Введение к работе
Актуальность проблеми.Современное промышленное производство микробиологических средств защиты растений (MCSP) базируется, главным образом, на выпуске препаратов на основе спор и параспо-ралъных кристаллических включений белкоБой природы, продуцируемых различными штаммами ЗасШиз thuringiensis. Основным токсическим началом этой бактерии является кристаллический белок иди Ь~- эндотоксин, хотя многие штаммы В. thurlngiensis '(ВТ) продуцируют и другие токсины. Из последних наибольшее значение имеет термостабильный ,/5-экзотоксин нуклестидной природы, который расширяет спектр инсектицидной активности биоинсектицидов.
В последние годы, з СЕязи- с необходимостью замены химических пестицидов, широкое и интенсивное применение которых привело к серьезным отрицательным экологическим последствиям, уровень производства биопрепаратов на основе ВТ неуклонно растет. Однако, биоинсектицида, по. ряду параметров уступают химическим ОЗР, что уменьшает масштабы их применения. Это довольно высокая себестоимость производства, ограниченность в ряде случаев спектра действия, сргвнительно.низкий уровень токсичности и длительная задержка во времени эффекта их дєйстеия.
Определяющую соль в преодолении этих недостатков могут сыграть новые свойства энгсмоцатогенов, на базе которых создаются биопрепараты. Улучшение характеристик этих микрооргзнигмов моле? быть достигнуто как путем селекционной работы, так и в результате направленной генетической модификации, что определяет необходимость создания соответствующей генетической базы.
Цель я задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение генетического контроля тсксшкгабразсвгнкя промышленных продуцентов отечественных биопрепаратов битоксибациллина B.thuring'ierisis sucsp. thur.tngiensis 202, 1140, 98 и дендробацил-лина - B.t'nurlnglensis subsp.dendroHrnus 49/8 и получение новых энтомопатогенных штаммов ВТ. S связи с этим были поставлены следующее задачи:
і.Найти косвенные биохимические критерии для отбора высоковирулентных клонов среди природных и экспериментально полученных путем химического мутагенеза вариантов S-thurlnglensis subsp. denrirollmus.
2.Получить и изучить коллекцию мутантних штаммов ВТ, отличающихся по уровне синтеза кристаллического белка, экзотоксина и спорообразованию.
3. Изучить плазмидный состав штаммов B.thuringiensis subsp.thuringiensis-и subsp. dendrolimus и рель взехромосемных генетических элементов в контроле синтеза основных токсинов этих бактерий.
4.Изучить возможность получения рекомбшантных штаммов, продуцирующих несколько эитомошдных белков различной специфичности действия.
Научная новизна работы. С помощью химического мутагенеза получены му'сактные штаммы B.thuringiensis subsp.der.drollrr,us 49/8. При изучении их свойств установлено, что величина активности протеази может служить косвенным критерием при отборе вирулентных клонов ВТ этого серотила и может быть использована в качестве вспомогательного ферментативного теста при селекции.
Изучены плазмвдные комплексы штаммов ВТ 202, 1140, 98, 49/8 и их мутантов. При ренагурацли денатурированных ДНК внехромосемных элементов штамма ВТ 202 в составе одноцепочечных молекул 78, 55, 49 и ЗУ' ВДа плагмид обнаружены двунитевые участки, соответствующие дуплексам двух копий инвертированных повторяющихся последовательностей. Установлена связь синтеза "-эндотоксина иД-экзотоксина в ВТ ?Ч2 и 1140 с генами Сгу-плазмид. Выявлена роль 49 Ща плазмвды з детерминировании продукции оактериошна в ВТ 202. Впервые получены данные, указывающие на отсутствие связи регуляции синтеза экзотоксина Сгу-плазмлдсй в штамме ВТ 98.
В результате переноса совместно с плазмидой рВСаб Сгу-плазми-ды, несущей ген Сгу1А(Ь)-гина, из B.thuringiensis subsp. kurstaki НД1 в акриста&инеский вариант B.thuringiensis subsp. thurlngiensis 98-4 и в штамм B.thuringiensis subsp. tenebrionis 1516, сконструированы два штамма ВТ К-19 (HI) и ВТ LT-1 (Н8). Одновременная передача при трансцепшш плазмвды рВГЛб совместно с Сгу-пдазыидой упрощает отбор клонов с необходимым признаком.
Исследована кинетика накопления экзотоксина природными, мутантними и рекомбинактным штаммами ВТ НІ с помощью чувствительного изотопного анализа.
Практическая значимость работы. На-основе детального изучения свойств полученных мутантов B.thuringiensis subsp. clendroiimus предложен косвенный биохимический тест для скрининга активных
штаммов-продуцентов б*-эндотоксина.
При изучении плазмидных комплексов и инсектицидных свойств штаммов ВТ показача большая генетическая стабильность продуцента Оитокскбациллина штамма as по сравнению с ВТ "О? и 1140. Получены мутанты, которые могут иметь практическое значение - штамм ВТ "02-Э (HI) с увеличенной (ка Ж) продукцией/)-экзотоксина и аспо-рогекный штамм ВТ -3. Использование вснорогенногс штамма позволяет упростить способ получения антисыворотки к<5-эндотоксину ВТ И1 и получить экологически более чистый биопрепарат.
Методом котрансцепции сконструированы -два рекомбинантных штамма ВТ К-І9 (HI) и ВТ LT-1 (НЗ) с новыми инсектицидными свойствами, имеющие преимущества перед природными энтомопатогенами. Полевые испытания экспериментального образца препарата, полученного на основе рекомОинантногс штамма К-19 в условиях открытого и закрытого грунта показати возможность использования этого штамма для производства биопрепаратов.
Исследование продукции /ьзкзотоксика природными, мутантными и векомбинантным штаммами ВТ НІ показало, что максимальный уровень накопления Д-экзотоксина зависит от фазы роста культур, фенотшш-ческих свойств штаммов и среды культивирования.
Апробашія работы. Основные результаты диссертации доложены на конференции молоды;'; ученых ВНИИ ПМ (1985 г.), на Всесоюзной конференции "Пути совершенствования микробиологической борьбы с вредными насекомыми и болезнями растений" (Велегож, 1986 г.), на 1-ой отраслевой конференции -конкурса молодых ученых (Новосибирск, 1988 г.), нз Всесоюзной конференции "Проблемы создания и применения микробиологических средств защиты растений" (Велегож, 1989 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано пять работ и имеется два авторских свидетельства (А.с. N1483941, СССР, 1989 г.: Л.с. N1497799, СССР, 1989 г.).Материалы исследований ьнесекы в три отчета по научно-исследовательский работам.
Структура и обьем диссертации. Диссертация изложена на 223 страницах машинописного текста, содержит 31 таблицу,. 25 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части,' вызодов и списка литературы, включающего 393 наименований работ, в тем числе 308 зарубежных азторотз.
- б -