Введение к работе
Актуальность проблемы
Вертикальная дифференциация наземных биогеоценозов обусловлена формированием вертикальных ярусов, существенно различающихся по составу и структуре микробных сообществ. Надземный, наземный (подстилка), и почвенный ярусы связаны единым потоком органического вещества и представляют собой разделенные в пространстве стадии сукцессии по разложению органических веществ (Звягинцев и др., 1999). Разложение органических остатков связано, прежде всего, с деятельностью микроорганизмов, образующих ферменты- гидролазы, разрушающие сложные органические соединения. Совокупность этих микроорганизмов формирует гидролитический микробный комплекс, структура которого во многом влияет на особенности круговорота веществ и превращения энергии в биогеоценозе.
Масштабы развития микробных гидролитических комплексов и микробной деструкции биополимеров (на примере полисахаридов) различны в биогеоценозах разных климатических зон, однако в научной литературе информация о разнообразии и устойчивости микробных гидролитических комплексов под воздействием экологических факторов практически отсутствует. Долгое время считалось, что основную группу организмов, обладающих гидролитическим комплексом ферментов, составляют, главным образом, грибы. За последнее десятилетие появляется все больше информации о наличии полного комплекса гидролитических ферментов у представителей прокариот (De Boer, 2001; Schrempf, 2001; Bhattacharya, 2007). Не все прокариоты обладают полным комплектом гидролитических ферментов, в результате чего степень разложения полимеров разными микроорганизмами неодинакова. Интенсивность их деятельности очень сильно зависит от многих экологических факторов, в том числе температуры, влажности, окислительно-восстановительных условий, реакции среды и осмотического давления почвенных растворов (Gohel et al., 2005).
Поступающие в природную систему полисахариды (биополимеры моносахаридов, соединенные гликозидными связями в линейные или разветвленные комплексы) чрезвычайно широко распространены в природе и являются важным источником органических веществ. Такие полисахариды, как хитин, пектин, целлюлоза, входят в состав матрикса клеточных стенок организмов и, постоянно присутствуя в наземной системе, представляют собой пул органического углерода и азота (De Boer, 2004, Parcham, Deng, 2000). Содержание полисахаридов в почве в зависимости от типа почвы и метода экстракции
колеблется в пределах от 0,06% до 3,0% от массы почвы и от 1% до 14% от массы органического вещества почв. В почвы с растительными остатками ежегодно поступает от 2 до 14 т/га углеводов, значительная часть которых минерализуется или участвует, в качестве структурных элементов, в формировании гуминовых кислот (Gomez Ramirez, 2004). Для включения элементов питания в биологический круговорот необходима деструкция полисахаридов, которую осуществляют специфические комплексы микроорганизмов. В России данная область исследований практически не затронута. Опубликованные в мировой научной литературе материалы по предлагаемой проблеме, как правило, содержат результаты исследований комплексов ферментов (хитиназ, целлюлаз, лигниназ и др.), выделенных не из естественных систем, а из культур микроорганизмов, инкубируемых на искусственных питательных средах.
В последнее время препараты, полученные на основе этих ферментов, вызывают все больший интерес, как перспективные экологически безопасные средства биологического контроля за фитопатогенными грибами и широко используются в качестве средств защиты растений от инфекций (Eltarabily, 2000; Deboer, 1998; Downing, Thomson, 2000; Kobayashi et al., 2002). Кроме того, они могут быть использованы в качестве биосорбентов, способствующих биоремедиации и детоксикации почв. Однако, в естественных почвах проблема деструкции полисахаридов этими ферментами, несмотря на свою высокую актуальность, до настоящего времени почти не изучалась. Публикации, в основном, посвящены анализу отдельных частных аспектов этой проблемы. Изучение различий в структуре гидролитических комплексов микроорганизмов вертикальных ярусов поможет составить более полное представление о ступенчатом разрушении органических веществ в наземных биогеоценозах и оценить роль различных групп микроорганизмов на разных стадиях этого процесса.
Цель и задачи исследования
Цель работы - установить специфику почвенных гидролитических прокариотных комплексов, осуществляющих деструкцию полисахаридов (хитина и пектина), выявить закономерности их распространения в наземных экосистемах и зависимость метаболической активности от основных экологических факторов (влажности, температуры, присутствия органических субстратов).
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
-
Оценить разнообразие и определить численность отдельных филогенетических групп прокариотных метаболически активных микроорганизмов - гидролитиков в наземных экосистемах, различающихся параметрами основных экологических факторов.
-
Разработать молекулярные подходы для определения таксономического разнообразия прокариот - гидролитиков (хитина и пектина) и их метаболической активности при различных параметрах основных экологических факторов в наземных экосистемах.
-
Проанализировать динамику функциональных и структурных показателей (дыхание, численность, биомасса) физиологически активных микроорганизмов - гидролитиков в микробных комплексах наземных экосистем.
-
Выявить наиболее активные группы прокариот, участвующие в разложении биополимеров (хитина и пектина) в наземных экосистемах. Выделить и определить видовое разнообразие доминантов гидролитичеких сообществ методами полифазной таксономии, включая использование как фенотипических, так и молекулярно-генетических критериев.
-
Определить в различных условиях лабораторного микрокосма скорости деструкции полисахаридов в почвенных образцах. Установить с помощью математического планирования эксперимента относительную значимость исследуемых экологических факторов и величину отклика микробных гидролитических комплексов на изменение их параметров в структурных и функциональных показателях.
Научная новизна
Впервые выявлены закономерности распространения гидролитических прокариотных комплексов в зависимости от влажности, температуры, окислительно-восстановительного потенциала, определена таксономическая структура комплексов и проведена оценка потенциальной гидролитической активности микробных комплексов наземных экосистем, развивающихся в широкой вариабельности экологических факторов. На основе экофизиологических критериев определена функциональная активность гидролитических
прокариотных микробных комплексов в наземных экосистемах, выявлена степень толерантности исследуемых микробных комплексов к экстремальным параметрам экологических факторов.
Разработана модификация флюоресцентномикроскопического метода анализа гибридизации клеток in situ (FISH) для исследования физиологического и филогенетического положения гидролитических прокариотных группировок вертикальных ярусов наземных экосистем - почвенного, наземного (подстилка) и надземного (филлосфера).
Впервые с использованием метода FISH оценена численность и выявлен филогенетический состав метаболически активных бактериальных гидролитических (хитинолитических и пектинолитических) комплексов наземных экосистем в зависимости от уровня увлажненности, температурного и окислительно-восстановительного режимов. Численность, выявляемая с использованием метода FISH, физиологически активных гидролитических прокариотных комплексов составляет третью часть от численности всех прокариотных организмов надземного (филлосфера) наземного (подстилка) и почвенного ярусов экосистем. Установлено, что деструкция полисахаридов осуществляется преимущественно представителями филогенетических групп Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes и Proteobacteria. Выявлены различия в филогенетической структуре метаболически активных гидролитических прокариотных комплексов пространственно-сукцессионного ряда. Деструкция биополимеров в надземном ярусе осуществляется, главным образом, группой протеобактерий (альфа и бета). В почвенном гидролитическом комплексе уменьшается доля протеобактерий и увеличиваются доли фирмикут и актинобактерий.
Установлено, что в почвенном ярусе уровень увлажненности в заданном диапазоне для некоторых структурных показателей оказывается наиболее значимым фактором среди таких существенных для микробного сообщества параметров, как внесение органических веществ и время. Влажность более значима для деятельности хитинолитического комплекса, чем для пектинолитического. Впервые показано, что наиболее благоприятные условия для микробного разложения хитина складываются при влажности почв, близкой к полной влагоемкости. В глинистых и суглинистых почвах интервал значений влажности, необходимый для интенсивной микробной трансформации хитина шире, чем в песчаных. При увеличении влажности почв увеличивается деятельность мицелиальных бактерий (актиномицетов) в хитинолитическом комплексе. Вместе с
тем впервые показано, что развитие гидролитического комплекса происходило и
при низкой влажности почвы, близкой к влажности завядания растений. Активный рост гидролитиков и, соответственно, разложение полисахаридов осуществлялось даже на водных пленках толщиной 3 нанометра.
Установлена высокая активность (оцениваемая по структурным и функциональным показателям) минорных по биомассе компонентов - мицелиальных и одноклеточных прокариот при гидролизе полисахаридов микробным сообществом вне зависимости от температуры. При этом роль актиномицетов особенно велика в процессах деструкции хитина.
Дыхание почвенного микробного сообщества в широком спектре условий (влажность, температура, поступление органического вещества, сукцессионное время) может существенно контролироваться минорными по биомассе компонентами - мицелиальными и одноклеточными прокариотами, роль которых, очевидно, реализуется их вкладом в регуляцию функционирования микробного сообщества. В процессе деструкции полисахаридов в почве при увеличении как влажности, так и температуры в микробном гидролитическом комплексе заметно возрастает роль прокариотных микроорганизмов, особенно актиномицетов.
С помощью математического планирования показана принципиальная возможность решения оптимизационной задачи с определением оптимальных значений факторов (температуры, влажности и сукцессионного времени) для функционального показателя микробного гидролитического комплекса (дыхания). Практическая значимость
Разработана модификация флюоресцентномикроскопического метода анализа гибридизации клеток in situ (FISH) для определения показателей численности, физиологического состояния и филогенетической принадлежности гидролитических прокариотных комплексов ярусов наземных экосистем - почвенного, наземного (подстилка) и надземного (филлосфера).
Выявлен филогенетический состав метаболически активных гидролитических прокариотных комплексов вертикальных ярусов наземных экосистем в зависимости от экологических факторов.
Проведенная оценка потенциальной гидролитической активности микробных сообществ наземных экосистем, развивающихся в широком диапазоне действия экологических факторов, и анализ их компонентного состава могут быть полезны в разработке и применении хитинсодержащих компостов и биодеградабельного упаковочного материала (биопластика), а также для решения проблемы утилизации хитин- и пектинсодержащих отходов. Полученные данные могут быть использованы в биотехнологии для подбора оптимальных условий при поиске и выделении активных организмов хитино- и пектинолитиков, а также создании биопрепаратов для борьбы с фитопатогенами.
Полученные культуры гидролитиков могут быть использованы с целью утилизации отходов микробиологической, медицинской и пищевой промышленности, а также в качестве средства защиты растений от возбудителей болезней. Познание закономерностей микробного разложения биополимеров даст возможность управлять микробными популяциями, в частности откроет новые перспективы повышения урожайности сельскохозяйственных культур.
Результаты проведенных исследований включены в учебные пособия «Образование и поглощение парниковых газов в почвенных агрегатах» (2006); «Идентификация метаболически активных клеток прокариот в почвах с применением молекулярно-биологического флюоресцентно-микроскопического метода анализа fluorescence in situ hybridisation (FISH)» (2008); «Молекулярно- биологические аспекты исследований в экологии и микробиологии» (2010) и использованы в лекционных курсах по биологии почв, почвенной бактериологии, молекулярной биологии, экологии почвенных микроорганизмов, читаемых на факультете Почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова.
Проведение исследований было поддержано грантами РФФИ (проекты 11- 04-00931а; 11-04-92202-Монг_а; 00-04-49162а; 02-04-49061а; 05-04-49252а; 08-04- 01233а; 06-04-48165а; 03-04-06911(мас); грантами президента РФ для молодых ученых (МК-4000.2005.4 ); грантами президента РФ для поддержки Ведущих научных школ (НШ-1518.2003.4, НШ-8797.2006.4, НШ-2227.2008.4), ФЦНТП «Биологическое разнообразие».
Основные защищаемые положения диссертации
1. Применение молекулярно-биологических методов (FISH) в экологических исследованиях обеспечивает получение более полной информации о таксономическом разнообразии и потенциальной гидролитической активности микробных комплексов наземных экосистем, существующих в широком диапазоне экологических факторов (влажности, температуры, окислительно- восстановительного потенциала, поступления органического вещества). Сочетание двух молекулярно-биологических методов (FISH и DGGE суммарного амплификата фрагментов гена 16S rRNA) обеспечивает возможность информативной оценки различий в структуре доминантных и минорных компонентов гидролитических комплексов, формирующихся в различных ярусах наземных экосистем.
Функциональная деятельность гидролитических микробных комплексов наземных экосистем определяется активностью как доминантного, так и минорного компонента, которые также обладают высокой валовой ферментативной активностью. Деструкция биополимеров в надземном ярусе осуществляется, главным образом, представителями филогенетической группы Proteobacteria (классы альфа и бета). В минеральных горизонтах почвы усиливается роль гидролитических представителей групп Firmicutes и Actinobacteria.
Среди параметров, определяющих функциональную активность гидролитического (хитинолитического) комплекса почвенного яруса (влажность, питательный ресурс, время) наиболее значительным является влажность. Уровень влажности, обусловливающий максимальную активность гидролитического комплекса зависит от типа почвы. Развитие гидролитического микробного комплекса происходит при крайне широком диапазоне влажности - от близкой к полной влагоемкости до близкой к влаге завядания, а также в нанометровых водных пленках.
Функциональная роль мицелиальных актинобактерий в метаболизме хитина заключается, с одной стороны, в активном разложении этого биополимера, а с другой - в регуляции функционирования микробного комплекса посредством продукции биологически активных регуляторных метаболитов, что реализуется в широком диапазоне экологических параметров (влажность, температура, поступление органического вещества, сукцессионное время).
Оценка потенциальной гидролитической активности и анализ компонентного состава микробных сообществ наземных экосистем в широком диапазоне действия экологических факторов могут быть полезны: 1) для разработки и применения хитинсодержащих компостов и биодеградабельного упаковочного материала (биопластика); 2) для решения проблемы утилизации хитин- и пектинсодержащих отходов; 3) для подбора оптимальных условий выделения изолятов хитино- и пектинолитиков и 4) для содания биопрепаратов для борьбы с фитопатогенами.
Апробация работы.
Материалы, вошедшие в диссертацию, были доложены и обсуждены на
международных конференциях и симпозиумах: II (Санкт-Петербург, 1996), III
(Суздаль, 2000), IV (Новосибирск, 2004), V (Ростов-на-Дону, 2008) съездах
Докучаевского общества почвоведов; Национальной конференции с международным участием «Эмиссия и сток парниковых газов на территории Северной Евразии» (Пущино, 2000); Научной конференции "Растение и почва" (Москва, 2001); Iinternational symposium "Functions of soils in the geosphere-biosphere systems" (Moscow, 2001); Международной научной конференции "Экология и биогеохимическая деятельность микроорганизмов" (Одесса, 2001); Международной научной конференции
«Ecosystems of Mongolia and frontier areas of adjacent countries: Natural resources, biodiversity and ecological prospects» (Ulan-Bator, 2005); Международной научной конференции "Проблемы сохранения, восстановление и обогащение биоразнообразия в условиях антропогенно измененной среды", (Кривой Рог, 2005); 18th World Congress of Soil Science (Philadelphia, 2006);10th International Conference on Chitin & Chitosan (Montpellier, 2006); 14th International Symposium on the Biology of Actinomycetes (Sunday, 2007); X European Workshop on Astrobiology (EANA'2010) (Pushchino, 2010); Доклад на научной конференции «Ломоносовские чтения» (Москва, 2009); Научной конференции «Чтения памяти академика В.Е. Соколова» (Москва,2009); на заседании кафедры в Институте почвоведения и оценки земель университета Хохенхайм (Штутгарт, 2010), на заседаниях кафедры биологии почв факультета Почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова.
Публикации. Материалы диссертации содержатся в 90 печатных работах: 2 коллективные монографии, 35 экспериментальных статей (в том числе обзоры), опубликованных в реферируемых журналах, входящих в список ВАК, 6 учебных пособий и 47 тезисов докладов на Международных и Всероссийских симпозиумах и конференциях.
Объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на 300 страницах, содержат 109 рисунков, 20 таблиц. Список литературы включает 306 источников, из них 237 зарубежные.
Место проведения работы. Основная часть работы проводилась на кафедре биологии почв факультета почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова с 2000 по 2011 г. В работе использованы материалы, полученные в соавторстве с аспирантами и студентами, выполнявшими свои исследования под руководством автора.
Автор выражает глубокую признательность и благодарность всем коллегам - соавторам публикаций, принимавшим участие в представленной работе на различных этапах ее выполнения. Особую благодарность автор выражает своим учителям и наставникам - д.б.н., проф. Д.Г.Звягинцеву, д.б.н, чл.-корр. РАН И.Ю.Чернову, д.б.н. П.А.Кожевину, д.б.н., проф. А.Л.Степанову, д.б.н., проф. М.М.Умарову, д.б.н., проф. Г.М.Зеновой, д.б.н., проф. И.И.Судницыну, д.б.н., проф. А.В.Смагину, к.б.н., вед. научн. сотр. Т.Г.Добровольской, д.б.н. Л.В.Лысак, д.б.н. Л.М.Полянской, д.б.н. О.Е.Марфениной, к.б.н. И.К.Кравченко.