуры молекулы гена
цитотоксического некротизирующего фактора (cnfY) в штаммах
Y. pseudotuberculosis, изолированных на территории Российской Федерации из разных источников для определения их положения в филогенетической структуре вида, а также оптимизации системы идентификации возбудителя.
Задачи исследования:
-
Охарактеризовать штаммы Y. pseudotuberculosis, выделенные в РФ от людей с диагнозом псевдотуберкулез/ДСЛ, грызунов и из объектов окружающей среды по схеме MLST сиквенс типирования и аллелям генов факторов патогенности.
-
Установить наличие гена cnfY в штаммах Y. pseudotuberculosis, изолированных из разных объектов и принадлежащих к различным сиквенс типам (ST) в РФ.
-
Представить структурную характеристику аллелей гена cnfY в штаммах Y. pseudotuberculosis.
-
Клонировать полноразмерный ген cnfY и получить штамм-продуцент токсина CNFY.
-
Выделить продукт клонированного гена cnfY и изучить его действие на моделях эукариотических клеток.
Научная новизна
Впервые во всех исследованных 104 штаммах Y. pseudotuberculosis, выделенных на территории РФ из разных источников, обнаружен ген cnfY.
Впервые показано, что на территории РФ циркулируют штаммы Y. pseudotuberculosis, несущие аллели 1 и 2 гена cnfY. Большинство изолятов (99,04 %) имели 1-й аллель гена cnfY, содержащий делеции, охарактеризованные в ходе исследования. Полноразмерный ген cnfY – аллель 2 – обнаружен у 0,96 % штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных в Приморском крае РФ. Впервые показана корреляция между аллелем cnfY и принадлежностью штамма к группе возбудителя ДСЛ – клинико-эпидемического проявления псевдотуберкулеза.
Впервые идентифицирован ранее не описанный сиквенс тип ST240, зарегистрированный в международной базе данных по типированию Y. pseudotuberculosis (The University of Warwick).
Впервые, из штамма Y. pseudotuberculosis, выделенного из объекта окружающей среды на Дальнем Востоке РФ в результате клонирования
экспрессирующего гена cnfY получен в очищенном виде токсин CNFY, вызывающий эффект многоядерности эукариотических клеток Hep-2 и Vero E6.
Теоретическая и практическая значимость
Теоретическая значимость работы заключается в определении положения отечественных штаммов Y. pseudotuberculosis в филогенетической структуре вида и установлении ранее не описанного нового сиквенс типа возбудителя ДСЛ.
Результаты являются новыми и вносят вклад в понимание молекулярно-
генетических механизмов патогенности возбудителя псевдотуберкулеза,
территориальных и эпидемиологических особенностей распространения штаммов
иерсиний данного вида.
Практическая значимость работы определяется разработанной на основе метода ПЦР новой системы детекции Y. pseudotuberculosis, позволяющей параллельно выявлять и дифференцировать бактерии в биологическом материале по наличию гена cnfY «Набор видоспецифичных олигонуклеотидных праймеров для детекции Yersinia pseudotuberculosis методом полимеразной цепной реакции» (получен положительный результат формальной экспертизы заявки на изобретение № 2017118812/10(032532) от 29.05.2017).
В рамках изучения эпидемиологических особенностей псевдотуберкулезной и иерсиниозной инфекций на Дальневосточной опорной базе Федерального референс-центра по мониторингу за иерсиниозами было внедрено использование набора видоспецифичных олигонуклеотидных праймеров для детекции Yersinia pseudotuberculosis. А также используются полученные данные молекулярно-генетической характеристики штаммов Y. pseudotuberculosis, зарегистрированных нами в базе данных The University of Warwick.
В базу данных GenBank размешены 10 нуклеотидных последовательностей генов вирулентности инвазина (inv), адгезина (yadA) и мембранного белка YopE (yopE) (KR053609, KR028003-KR028009) а также информация об аллелях гена cnfY (KR028010, KR028011). В базу данных MLST The University of Warwick ) размещена информация о
104 изолятов Y. pseudotuberculosis, выделенные на территории РФ и принадлежащих к восьми сиквенс типам. – Международный уровень внедрения.
Методология и методы исследования
Методологией исследования является экспериментальная работа по анализу
гена cnfY с использованием бактериологических, биохимических, молекулярно-
генетических и биологических методов. Данные обрабатывали с помощью
компьютерного и статистического анализа, основанного на методах
биоинформатики в области экспериментальной молекулярной биологии и генетики, с применением программ Microsoft Excel 2007, Chromas, ClustalХ 2.0.12 и MEGA 5.0. Эксперименты проводили в двух повторах каждый и усредняли данные не менее чем 5 экспериментов по трем разведениям для каждой точки (30 измерений для каждой точки).
Основные положения, выносимые на защиту
-
Все исследованные штаммы Y. pseudotuberculosis, в том числе штаммы вызывающие ДСЛ, содержат последовательность гена cnfY, что позволяет использовать его в качестве маркера для выявления Y. pseudotuberculosis в биологическом материале.
-
Штаммы, ассоциированные с ДСЛ, несут специфический аллель cnfY, характеризующийся двумя делециями и наличием стоп-кодона.
-
Геномная ДНК штаммов Y. pseudotuberculosis, циркулирующих на территории РФ, включает в себя экспрессирующий ген cnfY, способный продуцировать функциональный токсин CNFY, оказывающий цитотоксическое действие на эукариотические клетки. Личный вклад автора состоит в самостоятельном проведении всех
молекулярно-генетических исследований, которые выполнялись на базе
лаборатории экологии возбудителей инфекций ФГБУ «НИЦЭМ им.
Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, под руководством заведующей лабораторией д.б.н. С.А. Ермолаевой, депонировании данных по MLST сиквенс типированию и последовательностей аллелей исследованных генов в международные базы данных (GenBank, The University of Warwick), обобщении, анализе и
статистической обработке полученных данных, подготовке и написанию публикаций, в том числе в англоязычной литературе.
Апробация работы
Результаты работы были доложены на 4 зарубежных конференциях и 10
Российских конференциях с международным участием: «The 11th international
symposium on Yersinia» (Yersinia 11),Suzhou - China, 2013; «10th International
Meeting on Microbial Epidemiological Markers» (IMMEM-10), Paris – France, 2013;
«6th Congress of European Microbiologists (FEMS), Netherlands – Maastricht, 2015;
«12th International Yersinia Symposium», Georgia – Tbilisi, 2016; «Биология – наука
XXI века, 17-я Международная Пущинская школа-конференция молодых
ученых», г. Пущино, 2013; VIII Всероссийская научно-практическая конференция
с международным участием «Молекулярная диагностика - 2014», г. Москва, 2014;
Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «От
эпидемиологии к диагностике актуальных инфекций: подходы, традиции,
инновации», г. Санкт-Петербург, 2014; «Молодёжная наука, инновации и
прогресс здравоохранения - 2015» в рамках VI Дальневосточного творческого
фестиваля студентов и молодёжи медицинских вузов с международным участием
«Во имя жизни…» г. Владивосток, 2015; II-ая Всероссийская школа-конференция
молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и
биотехнологии» на платформе Пермского научного форума, г. Пермь, 2015; XVII
Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с
международным участием: «Актуальные проблемы экспериментальной,
профилактической и клинической медицины», г. Владивосток, 2016; XIII
Тихоокеанский медицинский конгресс с международным участием,
г. Владивосток, 2016; IX Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика - 2017», г. Москва, 2017; IX Ежегодный Всероссийский Конгресс по инфекционным болезням с международным участием, г. Москва, 2017; Научно-практическая конференция «Фундаментальная наука – медицине», посвященная 100-летию со дня рождения академика Г.П.Сомова, г. Владивосток, 2017.
В завершенном виде работа была апробирована и рекомендована к защите на заседании Ученого совета НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова «01» февраля 2018 года.
Публикации
Полученные результаты исследования представлены в 16 научных работах, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 статья в зарубежном журнале, индексируемом в WoS и SCOPUS.
Объем и структура диссертации
История открытия и изучения псевдотуберкулеза
Псевдотуберкулез – острое инфекционное заболевание, вызванное микроорганизмом Yersinia pseudotuberculosis. Род Yersinia согласно справочнику D. Bergey по бактериологической систематике [Bergey s Manual of Systematic Bacteriology 1985], принадлежит к семейству Enterobacteriaceae и состоит из 17 видов бактерий. Три вида Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica являются патогенными для человека и животных. Род был выделен в 1944 году J. van Loghem [van Loghem J. J. 1944] и назван в честь швейцарского бактериолога А. Yersin, открывшего Yersinia pestis — возбудителя чумы. Виды Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica относятся к энтеропатогенным с фекально оральным механизмом передачи бактерий. Согласно санитарным правилам СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», утвержденных главным государственным санитарным врачом РФ № 4 от 28 января 2008 года, с изменениями, внесенными 29 июня 2011 года № 86, возбудитель псевдотуберкулеза относится к III группе патогенных бактерий.
В 1883 году французские ученые L. Malasses и W. Vignal обнаружили Y. psеudotuberculosis в органах морской свинки, зараженной клетками из лимфатического узла умершего ребенка, от туберкулезного менингита [Malasses L. and Vignal W., 1883].
Долгое время считалось, что псевдотуберкулез представляет собой зоонозную инфекцию [Кузнецов В.Г. и соавт., 1975; 1976], которая передается оральным путем, а употребление свежих овощей часто является причиной инфекции. В настоящее время известно, что бактерии поражают 210 видов млекопитающих (в основном грызуны), 17 видов птиц, 5 видов пресмыкающихся, 1 вида земноводных, 7 видов рыб и около 50 видов членистоногих [Ющенко Г.В., 1998; Шестакова И.В., 2009; Честнокова М.В. и соавт., 2010; Ценева Г.Я. и соавт., 2014].
Инфицирование человека бактериями Y. pseudotuberculosis происходит фекально-оральным механизмом передачи посредством употребления в пищу продуктов питания растительного происхождения, в сыром или недостаточно термически обработанном виде. Поэтому микроорганизмы используют резервы растений для размножения и поддержания жизнедеятельности, с сохранением своей вирулентности и численности популяции во внешней среде [Ющенко Г.В. 1986; 1998; Тимченко Н.Ф. и соавт., 2000; Шурыгина, И.А. и соавт., 2003; Сомов ГП. и соавт., 2004; Махнев М.В. , 2006; Персиянова Е.В. и соавт., 2008; Joutsen S. et al., 2017; Kim D. et al., 2017]. Также в литературе имеются сообщения о выделении разных видов иерсиний из морской воды и морских гидробионтов [Кузнецов В.Г., 1980; Тимченко Н.Ф. и соавт., 1994; Пушкарева В.И. и соавт., 1998; Timchenko N.F. et al., 1994; Dolmatova L.S. et al., 2002; Falcao D.P et al., 2003]. В связи с вышеизложенным, согласно современному представлению по основному экологическому признаку – резервуару возбудителя, Y. pseudotuberculosis является возбудителем сапронозов [Сомов Г.П., 1985]. Это болезни, вызываемые микроорганизмами, резервуаром которых является внешняя среда [Беляков В.Д. и соавт., 1987;Литвин В.Ю. и соавт., 2010; Адгамов Р.Р. и соавт., 2012; Тимченко Н.Ф. и Попов А.Ф., 2014; Fratini F. et al., 2017].
Частота заболевания псевдотуберкулеза носит сезонный характер. Заболеваемость увеличивается в зимний период, пики в апреле-мае и заканчивается в июне-июле. В России это конкретное внутригодовое распределение может быть связано с местным урожаем овощей в Северной и Восточной России для долгосрочного хранения в зимний период и поставки ранних овощей из теплых южных провинций в мае-июне. В северных российских овощехранилищ, исследование показало, что 1,6% -2,4% овощей были заражены Y. pseudotuberculosis в декабре и 16,3% -28,3% в апреле-июне. Поставка зараженных овощей на централизованные кухне или ресторанного хозяйства привело к вспышкам, в то время как распределение с помощью продовольственных рынков привело к спорадическим случаям.
Термин «псевдотуберкулез», который сохранился до настоящего времени, был введен в 1885 году для обозначения заболевания у животных, в органах которых наблюдали «бугорки», сходные с туберкулезными гранулемами [Eberth C., 1885]. Тогда впервые были изучены гистологически структура «бугорков» в органах морских свинок, зараженных Y. pseudotuberculosis. В 1889 году были детально изучены биологические свойства бактерий псевдотуберкулеза [Pfeiffer A., 1889]. При этом выявлена связь этих бактерий с патологией у грызунов. Автор дал им название Bacterium pseudotuberculosis rodentium. В последующем, многочисленные исследователи, в основном специалисты из области ветеринарии, выделяли микроорганизмы из органов больных животных, в результате чего постепенно стало складываться представления об определенной патологии животных, вызываемой этим микробом.
Выявление первых случаев псевдотуберкулеза у людей стало результатом случайных находок. До XX века были описаны лишь единичные наблюдения тяжелых септических заболеваний, которые диагностировались посмертно при бактериологическом исследовании трупного материала. В 1902 году после смерти, которой предшествовало тяжелое септическое заболевание, в органах двухлетнего ребенка при вскрытии были обнаружены многочисленные серовато белые узелки. Бактериологическое исследование этих образований показало наличие Y. pseudotuberculosis [Wrede B., 1902]. Позже в Австралии при посеве материала с поверхности слизистой оболочки подвздошной кишки, лимфатических узлов брыжейки у оперированного 15-летнего ребенка с типичной картиной острого аппендицита, был выделен возбудитель псевдотуберкулеза. Так впервые было опубликовано сообщение об инфекционном заболевании, имеющее отношение к хирургической патологии [Albrecht H., 1910]. В 1952 году проанализировав имеющуюся к тому времени литературу по псевдотуберкулезу, был составлен обзор о 15 случаях заболеваний у людей, из них 13 характеризовались тяжелым септическим течением и закончились летальный исходом [Mair N.S., 1965].
К тому моменту появились данные о выделении Y. pseudotuberculosis от больных людей в России. В 1911 году Юркевич Д.А. опубликовал сведения о восьми больных псевдотуберкулезом людей, четверо из которых были детьми [Юркевич Д.А., 1911]. Позже, в 1958 году В.М. Туманским было вявлено, что инфекционное заболевание, вызванное Y. pseudotuberculosis, встречается редко и не имеет особую симптоматику. Среди описанных, в то время, в мировой литературе тридцати случаев инфекции, двенадцать характеризовались тяжелой септической формой и в большинстве случаев со смертельным исходом [Туманский В.М., 1958]. Поэтому до середины 50-х годов XX века псевдотуберкулез у человека встречался очень редко и характеризовался неясной клинической картиной с тяжелым течением и почти всегда заканчивался смертью больных. В связи с чем возбудитель заболевания выявляли при бактериологическом исследовании трупного материала [Сомов Г.П. и соавт., 2001]. Представление о заболевании, которое вызывает микроб Y. pseudotuberculosis в организме человека, изменилось во второй половине прошлого столетия. Тогда из обширной группы мезентериальных лимфаденитов был выделен абсцедирующий ретикулоцитарный лимфаденит, схожий с острым аппендицитом, этиологическим агентом которого был Y. pseudotuberculosis [Masshoff W. and Dolle W., 1953; Knapp W., 1968]. По итогам собранных материалов, обобщенных к тому времени, ведущие специалисты по иерсиниозам пришли к выводу, что установлена нозологическая форма псевдотуберкулезного мезентериального аденита [Mollaret Н., 1962]. Однако, это представление не в полной мере соответствовало действительности и привлекло внимание клиницистов и микробиологов к инфекции, которую начали выявлять значительно чаще. Таким образом, в Париже в начале 60-х годов, для активизации работы в этой проблеме, был организован Всемирный исследовательский центр по изучению иерсиниозов. В 1968 году профессор Н. Моllaret представил доклад о выявлении в Европейских странах более 400 случаев псевдотуберкулезного мезаденита [Mollaret Н., 1967]. На тот момент времени, в СССР, эта форма заболевания была описана в ряде единичных случаев [Ющенко Г.В., 1986].
В марте 1959 года во Владивостоке произошла крупная вспышка неизвестной инфекционной болезни, охватившая более 300 человек в течение 3— 5 дней. Заболевание у большинства из них протекало тяжело. В начале болезни были ярко выражены характерные для скарлатины симптомы: мелкоточечная сыпь на гиперемированном фоне кожи, ангина, бледность носогубного треугольника, увеличение подчелюстных лимфатических узлов, «малиновый» кончик языка (Рисунок 1).
Цитотоксической некротизирующий фактор Y. pseudotuberculosis
Цитотоксический некротизирующий фактор – CNF (cytotoxic necrotizing factor) принадлежит к уникальной группе высокомолекулярных цитотоксинов. Представителями семейства CNFs являются CNF 1, CNF 2, CNF 3 Escherichia coli и CNFY, продуцируемый Y. pseudotuberсulosis.
Первым в 1983 году был выделен CNF 1 E. coli [Caprioli A. et al., 1983]. Далее у штаммов кишечной палочки были обнаружены CNF 2 и CNF 3 [Oswaid E. et al. 1994; Orden J.A et al., 2007]. При изучении генов, кодирующих цитотоксины E. coli, было установлено, что последовательности генов cnfE 1 и cnfE 3 входят в состав геномной ДНК E. coli, а ген cnfE 2 является частью плазмиды этих бактерий. При сравнении их последовательностей стало известно, что гены cnfE 2 и cnfE 3 идентичны cnfE 1 на 85% и 70%, соответственно.
Последующие исследования по изучению семейства цитотоксинов проводили в основном на изучении токсина СNF 1 Е. coli. Группа бактериальных СNFs токсинов относится Rho модифицирующим, субсемейству малых ГTФ связывающих белков, кторые участвуют в изменении регуляторов цитоскелета актина [Aktories К., 1997]. Белок СNF 1 синтезируется в виде гидрфильного полипептида молекулярной массой около 115 кДа [Mills M. et al., 2000; Blumenthal B. et al., 2007], структура на полярных концах аминокислотной последовательности пептида состоит из двух доменов [Lemichez E. et al., 1997].
Взаимодействие токсина с мишенью клетки происходит в N-терминальном домене, схожего по аминокислотному составу с мощным митогеном, продуцируемый Pasteurella multocida, который вызывает у свиней развитие прогрессирующего атрофического ринита [Falbo V. et al., 1993, Lemichez E. et al., 1997]. С-терминальный конец является ферментативным доменом CNF 1 токсина, который, возможно, является активным центром токсина. Домен представляет собой участок длиной около 100 аминокислот, гомологичный дермонекротическому токсину (DNT). Ген токсина СNF 1 Е. coli кодируется на хромосоме и входит в состав последовательности «островка патогенности» HPI [Blum G. et al., 1995]. На основании полученных данных, немецкие ученые Z. Knust и G. Schmidt в 2010 году описали механизм проникновения CNF 1 E. coli в эукариотические клетки (Рисунок 4) [Knust Z. and Schmidt G., 2010].
Мишенью цитотоксина является Rho подсемейство небольших ГТФ связывающих белков, которые являются регуляторами актинового цитоскелета [Aktories K., 1997; Oswald E. et al., 1994]. После проникновения в клетку и отщепления Rho-модифицирующего домена (С-конца) происходит дезаминирование остатка глутамина в позиции 63 с образованием глутаминовой кислоты. Подобное изменение аминокислоты вызывает образование доминирующего активного Rho белка, не способного гидролизовать ГТФ [Knust Z. and Schmidt G., 2010]. В дальнейшем такое изменение в аминокислотной последовательности приводит к активации Rho ГТФ-аз и репликации клеточной ДНК без сопутствующего клеточного деления – образованию эффекта «многоядерности» (Рисунок 5).
Многоядерная клетка (multinucleate cell) – это клетка, содержащая более одного ядра и образующаяся в результате митоза (или серии митозов), который не сопровождается цитотомией (образованием дочерних клеток) [Арефьев В.А., Лисовенко Л.А., 1995].
При изучении биологического действия CNF1 in vivo установлено, что этот токсин вызывает некроз кожи у кроликов после внутрикожной инъекции и персистирующее воспаление у мышей [Caprioli A. et al., 1983]. Таким образом, к концу ХХ века сложилось представление о семействе CNFs, которое включало в себя 3 типа токсинов, продуцируемых E. coli. Эпидемиологические данные подтверждали значение CNF1 как фактора вирулентности при внекишечных инфекциях у человека, однако, прямые доказательства роли этого токсина в развитии заболеваний оставались неизвестными. З
В 2002 году впервые было опубликовано сообщение о том, что Y. pseudotuberculosis продуцирует токсин, биологическая активность которого в культуре клеток Hep-2 была сходна с действием CNF 1 E. сoli [Lockman H. A. et al., 2002]. Всего в работе исследовали: 33 штамма Y. psudotuberculosis серотипов IA, IB, II, III и V; 9 штаммов Y. enterocolitica серотипов О3; О4,32; О5,27; О6; О8; О9; О20; О21 и О27; 3 штамма Y. bercovieri; 4 штамма Y. frederiksenii; 3 штамма Y. intermedi;, 3 штамма Y. kristensenii; 2 штамма Y. mollaretii и 1 штамм Y. rohdei. Среди исследованных 58 штаммов многоядерность в клетках Hep-2 вызывали 2 штамма Y. pseudotuberculosis III серотипа – YPIII и IP2666c. При удалении плазмиды вирулетности у штамма YPIII (YPIIIс) действие токсина на клетки Hep-2 сохранялось и не подавлялось антителами, способными нейтрализовать CNF 1 E. сoli. Остальные исследованные штаммы Y. pseudotuberсulosis, в том числе III серотипа, имели делеции внутри гена cnfY и не проявляли биологическую активность при воздействии на культуру клеток. Установлено, что нуклеотидная последовательность гена cnf Y. pseudotuberculosis была на 65,1% идентична с геном cnf E. сoli.
Кроме того, авторами было предложено использование сокращений: CNFY – токсин (белок), продуцируемый Y. pseudotuberсulosis и cnfY – ген, кодирующий токсин бактерий псевдотуберкулеза. Праймеры для данного исследования сконструированы из последовательностей гена cnf E.coli [Falbo V. et al., 1993] и области генома Y. pestis, кодирующей ген идентичный cnf E.coli [Parkhill J. et al., 2001]. Авторы [Lockman H. A. et al., 2002] сравнили нуклеотидную последовательность выявленного гена cnfY у штамма YPIII с последовательностью гена cnf штамма СО92 Y. pestis, которые оказались идентичными более чем на 99% (Рисунок 6). Однако у гена cnf Y. pestis была выявлена делеция размером 931 п.н.
Нуклеотидная последовательность гена cnfY штамма YPIII зарегистрирована в базе данных GenBank (AF324349). Последующие исследования разных авторов раскрыли особенности структуры молекулы гена cnfY, которые способствуют продукции токсина CNFY у штамма YPIII. Рисунок 6 – Сравнение нуклеотидных последовательностей гена cnf штаммов YPIII Y. pseudotuberculosis и CO92 Y. pestis [Lockman H. A. et al., 2002].
В 2004 году ген cnfY амплифицировали из геномной ДНК Y. pseudotuberсulosis, клонировали и выделили рекомбинантый токсин, влияние которого было исследовано на ГТФ-связывающих белках: RhoA, Rac1, и Cdc42 в интактных клетках [Hoffmann C. еt al., 2004]. Результаты показали, что CNFY вызывает активацию RhoA без сопутствующей активизации белков Rac 1 и Cdc42 и индуцирует морфологические изменения в клетках HeLa (Рисунок 7). После 2 часов с момента введения токсина в культуре клеток наблюдалось формирование напряжения волокон, однако, не отмечено формирование филоподий или ламеллоподий, которое вызывает CNF 1 E. сoli.
Несмотря на то, что аминокислотные последовательности белков CNF 1 E. сoli и CNFY гомологичны в рецептор-связывающем домене, они связываются с различными клеточными рецепторами [Blumenthal B. et al., 2007]. Исследования на разных клеточных линиях показали, что CNFY не взаимодействует с рецепторами клеток линий Сасо-2 и СНО-К1, на которые реагирует CNF 1 E. сoli. Однако с рецепторами клеток линии HeLa, Hep-2 и НЕК 293 связывались оба токсина. Помимо этого CNFY способствует адгезии бактерий псевдотуберкулеза на клетках HeLa, и снижает восприимчивость клеток к их отслойке, индуцированной трипсином. [May M. еt al., 2012].
Генотипирование исследованных штаммов Y. pseudotuberculosis по системе MLST-типирования
Схема MLST типирования была разработана в 2011 году на основе анализа 386 изолятов Y. рseudotuberculosis из 29 стран на всех континентах, которые были разделены на 76 сиквенс типов[Laukkanen-Ninios R. et al., 2011]. Метод MLST основан на сравнении последовательностей внутренних фрагментов генов, кодирующих белки общего метаболизма. Гены белков общего метаболизма относятся к числу наиболее консервативных фрагментов генома. Обычно в схемы MLST включают семь маркерных генов, расположенных на несмежных участках бактериальной хромосомы [Воскресенская Е.А. и соавт., 2009; Адгамов Р.Р. и соавт., 2012].
Типирование изолятов Y. pseudotuberculosis в 2012 году показало, что среди 26 изолятов серовара I, выделенных от больных с диагнозом ДСЛ, 23 штамма принадлежали к сиквенс типу ST2. Большинство из этих 23 изолятов не имело установленных эпидемиологических связей: среди них были штаммы, выделенные в разные годы во Владивостоке, Якутске, Санкт-Петербурге, Кемеровской области. Оставшиеся 3 изолята I серовара были выделены на о. Сахалин и принадлежали к ST26. Изоляты III серовара принадлежали к ST32 [Адгамов Р.Р. и соавт., 2012].
Данные, полученные при вспышке в 2014 году, вызванной Yersinia spp в Новой Зеландии, позволили установить, что из 93 изолятов Y. рseudotuberculosis 87 относились к ST42. Шесть штаммов относились к следующим сиквенс-типам: ST9 (n = 2), ST14 (n = 2) и ST43 (n = 2) [Williamson D. A. et al., 2017].
В процессе работы нами на основе MLST типирования были установлены особенности молекулярно-генетической структуры штаммов Y. pseudotuberculosis. Схема MLST типирования включает анализ последовательностей внутренних областей генов, кодирующих белки общего метаболизма: adk (кодирует аденилаткиназу), argA (кодирует N-ацетилглютамат-синтазу), aroA (кодирует 3-фосфо-1-карбоксилвинилтрансферазу), glnA (кодирует глютамин синтазу), thrA (кодирует аспартокиназуI/гомосериндегидрогеназуI), tmk (кодирует тимидилат-киназу), trpE (кодирует антранилатсинтазу). При определенном наборе различных аллелей этих генов образцу присваивается сиквенс тип (ST). Всего среди исследованных штаммов Y. pseudotuberculosis было выявлено 8 сиквенс типов (Рисунок 12).
Большинство исследованных изолятов (n=79), обнаруженных на всех материковых территориях – в Приморском крае, Якутске, Анадыре, Петропавловске-Камчатском, Якутии, Новосибирске, Кемеровской области, Новом Уренгое и Санкт-Петербурге, принадлежало к ST2 сиквенс типу. Среди штаммов (n=5), выделенных как на материке, так и на острове Сахалин, был выявлен ST26 сиквенс тип, отличающийся от доминирующего ST2 сиквенс типа двумя маркерными генами (Таблица 8).
Всего среди штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных от больных людей с диагнозом псевдотуберкулез/ДСЛ, было выявлено пять сиквенс типов: ST2, ST26, ST32, ST64 и ST240 сиквенс типы. Сиквенс тип ST32(n=9) отличался от ST2 сиквенс типа по трем маркерным генам. Также выявлены штаммы Y. pseudotuberculosis, изолированные от больных, ST64 и ST240 сиквенс типы, которые отличались от доминирующего по трем маркерным генам (Таблица 8).
Сиквенс типы ST14 и ST42 Y. pseudotuberculosis, выделенные из объектов окружающей среды и от грызунов, отличались друг от друга двумя маркерными генами. Однако они отличались по четырем и трем маркерным генам от ST2 сиквенс типа этих бактерий. Сиквенс тип ST65 из этой же экологической группы отличался от ST14 и ST42 сиквенс типы четырьмя и тремя маркерными генами, соответственно, но его отличие от доминирующего ST2 было по одному гену (Таблица 8).
Cреди исследованных штаммов Y. pseudotuberculosis большинство принадлежало к ST2 сиквенс типу. Бактерии, имеющие этот сиквенс-тип, были изолированы из разных объектов: от больных людей с диагнозом псевдотуберкулез/ДСЛ (n=58), грызунов (n=10) и из окружающей среды (n=11). Впервые выявленный ST240 (n=3) и ST26 (n=5) были обнаружены только у изолятов Y. pseudotuberculosis, выделенных от больных. Всего нами выявлено 8 сиквенс типов Y. pseudotuberculosis. Сиквенс типы ST32 и ST64 были обнаружены среди штаммов, выделенных как от больных (n=8 и n=1), так и от грызунов (n=1 и n=2). Однако, некоторые изоляты Y. pseudotuberculosis, выделенные от грызунов (n=3), принадлежали только к ST42. Единичные штаммы Y. pseudotuberculosis, изолированные из объектов окружающей среды, принадлежали к ST14 (n=1) и ST65 (n=1) (Рисунок 13).
Таким образом, на основании проведенных исследований можно считать, что среди штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных от больных людей с диагнозом ДСЛ/псевдотуберкулез, грызунов и объектов окружающей среды, на территориях РФ, эндемичных по псевдотуберкулезу, за период с 1966 по 2015 год, преобладал возбудитель О1b серотипа. Кроме того, большинство штаммов бактерий псевдотуберкулеза (76%) принадлежали к одному сиквенс типу ST2, формирующему генетическую группу. Это позволяет сделать заключение о том, что клинико-эпидемическое проявление псевдотуберкулеза - ДСЛ связано с конкретной клональной группой штаммов Y. pseudotuberculosis, циркулирующих на территориях РФ.
Изучение биологических свойств CNFY на моделях эукариотических клеток
Исследования биологической активности белков семейства CNFs в основном проводились на эукариотических клетках [Caprioli A. et al., 1983; Mills M. et al., 2000; Hoffman C. et al., 2004]. Семейство относится к группе бактериальных токсинов, модифицирующих Rho — субсемейство малых ГТФ-связывающих белков, участвующих в изменении регуляторов актина цитоскелета [Aktories К., 1997]. Эукариотические клетки, подвергнутые воздействию цитотоксинов, приобретают характерный вид. У них наблюдается «рифление» мембраны и формируются сжатые актиновые нити. Репликация ДНК при отсутствии клеточного деления, приводит к образованию многоядерных клеток [Knust Z. and Schmidt G., 2010]. Цитотоксический эффект CNFY – возникновение в культуре клеток многоядерности, изучали только на клетках Hep-2 [Lockman H.A. et al., 2002; Hoffman C. et al., 2004; Blumenthal B. et al., 2007].
Биологическое действие полученного нами продукта клонированного полноразмерного гена cnfY из штамма Y. pseudotuberculosis, было сравнено с действием, описанным на моделях эукариотических клеток Hep-2, и впервые исследовано на модели клеток линии Vero E6. При сравнении действия CNFY на эукариотические клетки Hep-2 было установлено, что токсин вызывал репликацию клеточного ядра без сопутствующего клеточного деления (Рисунок 23 и 24). В результате в культуре клеток появились крупные многоядерные клетки, как и описано ранее [Lockman H.A. et al., 2002].
Ранее сообщалось о биологической активности цитотоксического некротизирующего фактора E. coli при исследовании лизатов культур этих микроорганизмов на разных линиях экураиотических клеток, в том числе и на клетках Vero [Caprioli A. et al., 1983]. Мы впервые выявили биологическое действие CNF Y.pseudotuberculosis на эукариотических клетках линии Vero E6, которое характеризовалось возникновением в культуре крупных многоядерных клеток (Рисунок 25).
К настоящему времени имеются данные о том, что бактериальные токсины семейства CNFs нарушают функцию Rho-подсемейство небольших ГТФ-связывающих белков, не вызывая непосредственной гибели клеток. Активация этих белков под действием токсинов может обусловить значительные нарушения процессов передачи сигналов, имеющих критическое значение в поддержании разнообразных функций клеток [Schmitt C.K. et al., 1999]. Подсемейство Rho — это клеточные сигнальные белки «малых» (около 21 кДа) G-белков, относящихся к суперсемейству Ras и регулирующие многие аспекты внутриклеточной динамики актина. Они обнаружены практически во всех эукариотических клетках, включая дрожжи и некоторые растения. Наиболее изучены три белка этого семейства: Cdc42, Rac1 и RhoA. Rho ГТФ-азы являются молекулярными переключателями и играют важную роль в клеточной пролиферации, апоптозе, экспрессии генов и во множестве других общих клеточных функциях. [Boureux A. et al., 2007]. Активация белков Cdc42 и Rac при действии CNF1 E. coli в клетках линии 5637 и Hep-2 выражается появлением ламеллоподий и филоподий по периметру клеток (Рисунок 26), которая, в дальнейшем, приводит к их апоптозу [Mills M. et al., 2000].
Известно, что самостоятельно токсин CNFY активирует только белки Rho A без сопутствующей активации других ГТФ-аз [Hoffman C. et al., 2004]. Как показали наши исследования, полноразмерный ген cnfY встречается редко у штаммов Y. pseudotuberculosis, среди которых преобладает возбудитель особой клональной линии, принадлежащий к сиквенс типу ST2, характеризующийся наличием определенных факторов патогенности и вызывающий ДСЛ.
Учитывая эти сведения, мы можем предложить, что экспрессия этого гена у бактерий псевдотуберкулеза может препятствовать развитию синдрома ДСЛ. Для опровержения либо подтверждения этой гипотезы было проведено исследование, в котором in vitro на культуру клеток Hep-2 одновременно действовали CNFY (продуктом клонированного полноразмерного гена сnfY штамма Y. pseudotuberculosis PV696) и бактериями псевдотуберкулеза, изолированными от больного ДСЛ (штамм Y. pseudotuberculosis Ph512). В результате в клетках наблюдалось формирование выраженных филоподий и ламеллоподий (Рисунок 27). Эти результаты свидетельствуют об активация в клетках Hep-2 других ГТФ-белков Cdc42 и Rac при воздействии СNF белка Y. pseudotuberculosis
Такие изменения в цитоскелете эукариотических клеток позволяют говорить о том, что продукция CNFY у бактерий, ассоциированных с ДСЛ, может приводить к апоптозу клеток хозяина и невозможности патогена использовать их резерв для собственной жизнедеятельности и размножения. На основании полученных данных можно предположить, что в процессе жизни бактерии псевдотуберкулеза неоднократно приобретали либо утрачивали необходимые свойства, сопутствующие изменчивости генома. Поэтому образование делеций и мутаций в гене cnfY является ярким примером изменчивости генома Y. pseudotuberculosis в процессе жизнедеятельности бактерий. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что среди штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных от больных людей с диагнозом псевдотуберкулез/ДСЛ, грызунов и из объектов окружающей среды, на территориях РФ, эндемичных по псевдотуберкулезу, за период с 1966 по 2015 года, преобладает возбудитель серотипа О1b. Большинство штаммов (60,6%) являются вирулентными (MVLST1) – принадлежат к ST2 сиквенс типу и характеризуются наличием аллеля 1-ого всех исследованных генов факторов патогенности (inv, yadA, yopE). Кроме того, все (100%) штаммов Y. pseudotuberculosis содержат ген цитотоксического некротизирующего фактора. Основное количество исследованных изолятов, в том числе выделенных в периоды вспышек ДСЛ, характеризуются наличием варианта гена cnfY, содержащего две делеции и существенные замены нуклеиновых кислот, которые приводят к образованию стоп-кодона в самом начале гена.
Однако 0,96% изолятов содержат аллель 2 гена cnfY, который был клонирован нами в штамм E. coli с целью доказать функциональность полноразмерного гена. Полученный продукт клонированного варианта гена вызывал многоядерность в эукариотических клетках линии Hep-2 и Vero E6. Образование делеций и мутаций в гене cnfY является ярким примером изменчивости генома Y. pseudotuberculosis, которое, как показали результаты, может препятствовать развитию синдрома ДСЛ. Поэтому вопрос о возможном влиянии изменений в гене cnfY на появление в природе микроба, вызвавшего ДСЛ в 50-60-ых годах XX столетия на Дальнем Востоке РФ, остается открытым для будущих исследований.