Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Общие сведения о взаимодействии антиген антитело и бактериофаг-микробная клетка 13
1.1 Особенности взаимодействия антиген-антитело 13
1.2 Особенности взаимодействия бактериофаг-микробная клетка 21
ГЛАВА 2 Методы определения вирусных частиц собственные исследования 46
ГЛАВА 3 Материалы и методы 46
3.1 Штаммы бактерий и условия их культивирования 46
3.2 Выделения бактериофагов азоспирилл 47
3.3 Определение количества вирусных частиц 48
3.4 Определение спектра литической активности бактериофагов 49
3.5 Выделение ДНК из бактериофагов 49
3.6 Электрофорез фаговой ДНК 50
3.7 Рестрикционный анализ ДНК выделенных бактериофагов 50
3.8 Электронная микроскопия 51
3.9 Получение поликлональных антител 52
3.10 Аффинная селекция фаговых антител 52
3.10.1 Амплификация фаговых частиц библиотеки 52
3.10.2 Подготовка клеток Е. coli XL-1 Blue к заражению фагами
библиотеки
3.10.3. Подготовка суспензии бактериофагов азоспирилл для аффинной
селекции 54
3.10.4 Отбор фагмид библиотеки 54
3.11 Получение конъюгатов антикроличьих антител с коллоидным золотом.. з
3.12 Дот-анализ 55
3.13 Иммуноферментный анализ 56
3.14 Проведение электрооптического анализа клеточных суспензии 57
3.15 Проведение электроакустического анализа 58
Результаты исследования и их обсуждение 61
Глава 4 Характеристика бактериофагов азоспирилл и исследование их адсорбции на клеточной поверхности методом электронной микроскопии 61
4.1 Анализ генетического материала бактериофагов азоспирилл 62
4.2 Исследование адсорбции бактериофагов азоспирилл на клеточной поверхности методом электронной микроскопии 73
ГЛАВА 5 Изучение взаимодействия микробных клеток с бактериофагами методами электрофизического анализа клеточных суспензии 83
5.1 Изучение взаимодействия микробных клеток с бактериофагами методом электрооптического анализа 85
5.2 Изучение взаимодействия микробных клеток с бактериофагами методом электроакустического анализа 98
ГЛАВА 6 Исследование взаимодействия бактериофагов с поликлональными антителами методом электроакустического анализа
Глава 7 Исследование взаимодействия бактериофагов с мини-антителами методом электроакустического анализа
Заключение 152
Выводы 159
Перечень сокращений и условных обозначений 161
Список литературы
- Особенности взаимодействия бактериофаг-микробная клетка
- Определение спектра литической активности бактериофагов
- Исследование адсорбции бактериофагов азоспирилл на клеточной поверхности методом электронной микроскопии
- Изучение взаимодействия микробных клеток с бактериофагами методом электроакустического анализа
Введение к работе
Актуальность проблемы. Бактериофаги являются самой
многочисленной группой вирусов, характеризующейся высоким уровнем
генетического разнообразия (Шабурова и др., 2009; Ackermann, 2003; Hatfull
et al., 2006), они играют огромную роль, контролируя численность
популяции микроорганизмов, и принимают участие в переносе генетической
информации между бактериальными клетками (Шестаков, 2007).
Бактериофаги успешно применяются в качестве инструмента для создания различного рода биосенсоров, средств доставки лекарственных препаратов, технологии фагового дисплея, борьбы с инфекционными заболеваниями и др. (Летаров и др., 2010; Li et al., 2010; Verheust et al., 2010).
Понимание особенностей взаимодействия бактериофагов с
микробными клетками является необходимым условием для их успешного
применения. Большая часть методов изучения взаимодействия
бактериофагов и клеток основывается или на измерении концентрации бактериофагов, не принимающих участия в адсорбции, или на подсчете инфицированных, либо выживших клеток. Широкое распространение получили альтернативные методы изучения взаимодействия вирусов с бактериями, например, с использованием метода ЯМР (Sonkar et al., 2012), флюориметрии и метода электро-ориентационной спектроскопии (Жиленков др., 1998), криоэлектронной и атомно-силовой микроскопии (Уткин и др., 2013). Несомненный интерес представляет исследование адсорбции бактериофагов на клеточной поверхности с помощью метода электронной микроскопии (Chang et al., 2010).
Развитие новых и совершенствование существующих методов
регистрации и изучения взаимодействия микробных клеток с
бактериофагами является весьма актуальной задачей. Регистрация инфекции
микробной клетки бактериофагом служит также информативным параметром
наличия или отсутствия чувствительности клетки к изучаемому
бактериофагу.
Не менее востребованно изучение взаимодействия бактериофагов с антителами (Ат), поскольку данное направление может служить основой для развития методов детекции вирусных частиц. При этом бактериофаги являются прекрасной моделью для разработки систем детекции вирусов, а инструментом для распознавания вирусов служат специфичные Ат (Garca-Aljaro et al., 2010; Lesniewski et al., 2014). Для детекции вирусов используется довольно широкий спектр методов, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки (Носик и Стаханова, 2000; Dultsev et al., 2001; O'Connell et al., 2006; Carter et al., 2007; Lee et al., 2012).
Несмотря на то, что способы детекции бактериофагов
совершенствуются, методов определения бактериофагов почвенных
микроорганизмов сравнительно мало. Поскольку бактерии рода Azospirillum являются модельным объектом в изучении ассоциативного взаимодействия растений и микроорганизмов (Игнатов, 2005), перспективным направлением
исследований является развитие новых методов детекции вирусных частиц при их взаимодействии с Ат на примере бактериофагов почвенных микроорганизмов данного рода.
Пьезоэлектрические резонаторы с поперечным электрическим полем, в
которых отсутствует контакт исследуемого материала с металлическими
электродами, представляют особый интерес для исследования свойств
различных жидкостей, включая и биологические. В отличие от
традиционных резонаторов с продольным полем эти резонаторы более
чувствительны к контактирующей жидкости, поскольку реагируют на
изменение как механических, так и электрических ее свойств. При этом
возможен анализ биологических объектов непосредственно в жидкой фазе
без нанесения на поверхность активных реагентов в течение короткого
времени (Зайцев с др., 2012; Гулий и др., 2013; Гулий и др., 2015). В этом
плане весьма перспективным является применение метода
электроакустического анализа, основанного на регистрации
биоспецифических реакций в жидкой суспензии, контактирующей с поверхностью пьезоэлектрика.
Описанные преимущества открывают перспективы использования метода акустического анализа для регистрации инфекции микробных клеток бактериофагами и взаимодействии бактериофагов с Ат для развития методов детекции вирусных частиц.
Важным критерием при разработке новых методов регистрации взаимодействия бактериофагов с микробными клетками и Ат является их универсальность и возможность использования для различных объектов. В связи с этим необходима оптимизация электрофизических методов, ускорение циклов измерений, отработка критерия чувствительности и расширение диапазона объектов исследования.
Поскольку морфология вирусных частиц и присутствие в
анализируемом образце возможных агломератов потенциально могут оказывать влияние как на процесс взаимодействия бактериофагов с микробной клеткой и Ат, так и вызывать искажение сигнала при проведении электроакустического анализа, изучение и характеристика используемых бактериофагов являются весьма актуальными.
Цель работы: охарактеризовать бактериофаги азоспирилл и процесс
их взаимодействия с поверхностью бактерий и гомологичными
поликлональными и фаговыми мини-антителами для развития новых способов детекции вирусных частиц с помощью электрофизических методов анализа.
Для реализации поставленной цели решались следующие задачи:
1. Выделить бактериофаги из клеток А. brasilense Sp7, A.
lipoferum Sp59b и A. lipoferum SR65 и провести анализ их генетического материала (анализ нуклеиновой кислоты бактериофагов азоспирилл ФАb-Sp7, ФАl-Sp59b и ФАl-SR65).
-
Исследовать адсорбцию бактериофагов ФАb-Sp7, ФАl-Sp59b и ФАl-SR65 на клеточной поверхности азоспирилл методом электронной микроскопии.
-
Изучить взаимодействие микробных клеток с бактериофагами методами электрооптического и электроакустического анализа клеточных суспензий для определения их чувствительности к бактериофагам.
-
Исследовать взаимодействие бактериофагов Al-Sp59b и М13К07 с поликлональными Ат методом электроакустического анализа.
-
Отработать методику получения мини-Ат к бактериофагам азоспирилл с использованием технологии фагового дисплея, и оценить возможность их применения для детекции вирусных частиц методом электроакустического анализа.
Научная новизна работы. Определен тип и размер нуклеиновых
кислот бактериофагов азоспирилл - ФАb-Sp7, ФАl-Sp59b и ФАl-SR65.
Проведено электронно-микроскопическое исследование начальных стадий
взаимодействия бактериофагов ФАb-Sp7, ФАl-Sp59b и ФАl-SR65 с
микробными клетками А. brasilense Sp7, A. lipoferum Sp59b и A. lipoferum
SR65, соответственно. Предложен новый подход определения
чувствительности микробных клеток к бактериофагам методом
электроакустического анализа. Выработан критерий оценки специфичного
взаимодействия бактериофагов и клеток в анализируемой суспензии на
основе изменения модуля электрического импеданса датчика.
Продемонстрирована возможность использования метода
электроакустического анализа для регистрации взаимодействия Ат с
бактериофагами и их детекции на примере бактериофагов Al-Sp59b и
М13К07. Применение технологии фагового дисплея позволило впервые
получить специфичные мини-Ат к бактериофагу Al-Sp59b и
продемонстрировать возможность их использования для регистрации взаимодействия с бактериофагами методом электроакустического анализа.
Теоретическая значимость. Характеристика генетического материала
бактериофагов азоспирилл ФАb-Sp7, ФАl-Sp59b и ФАl-SR65 вносит
существенный вклад и является необходимым этапом в изучении
бактериофагов почвенных микроорганизмов. Проведенные электронно-
микроскопические исследования начальных стадий взаимодействия
бактериофагов почвенных микроорганизмов с клетками-хозяевами
демонстрируют особенности строения бактериофагов и их адсорбции на
поверхности микробной клетки.
Практическая значимость. Разработан новый способ регистрации инфекции микробных клеток бактериофагами и определения их бактериофагоустойчивости с использованием метода электроакустического анализа клеточных суспензий, позволяющий получать результаты в короткие сроки.
Представленные результаты демонстрируют возможность регистрации взаимодействия бактериофагов с Ат и служат основой для разработки
экспресс метода для идентификации и детекции вирусов непосредственно в жидкой фазе.
Впервые отработана методика получения мини-Ат к бактериофагам азоспирилл с использованием технологии фагового дисплея. Использование фаговых мини-Ат, специфичных к бактериофагам азоспирилл, показало возможности их применения для детекции вирусных частиц методом электроакустического анализа.
Материалы, представленные в диссертации, используются при чтении лекций по микробиологии и биотехнологии для студентов и аспирантов в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования «Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» и Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова».
По материалам исследования разработаны и изданы методические
рекомендации по определению литической активности бактериофагов
методом электрооптического анализа клеточных суспензий для студентов
старших курсов и аспирантов, специализирующихся в области
микробиологии, рекомендованные ученым советом ИБФРМ РАН (протокол №9 от 25.09.2012 г.).
Методология и методы исследования. Методологической базой
послужили труды отечественных и зарубежных исследователей по вопросам
изучения взаимодействия бактериофагов с микробными клетками и Ат. В
качестве объекта исследования использовали микробные клетки А. brasilense
Sp7, A. lipoferum Sp59b, A. lipoferum SR65 и E. coli XL-1 и бактериофаги
ФАb-Sp7, ФАl-Sp59b, ФАl-SR65 и М13К07. Для исследования адсорбции
бактериофагов ФАb-Sp7, ФАl-Sp59b и ФАl-SR65 на клеточной поверхности
азоспирилл использовали метод электронной микроскопии. Для
характеристики процесса взаимодействия бактериофагов с поверхностью бактерий и гомологичными поликлональными и фаговыми мини-антителами использовали методы электрооптического и электроакустического анализа. Для каждой серии экспериментов проводили не менее пяти измерений, а полученный фактический материал обрабатывался методами статистического анализа.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
-
Бактериофаги ФАb-Sp7, ФАl-Sp59b и ФАl-SR65, выделенные из клеток А. brasilense Sp7, A. lipoferum штаммов Sp59b и SR65, соответственно, являются ДНК-содержащими вирусами с размером ДНК около 50 тыс. пар нуклеотидов.
-
По данным электронно-микроскопического анализа бактериофаги азоспирилл адсорбируются на поверхности гомологичных (комплементарных) бактерий и не адсорбируются на клетках, к которым не проявляют литической активности.
-
Метод электроакустического анализа позволяет проводить регистрацию взаимодействия специфичных Ат с бактериофагами для их детекции.
-
Мини-Ат к бактериофагам, полученные с помощью технологии фагового дисплея, могут быть использованы для регистрации их взаимодействия с бактериофагами и детекции вирусных частиц методом электроакустического анализа.
Апробация результатов исследования. Результаты, полученные в
ходе выполнения данной работы, представлены на III Региональной научной
конференции «Исследования молодых ученых в биологии и экологии»
(Саратов, 18-21 апреля, 2011); VI Всероссийской конференции молодых
ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с
окружающей средой» (Саратов, 25-27 сентября, 2012); Международной
научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и
перспективы в сельском хозяйстве» (Саратов, 28-29 января, 2013); 10
Международной научно-практической конференции «Бъдещите изследвания-
2014» (София, 17-25 февраля, 2014); 18-ой Международной Пущинской
школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино,
21-25 апреля, 2014); III Санкт-Петербургском Международном
экологическом форуме «Инфекция и иммунитет» (Санкт-Петербург, 21-24
сентября, 2014); V Международной научной интернет-конференции
«Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии», (Казань, 18-19
ноября, 2014); Международной научно-практической конференции
«Биотехнология: реальность и перспективы» (Саратов, 1-3 декабря, 2014); XXVII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 9-12 февраля, 2015); V Съезде биофизиков России (Ростов-на-Дону, 4-10 октября, 2015); Международной конференция молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика ‘15» (Пущино, 26-27 октября, 2015); Конференции молодых ученых «Проблемы современной физико-химической биологии» (Пущино, 22-23 декабря, 2015).
Работа выполнена в соответствии с плановыми темами НИР кафедры
биохимии и биофизики СГУ «Молекулярные основы растительно-
бактериальных взаимодействий в условиях антропогенного загрязнения
2011-2015» (г. Саратов), а также в лаборатории физиологии микроорганизмов
ИБФРМ РАН в соответствии с плановыми темами НИР «Исследование
бактериофагов почвенных микроорганизмов, участвующих в ассоциативных
микробно-растительных взаимодействиях», номер государственной
регистрации 01201359051.
Работа выполнена при поддержке Госконтракта с Саратовским
филиалом Института радиоэлектроники им. В.А. Котельникова РАН, г.
Саратов от 29 июня 2010 г. (в рамках гранта РФФИ № 09-02-12442-офи_м
«Исследование физических основ работы нового поколения
многопараметрических акустоэлектронных датчиков для изучения и
мониторинга биологических реакций в клеточных суспензиях», 2009-2010
гг.); гранта Министерства образования Российской Федерации, соглашение
№ 8852 («Разработка методологии и приборного обеспечения
электрооптического анализа вирусов микроорганизмов» (2012-2013 гг.)); договора с Саратовским филиалом Института радиоэлектроники им. В.А. Котельникова РАН №1/04.2016 на выполнение научно-исследовательской работы от 12 апреля 2016 г. (в рамках гранта РФФИ 16-07-00818 «Разработка новых методов детекции и анализа бактериальных клеток в проводящих суспензиях на основе акустических волн в пьезоэлектрических пластинах и структурах для биосенсорных информационных систем», 2016-2018 гг.).
Личный вклад соискателя. Автор принимал непосредственное участие в планировании и проведении экспериментов, обсуждении полученных результатов и их интерпретации, формулировке выводов, подготовке публикаций. Отдельные эксперименты или их этапы проводились совместно с коллегами из ИБФРМ РАН и Саратовского филиала Института радиотехники и электроники им. В.А. Котельникова РАН.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 7 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов диссертационных исследований.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 2 глав обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 233 источника, в том числе 150 из них зарубежных. Диссертация изложена на 188 страницах, включает 49 рисунков и 1 таблицу.
Особенности взаимодействия бактериофаг-микробная клетка
Свойство аффинности представляет уникальные возможности для изучения взаимодействий антиген-антитело (антиген-Ат) или бактериофаг-микробная клетка. Под аффинным взаимодействием понимают способность двух или более молекул к образованию химической связи.
Реакция антиген-Ат — это реакция, в ходе которой происходит специфическое связывание молекул антигенов с Ат, в результате чего образуются иммунные комплексы. Как правило, реакция антиген-Ат in vitro протекает в две стадии, различающиеся между собой по механизму и скорости протекания: первая специфическая стадия протекает быстро и без видимых эффектов даже при низких температурах и подчиняется общим законам физической химии и термодинамики. На данном этапе происходит обратимое специфическое взаимодействие вариабельных участков Ат с антигенными детерминантами; вторая неспецифическая стадия протекает медленно. Ее можно наблюдать визуально, к примеру, при выпадении иммунных комплексов в осадок в ходе агглютинации.
Вторая стадия может отсутствовать, если Ат взаимодействуют с гаптенами (веществами с низкой молекулярной массой, не обладающими иммуногенностью). Скорость, а также возможность протекания данной стадии будет зависеть и от ряда условий: температуры, наличия солей и др. (Кэбот и Мейер, 1968; Бойд, 1969; Вейсман, 1983; Кульберг, 1985; Петров, 1987; Пол, 1987).
Участок Ат, который связывается с антигеном, называют паратопом, а участок молекулы антигена, распознаваемый Ат, называют эпитопом. Прочность связывания антигена с Ат, называемая также аффинитетом, можно количественно измерить при помощи определения константы ассоциации (Schroeder and Cavacini, 2010). Паратоп и эпитоп обладают высокой комплементарностью.
Важную функцию при взаимодействии Ат с антигеном выполняют гипервариабельные участки молекулы Ат – области CDR (от англ. complementarity determining regions). Данные участки представляют собой петли, между которыми расположены -складки, причем по протяженности и аминокислотной последовательности у различных Ат они могут существенно отличаться. Формируемая из шести петель CDR трехмерная структура Ат участвует в распознавании комплементарного ей эпитопа на поверхности антигена (Альтшулер и др., 2010).
Аминокислотные остатки (а.о.), входящие в состав CDR и взаимодействующие с эпитопом, называют определяющими специфичность участками или участками SDR (от англ. specificity determining regions). Во взаимодействии антигена и Ат могут участвовать от 5 до 15 а.о., входящих в состав эпитопа, и, как правило, столько же а.о. паратопа (Duquesnoy, 2006). Антигены небольшого размера (низкомолекулярные соединения, к примеру, гаптены) имеют меньшую площадь связывания с Ат. Форма контактирующей поверхности Ат во многом зависит от размера антигена. При взаимодействии с антигенами, обладающими высокой молекулярной массой, она практически плоская, с низкомолекулярными антигенами – более вогнутая. Помимо а.о., непосредственно контактирующих с эпитопом, ключевую роль в распознавании антигена играют а.о., которые выполняют структурную функцию и обеспечивают необходимую конформацию CDR-петель, тем самым осуществляя правильное взаимное расположение в пространстве взаимодействующих поверхностей (Chi et al., 2007). Связь антигена с Ат является обратимой и осуществляется она за счет водородных связей, электростатических и гидрофобных взаимодействий, а также за счет сил Ван-дер-Ваальса. Несмотря на то, что данные виды связей слабее ковалентной, в совокупности они обеспечивают высокоаффинное взаимодействие эпитопа и паратопа (Sundberg, 2009). Благодаря свойству Ат специфически связываться с комплементарными участками антигенов, они используются для решения ряда биотехнологических задач (Gascoyne et al., 1997; Uithoven et al., 2000; Vaughan et al., 2001; Lesniewski et al., 2014; Spadiut et al., 2014). Наиболее простым вариантом получения Ат, обладающих специфичностью к конкретному антигену, является иммунизация, в ходе которой данный антиген вводится вместе с компонентами, которые усиливают иммунный ответ (адьювантами), в организм животного (кролика, мыши, овцы и др.). Сыворотка крови иммунизированного животного будет содержать поликлональные Ат, представляющие собой гетерогенную по строению, эпитопной специфичности и аффинности популяцию Ат, специфичных к введенному антигену (Ратнер, 1996). Недостатком поликлональных Ат является их специфичность к ряду детерминант антигена (Альтшулер и др., 2010).
Следует отметить, что все диагностические иммунохимические методы зависят, в первую очередь, от качества используемых специфических Ат. Поэтому дальнейшее развитие методов получения Ат привело к созданию гибридомной технологии. Получаемые при помощи данной технологии Ат продуцируются одним клеточным клоном, узнают один эпитоп и сохраняют свои свойства во многих генерациях гибридной клетки (Толькова, 2015).
Таким образом, моноклональные Ат обладают рядом преимуществ: имеют высокую специфичность; их можно получать в больших количествах; возможно создание Ат против ранее не известных антигенов. В настоящее время при помощи гибридомной технологии получены Ат, которые успешно применяются для выявления различных соединений (гормонов, витаминов, лекарственных препаратов), патогенных микроорганизмов и их токсинов, а также используются в иммунотерапии (Глик и Пастернак, 2002; Spadiut et al., 2014). К примеру, при использовании моноклональных Ат показана возможность определения холерного токсина (Калинина и др., 2009), рекомбинантных и вирусных белков лихорадки Эбола и Марбурга (Иванова и др., 2010).
Определение спектра литической активности бактериофагов
Цитологические методы для детекции вирусов на сегодняшний день применяются достаточно редко, но, тем не менее, при ряде инфекций по-прежнему используются. Исследуют материал биопсии, мазки, и др. Материал обрабатывается определенным образом, затем подвергается окрашиванию и просматривается под микроскопом. К примеру, так оценивают состояние тканей печени при диагностике хронических гепатитов (Bergeron at al., 2010). К распространенным методам определения бактериофагов и вирусов относятся и иммунологические методы, основанные на определении вирусных антигенов. Серологическая диагностика позволяет идентифицировать вирус даже в том случае, когда выделение вирусных частиц из образца не дало никаких результатов. Один из наиболее распространенных методов – ИФА (enzyme-linked immunosorbent assay – ELISA). В основу метода положено явление взаимодействия антиген-Ат. Для визуализации данного взаимодействия используют фермент в качестве метки, а затем анализируют сигнал физико-химическими методами. Существует большое количество вариантов этого метода (Егоров и др., 1991; Исаева и др., 1996; Самуилов, 1999, Шанин и др., 2014). Метод ИФА обладает высокой чувствительностью и быстротой анализа. Недостатком метода является возможность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов, а также необходимость использования метки (Клотченко и др., 2012).
Другой разновидностью серологических методов является РИФ. Метод основан на использовании Ат, связанных не с ферментом, а с красителем, например флуоресцеинизотиоцианатом. Принцип был разработан Альбертом Кунсом в 1942 г. (Coons et al.., 1942). Различают разновидности метода: прямой и непрямой (Cherry, 1980; Gardner and McQuillin, 1980). Методика РИФ отвечает критериям высокой чувствительности и специфичности, метод относительно дешев, прост в выполнении, не требует специального дорогостоящего оборудования, позволяет быстро получить результат (в течении 30–50 минут), но требует исполнения опытным, компетентным лабораторным работником. К недостаткам метода относится низкая достоверность для мелких объектов, поскольку вирусы остаются за пределами разрешающей способности микроскопа (Cherry, 1980). Для успешного проведения РИФ требуется достаточно высокая концентрация вирусных частиц в образце, и даже незначительная его контаминация способна давать неспецифическое свечение (Носик и Стаханова, 2000).
Для диагностики вирусов успешно применяется метод иммунохроматографического анализа (ИХА), достоинствами которого являются быстрота проведения и легкость применения (Raphael et al., 2009). Так, например, показана возможность использования высокочувствительной и простой технологии визуальной диагностики вирусных инфекций картофеля на поликомпозитных мембранных тест-полосках (Кравченко и др., 2011). В другой работе методом ИХА показана возможность детекции вируса табачной мозаики, при этом время проведения анализа составляло не более 5 мин, а чувствительность разработанной тест системы сопоставима с чувствительностью ИФА (Дрыгин и др., 2009).
Радиоиммунный анализ (РИА) основан на введении в один из компонентов реакции радиоактивной метки и ее дальнейшей детекции радиоспектрометром, при этом для визуализации взаимодействия антиген-Ат в качестве метки используются не красители и ферменты, а радиоактивные соединения. РИА является высокочувствительным и специфичным методом и в настоящее время чаще применяется для определения гормонов. Имеются данные о применении РИА для ранней диагностики туберкулезной инфекции и определения вируса лейкоза у мышей. К недостаткам метода стоит отнести высокую стоимость применяемого оборудования, а именно, гамма-счетчиков, и использование радиоактивных веществ (Носик и Стаханова, 2000).
Для типирования вирусов традиционно применяется реакция связывания комплемента (РСК). В основу метода положен принцип связывания образующегося иммунного комплекса антиген-Ат глобулярными белками системы комплемента. РСК проводится в два этапа. На первом этапе происходит специфическое взаимодействие между антигеном и Ат. На втором – к образовавшемуся комплексу через Fc-фрагмент Ат присоединяется комплимент. В случае, если специфического взаимодействия между антигеном и Ат не происходит, то комплемент остается не связанным. РСК обладает недостаточно высокой чувствительностью, также недостатком метода является сложность в проведении стандартизации реагентов (Cherry et al., 1980).
В вирусологических лабораториях для серологической идентификации ряда вирусов широко используется реакция торможения гемагглютинации (РТГА). Суть метода заключается в способности противовирусных Ат предотвращать агглютинацию эритроцитов гемагглютининами вирусов. Если же в сыворотке крови отсутствуют специфические противовирусные Ат, то происходит агглютинация эритроцитов вирусными белками. В противном случае, Ат нейтрализуют вирус. Использование метода может быть ограничено из-за наличия в сыворотке крови людей неспецифических ингибиторов вирусов, а также естественных Ат — агглютининов (Yolken et al.,1999).
Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) основана на том, что на поверхности эритроцитов фиксированы антигены возбудителя, при этом, их агглютинация происходит только в присутствии специфичных к данному возбудителю Ат (Носик и Стаханова, 2000).
Реакция обратной пассивной гемагглютинации (РОПГА) имеет противоположный принцип РПГА, при этом индикатором является агглютинация эритроцитов, которые были подвергнуты сенсибилизации специфическими Ат, в присутствии вирусных антигенов. РОПГА широко применяется для определения HBs-антигена крови. Также существует другая разновидность метода гемагглютинации – реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) (Носик и Стаханова, 2000). В настоящее время довольно широко используют методы выделения нуклеиновой кислоты вируса и ее детекции с помощью более надежного метода – полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР позволяет детектировать присутствие даже незначительных количеств вирусной нуклеиновой кислоты в материале, посредством значительного увеличения определенных участков вирусных генов. Метод является высокочувствительным и был предложен впервые в 1983 г. Кэрри Муллисом. При помощи фрагмента ДНК-полимеразы он предложил амплифицировать ДНК в ходе многократных циклов ее репликации, используя затравки-праймеры комплементарные участку ДНК. Метод был на тот момент довольно трудоемким и требовал для проведения много времени. Позже, с развитием приборного обеспечения и открытием термостабильного фермента Taq- полимеразы, появилась возможность автоматизации метода (Антонова и др., 2011).
На сегодняшний день методом ПЦР можно обнаружить не только ДНК содержащие вирусы, но вирусы, содержащие РНК (методом ОТ-ПЦР). Посредством проведения реакции обратной транскрипции получают комплементарную ДНК (кДНК), которая и используется в реакции амплификации (O Connell et al., 2006). Главным фактором, ограничивающим широкое применение методики ПЦР в реальном времени является высокая стоимость аппаратуры.
Исследование адсорбции бактериофагов азоспирилл на клеточной поверхности методом электронной микроскопии
Титр Ат к фагам азоспирилл определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) (Beatty et al., 1987) по следующей схеме: адсорбировали антиген (Al-Sp59b или М13К07), разведенный в 0,01 М ФСБ в соотношении 1:100, на дне планшета, затем инкубировали в течение ночи при 4 С. Далее проводили блокировку свободных сайтов связывания в лунке с помощью 200 мкл 2% сухого молока в 0,01 М ФСБ в течение 1 ч на шейкере. Затем вносили 50 мкл антифаговых иммуноглобулинов кролика (разведенных последовательно в ФСБ 1:1) и инкубировали в течение 1 ч на термошейкере при 37 С, далее отмывали трехкратно с помощью 200 мкл ФСБ по 10 мин на шейкере. Затем в лунки вносили 50 мкл антикроличьих Ат, меченных пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch, США) (разведенных в 0,01 М ФСБ 1:500), и инкубировали 1 ч на термошейкере при 37 С. Далее проводили трехкратную отмывку 200 мкл ФСБ по 10 мин также на шейкере. В качестве субстрата для пероксидазы использовали 100 мкл 0,006% ортофенилендиамина (Fluсka, Швейцария), в 0,1 М цитратном буфере с добавлением 0,01 % перекиси водорода, останавливали реакцию 100 мкл 0,1 М серной кислоты. 3.14 Проведение электрооптического анализа клеточных суспензий
Перед проведением электрооптического (ЭО) анализа осуществляли троекратную отмывку центрифугированием клеток всех используемых штаммов от культуральной среды в течение 5 мин при 2800 g. Для отмывки микробных клеток использовали дистиллированную воду с электропроводностью 1,6 S/см. Электропроводность определяли с помощью кондуктометра HANNA HI 8733 (Румыния). Полученную суспензию вновь центрифугировали в течение минуты при 110 g для устранения конгломератов. Оптическую плотность полученного супернатанта доводили дистиллированной водой до значения ОD66o=0,42-0,45, что соответствовало 4,5108 клеток/мл. Ориентационные спектры клеток измеряли на электрооптическом анализаторе ELOAnalyser (EloSystem GbR, Гремания). Параметры измерения: напряженность электрического поля 93,1 В/см, длина волны света 670 нм (относительно вакуума), время приложения электрического поля 3,0 сек. На рисунке 3.1 приведено схематическое изображение оптической части анализатора.
Объем ячейки, в которой производили измерения, составлял 1 мл, количество клеток определяли, используя стандартный метод прямой световой микроскопии. В экспериментах оперировали дискретным набором частот ориентирующего электрического поля: 2800, 2000, 1450, 1000, 740 кГц.
Логарифмическая зависимость разности значений оптической плотности суспензий SОD, измеренной при распространении пучка неполяризованного света вдоль и поперек направления ориентирующего поля, от частоты представлялась в виде ориентационных спектров. Эта разность была нормирована на значение оптической плотности при хаотической ориентации клеток (Мирошников и др., 1986, Bimin and Voloshin, 1996). Рисунок 3.1 – Схема оптической части электрооптического анализатора ELOAnalyzer (Guliy et al., 2014)
Для каждой серии экспериментов проводили не менее пяти измерений. Анализ и представление данных осуществляли при помощи программы Microsoft Excel 2010 и стандартных методов статистической обработки (Чарыков, 1984; Лакин, 1990).
Все эксперименты по изучению изменений механических и электрических свойств суспензий изучаемых бактериофагов при их взаимодействии c бактериальными клетками, а также фаговыми мини-Ат и поликлональными Ат проводили с помощью специально изготовленного датчика на основе резонатора с поперечным электрическим полем в диапазоне частот 6–7 МГц. Этот резонатор был изготовлен из пластины ниобата лития X-среза толщиной 0,5 мм. На нижней стороне пластины были нанесены два прямоугольных электрода, состоящие из слоев хрома и серебра с размерами 510 мм2 с расстоянием между ними 3 мм. Область вокруг электродов и часть электродов были покрыты специальным лаком, который демпфировал паразитные волны Лэмба и обеспечивал достаточно высокую добротность 630. На верхней стороне пластины была приклеена жидкостная ячейка объемом 1 мл (Зайцев и др., 2011). Схема электроакустического датчика представлена на рисунке 3.2.
Для проведения электроакустического анализа образец вносили в вышеупомянутую жидкостную ячейку и проводили измерения величины электрического импеданса датчика с помощью прецизионного измерителя LCR параметров Agilent 4285A (США).
Для построения кривых использовали средние значения, полученные в ходе проведения экспериментов не менее, чем в пяти повторностях. Достоверность полученных результатов подтверждается с использованием новейшей аппаратуры (LCR-meter Agilent 4285A (США)), при этом базовая погрешность прибора составляла не более чем 2%. Обработку и представление данных осуществляли при помощи пакета Microsoft Excel 2010.
Изучение взаимодействия микробных клеток с бактериофагами методом электроакустического анализа
Литическая активность бактериофага Ab-Sp7 в отношении клеток Niveispirillum irakense штаммов KBC1 и KA3, Nitrospirillum amazonense Am14; бактериофага A1-Sp59b в отношении клеток Niveispirillum irakense KA3; и бактериофага Al-SR65 в отношении клеток Niveispirillum irakense KBC1 может объясняться их близкородственностью к роду Azospirillum. Клетки Niveispirillum irakense штаммов KBC1 и KA3, Nitrospirillum amazonense Am14 до недавнего момента относились к роду Azospirillum, но были переклассифицированы (Lin et al., 2014).
Тот факт, что бактериофаги не взаимодействуют с клетками гетерологических родов, свидетельствует об отсутствии на их поверхности соответствующих рецепторов. Селективность действия бактериофагов в отношении клеток азоспирилл можно объяснить отличием в организации главного компонента внешней мембраны - липополисахарида (ЛПС), который, по-видимому, играет важную роль в процессе адсорбции фагов на бактериальной клетке.
Литическое действие бактериофага Ab-Sр7 в отношении клеток A. brasilense штаммов Sp7, Cd, N. irakense KBC1 может быть связано с высокой степенью сходства их О-антигенов (Коннова и др., 2008). Клетки A. lipoferum Sp59b, A. brasilense штаммов Cd, Sp7, S17 и A. irakense KBC1 отнесены к одному серотипу, но, несмотря на идентичность моносахаридного состава и структуры ОПС, штамм Sp59b имеет существенные отличия в антигенных свойствах ЛПС (Филипьечева, 2011). Это может объяснить его устойчивость к действию бактериофага Ab-Sр7. В свою очередь бактериофаг, выделенный из A. lipoferum Sp59b, не проявляет литической активности в отношении клеток A. brasilense штаммов Cd и Sp7.
Клетки A. brasilense Sp245 как и клетки штамма Jm6B2 проявляли устойчивость к действию всех изучаемых бактериофагов. Гомологичный бактериофагу Ab-Sр7 штамм A. brasilense Sp7 и штамм Sp245 относятся к разным серотипам (Матора и др., 2008), что может свидетельствовать об устойчивости последнего к действию бактериофага, ввиду отсутствия специфичных антигенных детерминант на поверхности последнего.
Таким образом, анализ литературных и собственных данных позволяет выявить корреляцию между особенностями организации клеточной поверхности различных серотипов азоспирилл с селективностью действия изучаемых бактериофагов.
Понимание особенностей взаимодействия бактериофагов с микробными клетками является необходимым условием для их успешного применения в прикладной микробиологии. Как уже говорилось выше, метод электронной микроскопии является одним из распространенных методов прямой регистрации взаимодействия вирусов с поверхностными структурами клеток. Поэтому на данном этапе работы для регистрации взаимодействия бактериофагов с гомологичными клетками решено было применить метод электронной микроскопии.
Проведенные электронно-микроскопические исследования препаратов бактериофага, выделенного из клеток A. brasilense Sp7, показали наличие у бактериофага Ab-Sp7 изометрической головки размером около 47 нм и хвостового отростка длиной около 16 нм (Караваева и др., 2011).
Бактериофаг ФА1-Sp59b имеет сферическую головку диаметром 30 нм и короткий хвостовой отросток около 10 нм. Бактериофаг Al-SR65 имеет сферическую головку размером около 32 нм и короткий хвостовой отросток размером до 9 нм (Макарихина и др., 2013).
Учитывая морфологические особенности, выделенные бактериофаги по Международной классификации и номенклатуре вирусов относятся к семейству Podoviridae (Ackermann, 2007). По классификации передложенной А.С. Тихоненко – ко II морфологической группе: «Фаги с аналогом отростка» (Тихоненко, 1968). Далее проводили электронно-микроскопическое исследование взаимодействия бактериофагов ФАb-Sp7, ФАl-Sp59b и ФАl-SR65 с микробными клетками А. brasilense Sp7, A. lipoferum штаммов Sp59b и SR65. Для этого готовили образцы, как описано в главе 3. На рисунках 4.7-4.9 представлены результаты электронно микроскопического исследования специфической адсорбции бактериофагов ФАb-Sp7, ФАl-Sp59b и ФАl-SR65 на поверхности клеток гомологичных штаммов. Из полученных данных видно, что бактериофаги хорошо адсорбируются на поверхности клеток азоспирилл, при этом наблюдается равномерная по всей поверхности бактериальной клетки адсорбция вирусов.
Для улучшения восприятия полученных данных, на рисунках представлены электронно-микроскопические изображения соответствующих бактериофагов.
Для исключения неспецифического взаимодействия было проведено электронно-микроскопическое исследование взаимодействия выделенных бактериофагов с клетками других, не комплементарных, штаммов. Поскольку было показано, что бактериофаги Ab-Sp7 и A1-Sp59b не проявляют активности в отношении клеток A. brasilense Jm6B2 (Таблица 4.1), то в качестве контроля использовали клетки данного штамма.
Бактериофаг Al-SR65 не проявлял литической активности в отношении клеток N. irakense KA3, соответственно, он и был выбран в качестве отрицательного контроля. Условия подготовки образцов были аналогичны таковым при подготовке образцов для визуализации специфического взаимодействия.