Гетерологичная экспрессия микробных генов фитаз в растениях arabidopsis thaliana НЯМСУРЭН ЧУЛУУНЦЭЦЭГ

Содержание к диссертации

Введение

Обзор литературы 11

1. Фитат Ош-инозитол гексакисфосфат), его комплексы и распространение в природе 11

2. Фитазы - группа специфических фосфогидролаз

2.1. Продуценты фитаз 14

2.2. Классификация и характеристика фитаз 18

3. Трансгенные растения с интегрированными генами микробных фитаз 27

3.1. Экспрессия генов микробных фитаз в растениях 28

3.2. Эффективные системы экспрессии рекомбинантных фитаз в трансгенных растениях 35

4. Свойства рекомбинантных белков 36

5. Влияние рекомбинантных фитаз на растительный организм 39

Заключение 41

Экспериментальная часть 43

Материалы и методы 43

1. Растения Arabidopsis thaliana 43

2. Штаммы бактерий и плазмиды 44

3. Плазмиды и конструкции экспрессионных систем 45

4. Трансформация клеток Agrobacterium tumefaciens GV3101 и E.coli DH5a 47

5. Трансформация растений Arabidopsis thaliana 47

6. Выделение геномной ДНК растений 48 7. Выделение тотальной РНК растений 49

8. Получение кДНК 49

9. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 10. Электрофорез ДНК 51

11. Выделение белковых фракции из тканей растений 54

12. Электрофорез в ПААГ 54

13. Вестерн-блоттинг 55

14. Определение фитазной активности 56

15. Измерение сухого веса тканей растений и определение содержания тканевого фосфора в побегах растений 57

16. Измерение морфологических параметров растений 58

17. Математическая обработка результатов 59

Результаты исследований 60

1. Получение растений Arabidopsis thaliana с интегрироваными генами бактериальных фитаз 60

1.1. Создание гетерологичной системы экспрессии 60

1.2. Селекция трансгенных растений

3. Экспрессия модифицированного гена фитазы на уровне транскрипции 66

4. Иммуноблотинг продуктов экспрессии генов микробных фитаз в клетках корней растений 68

5. Фитазная активность в корнях трансгенных растений A. thaliana 69

6. Влияние микробных фитаз на морфологию трансгенных растений 6.1. Влияние микробных фитаз на морфологию листьев 72

6.2. Влияние экспрессии микробных фитаз на содержание фосфора в листьях растений 76

6.3. Анализ влияния экспрессии микробных фитаз на морфологию корней ОБСУЖДЕНИЕ результатов 83

Заключение 92

Список литературы 94

• Фитазы - группа специфических фосфогидролаз
• Эффективные системы экспрессии рекомбинантных фитаз в трансгенных растениях
• Трансформация клеток Agrobacterium tumefaciens GV3101 и E.coli DH5a
• Измерение сухого веса тканей растений и определение содержания тканевого фосфора в побегах растений

Введение к работе

Актуальность работы. Фосфор играет важную роль во многих
метаболических и энергетических процессах всех живых организмов и является
важным источником питания животных и растений. В почве большая часть
фосфора представлена в форме нерастворимых органических соединений –
фитатов (мио-инозитол гексакифосфоатов), которые являются главным
лимитирующим фактором роста и развития растений (Ma et al., 2012). В отличие
от растений, многие микроорганизмы, бактерии и микромицеты, способны
разрушать труднодоступные для высших эукариот фитаты (Ахметова с соавт.
2012, Greiner et al., 2011). Это обеспечивается их способностью синтезировать
специфические ферменты – фитазы (мио-инозитол гексакифосфат

фосфогидролазы), разрушающие фитаты почвы (Yao et al., 2011, Сулейманова с соавт., 2012). Хотя фитазы образуются в клетках некоторых растений и животных, их каталитическая активность невелика (Gontia et al., 2012).

Использование фитаз микробного происхождения в решении проблемы
фосфорного питания представляет ведущее направление в современной
практической микробиологии. Такие работы выполнены преимущественно с
использованием генов грибных фитаз. Секвенирование большого числа
бактериальных геномов показало широкое распространение генов фитаз у
бактерий. Среди них почвенные бактерии рода Pantoae продуцируют
гистидиновые кислые фитазы и секретируют их в периплазму (Greiner, 2007).
Перспективы также связаны с использованием внеклеточных фитаз -
пропеллерного типа (BPP), встречающихся у представителей почвенных
грамположительных бактерий рода Bacillus. BPP-фитазы устойчивы к высоким
температурам, активны в нейтральном (физиологическом) диапазоне pH и
обладают узкой субстратной специфичностью в отношении фитата, в связи с
чем, бациллярные фитазы являются важным объектом для микробной
биотехнологии (Fu et al., 2008b). Разработаны различные способы получения
генно-модифицированных растений. Эффективным методом является

агробактериальная трансформация растений, основанная на природной
способности бактерий рода Agrobacterium встраивать собственные гены в геном
растительного организма. Перспективно клонирование генов различных
бактериальных фитаз в Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens с последующей
трансформацией растений. Гетерологичная экспрессия бактериальных фитаз и
секреция ферментов в ризосферу позволят повысить доступность фосфора для
растений. Решение проблемы обеспечения культурных растений

неорганическим фосфатом без использования дополнительных ресурсов в виде минеральных удобрений представляет практический интерес для сельского хозяйства.

Цель исследования – разработка гетерологичных систем на основе генов бактериальных фитаз и анализ их экспрессии в растениях Arabidopsis thaliana.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Получить трансгенные растения Arabidopsis thaliana с интегрированными генами микробных фитаз Bacillus ginsengihumi и Pantoae agglomerans под контролем растительного промотора Pht1;2.

2. Установить экспрессию генов бактериальных фитаз Bacillus ginsengihumi и Pantoae agglomerans в трансгенных растениях.

3. Определить активность бактериальных фитаз при выращивании растений на средах с разными источниками фосфора (с фитатом или неорганическим фосфатом в качестве единственного источника фосфора).

4. Определить влияние экспрессии микробных фитаз на количество общего неорганического фосфора в тканях растений при выращивании растений на средах с фитатом и с неорганическим фосфором.

5. Изучить влияние экспрессии микробных генов фитаз на рост и развитие растений.

Научная новизна. Получены новые знания о гетерологичной экспрессии
микробных фитаз растениями, о влиянии бактериальных фитаз на способность
растений расти в условиях лимитирования по источнику фосфора. Впервые
получены гетерологичные системы экспрессии на основе бактериальных фитаз
B.ginsengihumi и P. agglomerans с использованием растительного

индуцибельного промотора с направленной тканеспецифичной экспрессией. Впервые дана комплексная оценка гетерологичной экспрессии генов микробных фитаз B.ginsengihumi и P. agglomerans, относящихся к различным группам, гистидиновым кислым и щелочным бета-пропеллерным фосфогидролазам, в растениях. Установлены экспрессия и локализация бактериальных фитаз B.ginsengihumi и P. agglomerans в корнях растений A. thaliana, что позволило растениям усваивать фосфор из труднодоступного органического соединения почвы – фитата. Получены приоритетные данные о влиянии модификации на характеристики растений, их рост и развитие.

Практическая значимость работы. Нами разработана новая

экспрессионная система на основе генов бактериальных фитаз с использованием растительного индуцибельного промотора и растительного сигнального пептида для целевой экспрессии гетерологичных белков в ризосфере растений. Растения, синтезирующие бактериальные фитазы, эффективно растут на среде с труднодоступным фитатом в качестве основного источника фосфора без дополнительного внесения фосфатов. Практическая значимость разработанного нами метода заключается в потенциальном снижении затрат на выращивание культурных растений в лимитированных условиях за счет отказа от применения минеральных удобрений и повышении рентабельности сельскохозяйственного производства.

Положения, выносимые на защиту:

6. Созданы гетерологичные системы экспрессии на основе генов бактериальных фитаз B.ginsengihumi и P. agglomerans для агробактериальной трансформации растений.

7. Получены растения Arabidopsis thaliana, направленно экспрессирующие бактериальные фитазы в клеточной стенке корней.

3. Модифицированные растения способны расти на среде с фитатом в качестве единственного источника фосфора, экспрессия микробных фитаз способствует улучшению роста и развития растений.

Степень достоверности результатов проведенных исследований
подтверждается большим объемом многократных лабораторных

экспериментов, выполненных и анализированных на современных

высокоточных приборах; опубликованием полученных данных в отечественных и зарубежных журналах, с рецензированием ведущими учеными в данной области.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на
Международных, Всероссийских и региональных конференциях:

Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные и
прикладные аспекты биотехнологии» (Иркутск, 2015), Международной научно-
практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии,
лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012, 2014), Всероссийской
школеконференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Материалы и
технологии XXI века» (Казань, 2013, 2012, 2014), 18-й Международной
Пущинской школе-конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ – НАУКА ХХI
ВЕКА» (Пущино, 2013, 2014), Конгрессе Федерации европейских
биохимических обществ (FEBS) «Биологические механизмы» (Санкт-
Петербург, 2013), Молодежной научной конференции «Биотехнология в
растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2013), ХIХ и ХХ
Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых:
«Михаил Ломоносов», (Москва, МГУ, 2012, 2013), ХХ Международной
конференции «Биология клеток растений in vitro и Биотехнология» (Казань,
2013), Всероссийской научной конференции с международным участием
«Инновационные направления современной физиологии растений» (Москва,
2013), Международной конференции «Современное состояние тенденций
научных исследований, искусственных и естественных нанообъектов –
STRANN-2012» (Россия 2012), III Ежегодной международной научно-
практической конференции бакалавров, магистров и аспирантов в биологии,
посвященной академику П. Кометиани (Грузия, 2011), Итоговой научно-
образовательной конференции студентов Казанского (Приволжского)
федерального университета (Казань 2011).

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности «Казанского (Приволжского) федерального университета» среди ведущих мировых научно–исследовательских центров, в рамках Open Lab «Микробные биотехнологии», а также, частично, за счет средств субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности (проект №14-83 0211/02.11.10083.001). Исследования выполнены при поддержке грантов: РФФИ 12-08-00942-а, гранта для молодых ученых от Академии наук республики Татарстан № 13-24/2011, Федеральной целевой программы

«Научные и научно - педагогические кадры инновационной России» 2009-2013гг.: ГК № П344, ГК № П406, ГК № П323, ГК № 815, ГК № 1053, ГК № 14.А18.21.0575.

Личный вклад автора заключается в разработке основной проблемы исследования, планировании, организации и реализации ее экспериментального решения, интерпретации полученных результатов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 29 научных работ, в том числе, 6 статей в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК для публикации материалов диссертации, 1 учебно-методическое пособие.

Структура и объём диссертации. Диссертация включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов, заключение и список литературы. Работа изложена на 93 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 19 рисунков. Библиография содержит 134 наименования статей российских и зарубежных авторов.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д.б.н., профессору ИФМиБ М.Р. Шариповой за постановку проблемы, обсуждение результатов и внимательное отношение к работе, в.н.с, Ph.D. in Biochemistry, Е.В. Шакирову за постоянные консультации, помощь в освоении новых методов и обсуждение полученных результатов, м.н.с. Л.Р. Валеевой за поддержку и помощь в работе. Автор выражает искреннюю благодарность всем сотрудникам кафедры и лаборатории за всестороннюю помощь и доброжелательную рабочую атмосферу.

Штаммы бактерий и плазмиды. В работе использовали штаммы Bacillus ginsengihumi, Pantoae agglomerans и E. coli DH5a из музея кафедры микробиологии КФУ. Штамм Е. coli DH5a использовали для получения гетерологичных систем экспрессии бактериальных генов фитаз. Бактерии Agrobacterium tumefaciens GV3101 и плазмида pCBK05 для трансформации растений любезно предоставлены для работы Е. В. Шакировым (University of Texas at Austin, Austin USA). В качестве векторов экспрессии использовали плазмиды pСEV01, pCEV02, pCEV03, которые получили на основе вектора pCBK05 (рис. 1 А, Б, В).

Для культивирования бактерий использовали среду LB (%): триптон - 1.0; дрожжевой экстракт - 0.5; NaCl - 0.5; pH 8.5 (Sambrook et al., 1989). Рост бактерий оценивали по изменению оптической плотности культуры на фотоэлектрокалориметре КФК-2 при =590 нм. Количество биомассы выражали в единицах оптической плотности. Стерилизацию сред проводили при 1 атм в течение 30 мин. Перед стерилизацией рН среды доводили 40%-ным раствором NaOH до значения рН 8.5.

Рисунок 1 – Cхема Т-ДНК в составе плазмид A. tumefaciens для трансформации растений арабидопсиса. А – вектор pCEV01 с растительным промотором Pht1;2, Б – вектор pCEV02 с промотором Pht1;2 и геном фитазы B. ginsengihumi, В – вектор pCEV03 с промотором Pht1;2 и геном фитазы P. agglomerans, P_pht1;2 – индуцибельный тканеспецифичный промотор гена фосфатного транспортера эпителиальных клеток корней A. thaliana; SP_E –сигнальный пептид растительного гена экстенсина; bgPhyC – ген фитазы B. ginsengihumi, paPhyC – ген фитазы P. agglomerans; His-Strep-Tags – 3’-концевые последовательности пептидных тагов; ген bar – ген устойчивости к гербициду BASTA; Р_nos и Т_nos - промотор и терминатор гена нопалинсинтазы (nos); П и Л – правая и левая фланкирующие последовательности Т-ДНК, соответственно; PstI, BamHI, SpeI – сайты рестрикции.

Трансформацию бактерий Agrobacterium tumefaciens GV3101 проводили методом электропорации. Трансформацию бактерий E.coli DH5 проводили как описано в работе (Sambrook, 1989).

В работе использовали растения Arabidopsis thaliana дикого типа (экотип Columbia, далее WT). Семена любезно предоставлены для работы Е.В. Шакировым (Austin, USA). Растения выращивали в ростовой камере (Binder, Германия). Семена, предварительно выдержанные 2-3 дня при 4 С, высевали в стерильную увлажненную почву. Условия роста A. thaliana: фотопериод 16 ч день / 8 ч ночь, 22 С, влажность воздуха 60%.

Для селекции растений семена высевали стерильно на чашки Петри с использованием среды MS (Мурашига-Скуге) (Murashige-Skoog, 1986) с добавлением гербицида BASTA в концентрации 25 мкг/мл. Для защиты от контаминантной микрофлоры в среду MS вносили антибиотик ванкомицин (100 мкг/ мл). Для анализа экспрессии бактериальных фитаз растения выращивали на стандартной минеральной среде с 0.7 % агаром без добавления источников фосфора (Tocquin et al., 2003).

Для анализа экспрессии бактериальных фитаз модифицированные растения выращивали на гидропонной установке в климатической камере (SANYO, Япония) (Tocquin et al., 2003). В качестве источника фосфора использовали фитат натрия (C₆H₁₈0₂₄P₆ xNa yH₂O) (Sigma) – 133 мкМ, неорганический фосфат (Na₂HPO₄) – 0.8 мM.

Трансформацию растений Arabidopsis thaliana проводили методом макания цветков растений в суспензию бактерий Agrobacterium tumefaciens как описано в работе (Clough, Bent, 1998).

Выделение суммарной РНК растений проводили по стандартной методике с использованием буферов для разрушения растительных клеточных стенок (Cell

lysis buffer, CLB) и осаждения ДНК-белковых комплексов (Protein DNA precipitation buffer. PPB), (Onate-Sanchers, Vicente-Carbajosa, 2008).

Комплементарную ДНК получали по стандартной методике с использованием набора для получения кДНК «RevertAid (H-) FirstStrand» (Fermentas). В качестве праймера использовали последовательность Oligo dT. Полученную общую кДНК растений хранили при -20 С.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в термоциклере «MJ mini» производства фирмы «BioRad» с использованием Taq-полимеразы (Сибэнзим), как описано в работе (Sambrook, 1989)

Для выделения белковых фракций из корней растений использовали метод, описанный в работе (George et al., 2004). Получали фракцию растворимых внутриклеточных белков и фракцию белков, связанных с клеточной стенкой корней. Концентрацию белка определяли по методу Лоури с использованием набора реагентов Protein assay Dc (Bio-Rad). Белковые растворы хранили при -80 С. В белковых фракциях определяли фитазную активность. Для иммуноблотинга белковые фракции концентрировали осаждением 50% ТХУ.

Электрофорез в ПААГ проводили в денатурирующих условиях в присутствии SDS в 12.5%-ном ПААГ по методу Лэммли (Laemmli, 1970). Использовали маркеры PageRuler Prestained Protein Ladder с молекулярной массой от 10 до 170 кДа (Fermentas).

Вестерн-блоттинг проводили как описано в работе (Mahmood et al., 2012). Для проявления мембраны использовали первичные антитела к Нis-tag последовательностям (6x-His Epitope Tag Monoclonal Antibody ThermoScientific) и вторичные антитела, которые специфичны к первичным антителам (Pierce Goat Anti-Mouse IgG, (H+L), Thermo Scientific).

Определение фитазной активности проводили как описано в работе (Jog et al., 2005). За единицу активности принимали количество фермента, гидролизующего в условиях эксперимента 1 мM субстрата за 1 мин.

Определение сухого веса тканей растений и определение содержания тканевого фосфора в побегах растений проводили по методам как описано в работе (Richardson et al., 2001).

Для характеристики морфологических параметров розетки листьев и корни растений фотографировали и проводили измерения с помощью программного обеспечения ImageJ для 10-15 индивидуальных растений каждой линии.

Для статистического анализа экспериментальных данных использовали программу Microsoft Excel 2013. Для описания и сравнения признаков использовали построение 95%-ных доверительных интервалов для средних значений.

Фитазы - группа специфических фосфогидролаз

Актуальность работы. Фосфор играет важную роль во многих метаболических и энергетических процессах всех живых организмов и является важным источником питания животных и растений. В почве большая часть фосфора представлена в форме нерастворимых органических соединений – фитатов (мио-инозитол гексакифосфоатов), которые являются главным лимитирующим фактором роста и развития растений (Ma et al., 2012). В отличие от растений, многие микроорганизмы, бактерии и микромицеты, способны разрушать труднодоступные для высших эукариот фитаты (Ахметова с соавт., 2012, Greiner et al., 2011). Это обеспечивается их способностью синтезировать специфические ферменты – фитазы (мио-инозитол гексакифосфат фосфогидролазы), разрушающие фитаты почвы (Yao et al., 2011, Сулейманова с соавт., 2012). Хотя фитазы образуются в клетках некоторых растений и животных, их каталитическая активность невелика (Gontia et al., 2012).

Использование фитаз микробного происхождения в решении проблемы фосфорного питания представляет ведущее направление в современной практической микробиологии. Такие работы выполнены преимущественно с использованием генов грибных фитаз. Секвенирование большого числа бактериальных геномов показало широкое распространение генов фитаз у бактерий. Среди них почвенные бактерии рода Pantoae продуцируют гистидиновые кислые фитазы и секретируют их в периплазму (Greiner 2007). Перспективы также связаны с использованием внеклеточных фитаз -пропеллерного типа (BPP), встречающихся у представителей почвенных грамположительных бактерий рода Bacillus. BPP-фитазы устойчивы к высоким температурам, активны в нейтральном (физиологическом) диапазоне pH и обладают узкой субстратной специфичностью в отношении фитата, в связи с чем, бациллярные фитазы являются важным объектом для биотехнологии растений (Fu et al., 2008b). Разработаны различные способы получения генно-модифицированных растений. Эффективным методом является агробактериальная трансформация растений, основанная на природной способности бактерий рода Agrobacterium встраивать собственные гены в геном растительного организма. Перспективно клонирование генов различных бактериальных фитаз в Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens с последующей трансформацией растений. Гетерологичная экспрессия бактериальных фитаз и секреция ферментов в ризосферу позволит повысить доступность фосфора для растений. Решение проблемы обеспечения культурных растений неорганическим фосфатом без использования дополнительных ресурсов в виде минеральных удобрений представляет практический интерес для сельского хозяйства.

Цель исследования – разработка гетерологичных систем на основе генов бактериальных фитаз и анализ их экспрессии в растениях Arabidopsis thaliana.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Получить трансгенные растения Arabidopsis thaliana с интегрированными генами микробных фитаз Bacillus ginsengihumi и Pantoae agglomerans под контролем растительного промотора Pht1;2.

2. Установить экспрессию генов бактериальных фитаз Bacillus ginsengihumi и Pantoae agglomerans в трансгенных растениях.

3. Определить активность бактериальных фитаз при выращивании растений на средах с разными источниками фосфора (с фитатом или неорганическим фосфатом в качестве единственного источника фосфора).

4. Определить влияние экспрессии микробных фитаз на количество общего неорганического фосфора в тканях растений при выращивании растений на средах с фитатом и с неорганическим фосфором.

5. Изучить влияние экспрессии микробных генов фитаз на рост и развитие растений.

Научная новизна. Получены новые знания о гетерологичной экспрессии микробных фитаз растениями, о влиянии бактериальных фитаз на способность растений расти в условиях лимитирования по источнику фосфора. Впервые получены гетерологичные системы экспрессии на основе бактериальных фитаз B.ginsengihumi и P. agglomerans с использованием растительного индуцибельного промотора с направленной тканеспецифичной экспрессией. Впервые дана комплексная оценка гетерологичной экспрессии генов микробных фитаз B.ginsengihumi и P. agglomerans, относящихся к различным группам, гистидиновым кислым и щелочным бета-пропеллерным фосфогидролазам, в растениях. Установлены экспрессия и локализация бактериальных фитаз B.ginsengihumi и P. agglomerans в корнях растений A. thaliana, что позволило растениям усваивать фосфор из труднодоступного органического соединения почвы – фитата. Получены приоритетные данные о влиянии модификации на характеристики растений, их рост и развитие.

Практическая значимость работы. Нами разработана новая экспрессионная система на основе генов бактериальных фитаз с использованием растительного индуцибельного промотора и растительного сигнального пептида для целевой экспрессии гетерологичных белков в ризосфере растений. Растения, синтезирующие бактериальные фитазы, эффективно растут на среде с труднодоступным фитатом в качестве основного источника фосфора без дополнительного внесения фосфатов. Практическая значимость разработанного нами метода заключается в потенциальном снижении затрат на выращивание культурных растений в лимитированных условиях за счет отказа от применения минеральных удобрений и повышении рентабельности сельскохозяйственного производства.

Положения, выносимые на защиту: 1. Созданы гетерологичные системы экспрессии на основе генов бактериальных фитаз B.ginsengihumi и P. agglomerans для агробактериальной трансформации растений. 2. Получены растения Arabidopsis thaliana, направленно экспрессирующие бактериальные фитазы в клеточной стенке корней. 3. Модифицированные растения способны расти на среде с фитатом в качестве единственного источника фосфора, экспрессия микробных фитаз способствует улучшению роста и развития растений.

Эффективные системы экспрессии рекомбинантных фитаз в трансгенных растениях

В результате вставки микробного гена в геном растений могут произойти различные изменения как в растительном организме, так и в синтезируемом рекомбинантном белке. Кроме того, даже индивидуальные линии одного вида растений, трансформированных одним геном фитазы, могут обладать различными свойствами (Lung et al., 2005).

В частности, рекомбинантные белки могут приобретать свойства, не характерные для нативной формы. Показано, что в некоторых случаях микробные белки, секретируемые трансгенными растениями, могут иметь иную молекулярную массу, ферментативную активность, рН- и температурный оптимумы. Это связано с тем, что в многоклеточном эукариотическом организме имеют место другие, отличные от характерных для прокариот и низших эукариот, процессы посттрансляционной модификации и созревания белков (Chan et al., 2006; Sylvain et al., 2005). Различия в молекулярной массе часто являются результатом посттрансляционного протеолиза, либо гликозилирования белковой молекулы в клетках растений (Lung et al., 2005). Но, несмотря на изменения биохимических свойств, рекомбинантные фитазы, сохраняли ферментативную активность в клетках трансгенных растений по отношению к фитату (Chan et al., 2006).

Физические и химические свойства белка изменяются в результате N-гликозилирования, что может влиять на фолдинг, стабильность и локализацию молекулы и, таким образом, на биологическую активность (Henquet et al., 2008). Рекомбинантные гликопротеины, экспрессируемые бактериями в виде дегликозилированных белков, не теряли активности (Sylvain et al., 2005). Фитаза микромицета A. niger, экспрессируемая в трансгенных растениях, имела различные сайты N-гликозилирования в зависимости от вида трансформированного растения. Фермент был успешно экспрессирван в рисе (семейство однодольных растений), табаке (двудольное растение, имеющее эндосперм) и люцерне (двудольное, не имеющее эндосперма). Нативная фитаза A. niger представляла мономер с десятью потенциальными сайтами N-гликозилирования с молекулярной массой 85 кДа. Рекомбинантная фитаза, транслируемая в рисе, табаке и люцерне, имела разные молекулярные массы – от 60 до 75 кДа, причем в листьях риса и люцерны образовывались две формы фитазы с молекулярной массой 65 и 75 кДа (Sylvain et al., 2005). Бациллярная фитаза 168phyA активно экспрессировалась в табаке и арабидопсисе, но обнаружены различия, обусловленные гликозилированием рекомбинантной фитазы: нативный фермент имел молекулярную массу 40 кДа, а выделенная из корневого эксудата растений арабидопсиса фитаза обладала большей молекулярной массой – 47 кДа, в то время как рекомбинантный фермент, синтезируемый клетками табака - 44 кДа (Lung et al., 2005).

Установлено, что на активность рекомбинантных фитаз, экспрессируемых трансгенными растениями, большое влияние оказывает и копийность трансгенной вставки в геноме растения. Показано, что трансгенные линии растений, в геноме которых присутствует более одной вставки гена фитазы, обладали более высокой фитазной активностью, чем растения с единичной вставкой. Можно предположить, что это связано с более высокой экспрессией гена фитазы у линий с множественными вставками. Таким образом, многокопийность трансгена ведет к гиперэкспрессии как внутриклеточных, так и внеклеточных фитаз в трансгенных растениях, что повышает уровень фитазной активности в целом и способствует более эффективному расщеплению фитата. Показано, что у линий трансгенных растений с тремя и четырьмя копиями трансгена фитазная активность выше по сравнению с другими линиями с меньшим количеством вставок (Hong et al., 2004). Получены трансгенные линии рапса с разной копийностью трансгенов в геноме, экспрессирующие фитазы E.coli и A.niger. Причем растения с двумя (ген A. niger) или тремя (E. coli) вставками обладали высокой фитазной активностью, тогда как фитазная активность линии с одной копией гена фитазы A. niger мало отличалась от контрольной линии дикого типа (Wang et al., 2012). Также установлено, что в семенах трансгенной кукурузы, несущей две копии гена фитазы phyA2 из A. niger, экспрессия фитазы выше по сравнению с однокопийными линиями растений (Chen et al., 2008). Показано, что температурный оптимум экспрессируемой в арабидопсисе бациллярной фитазы понизился с 60 до 45-50 С, а рН-оптимум сдвинулся в щелочную сторону (от рН 5.5 к 6.0) (Chan et al., 2006). Однако другие рекомбинантные фитазы сохраняли сходство с нативными ферментами. Так, фитазаA. niger, экспрессируемая различными трансгенными растениями, хотя и менее гликозилирована, имеет тот же температурный и рН-оптимумы, что и нативный фермент (Singh et al., 2011).

Трансформация клеток Agrobacterium tumefaciens GV3101 и E.coli DH5a

Трансформацию Arabidopsis thaliana проводили методом макания цветков растений в суспензию Agrobacterium tumefaciens (Clough and Bent, 1998). Для трансформации выращивали ночную культуру агробактерий. Далее клетки бактерий осаждали центрифугированием при 5500 об/мин. в течение 30 минут. Надосадочная жидкость сливалась. Клетки ресуспендировали в 5% растворе сахарозы с добавлением Silwet L-77.

Каждое растение опускали в суспензию клеток в сахарозе так, чтобы в растворе оказались цветы и бутоны. Растения выдерживали в суспензии агробактерий в течение двух минут. Прошедшие трансформацию растения помещали под прозрачную пленку в условия повышенной влажности воздуха для адаптации после воздействия агробактериями. На третьи сутки растения возвращали в стандартные условия выращивания и далее выращивали в тех же условиях, как и до трансформации. После прекращения цветения и образования стручков полив растений прекращали, чтобы ускорить созревание семян.

Выделение геномной ДНК растений проводили по стандартной методике с использованием буфера СТАВ (Tamari et al., 2013). СТАВ-буфер: 2% СТАВ (гексаадециклиметиламмониумбромид), 100 мМ Трис-HCl, 20 мМ ЭДТА, 1.4 М NaCl, 0.2% -меркаптоэтанол, 2 мг протеиназа К (Thermo Scientific). Растительную ткань гомогенизировали с помощью пестика в 600 мкл СТАВ-буфера и инкубировали при 60 С в течение 1 ч. Добавляли 600 мкл хлороформа. перемешивали и осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 13 тыс об/мин. Отбирали 500 мкл супернатанта. добавляли 500 мкл изопропанола. Разделяли смесь центрифугированием 15 мин 13 тыс об/мин и сливали изопропанол. Добавляли 100 мкл 70% этанола, центрифугировали 5 -10 минут при 13 тыс об/мин. Для полного испарения жидкости оставляли пробы открытыми на воздухе при комнатной температуре. Пробы растворяли в 50 мкл воды, с добавлением 1 мкл РНКазы (10мг/мл, thermo scientific) и инкубировали в течение 1ч при 37 С. Готовые пробы хранили при 4 С. Выделение тотальной РНК растений проводили по стандартной методике с использованием буферов для разрушения растительных клеточных стенок (Cell lysis buffer, CLB) и осаждения ДНК-белковых комплексов (Protein DNA precipitation buffer. PPB) (Onate-Sanchers, Vicente-Carbajosa 2008). Буфер для разрушения растительных клеточных стенок (CLB): 2% SDS, 68 мМ цитрат натрия, 132 мМ лиммонная кислота, 1 мМ ЭДТА, Буфер осаждения ДНК-белковых комплексов (PPB): 4 М NaCl, 16 мМ цитрат натрия, 32 мМ лимонная кислота. Растительную ткань (0.25 – 0.3г) растирали пестиком в 600 мкл CLB, выдерживали 5 минут при комнатной температуре. Добавляли 200 мкл PPB. перемешивали и инкубировали 10 минут при 4С. Далее центрифугировали в течение 10 мин при 13 тыс. об/мин. Супернатант отбирали и добавляли 500 мкл изопропанола. Перемешивали и осаждали центрифугированием в течение 4 мин при 13 тыс. об/мин. Супернатант сливали и добавляли 100 мкл 70% этанола, центрифугировали в течение 5 мин при 13 тыс. об/мин. Сливали супернатант и сушили осадок на воздухе при комнатной температуре. Осадок растворяли в 30 мкл дистиллированной безнуклеазной воды (Nuclease-free, ThermoScientific) и добавляли ДНКазу RQI (thermo scientific) для удаления ДНК из пробы. Инкубировали 1 ч при 37С. Реакцию останавливали добавлением 1 мкл 50 мМ ЭГТА, нагревая пробу до 70 С 20 мин. Готовые пробы хранили в морозильной камере при -20 С.

Комплементарную ДНК получали методом обратной транскрипции с использованием набора для получения кДНК «RevertAid (H-) FirstStrand» по стандартной методике (Fermentas). В качестве праймера использовали последовательность OligodT. Полученную общую кДНК растений хранили при -20 С. 9. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Для генотипирования растений, трансформированных векторами pСEVOl, pCEV02, pCEV03, использовали соответствующие комбинации праймеров, описанные в таблице 3. Реакционная смесь для генотипирования объемом 50 мкл содержала 1х Taq Buffer, 2.5 мМ MgCl2, смесь дезоксирибонуклеозидтрифосфатов 0.2 мМ каждого, 10 пикамоль каждого праймера, 1.0 ед. Taq-полимеразы (Сибэнзим) и 1 мкл геномую ДНК. Реакцию амплификации кДНК проводили с помощью термоциклера «MJ mini» производства фирмы «BioRad». Программа для ПЦР: 1) 94оС - 4 мин; 2) 40 циклов (94оС-30 сек, 55оС- 30 сек, 72оС -1 мин (для генов фитаз и гена bar),2 мин (промотора Phtl;2)); 3) 72 оС -10 мин; 4 оС -хранение.

Для подтверждения экспрессии гена микробной фитазы в тканях трансгенных растений на уровне транскрипции проводили ПЦР с кДНК. полученной из общей РНК растений. Реакцию амплификации кДНК проводили с помощью термоциклера «MJ mini» производства фирмы «BioRad». Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 25-100 нг кДНК. Taq Buffer 1 шМ. 2.5 мМ MgCl2. смесь дезоксирибонуклеозидтрифосфатов 0.2 мМ. 10 пикамоль каждого праймера. 1.0 ед. Taq-полимеразы (Сибэнзим). В реакции использовали праймеры к участку в модифицированном гене фитазы, содержащем последовательность экзона и интрона растительного гена РНТ1 ;2 и к внутреннему участку гена фитазы (рис. 6, таблица 4).

Измерение сухого веса тканей растений и определение содержания тканевого фосфора в побегах растений

Определяли фитазную активность в белковых фракциях корней трансгенных растений. Для этого дикий тип и трансгенные линии растений выращивали на гидропонной системе в течение 25-28 дней. В качестве единственного источника фосфора использовали неорганический фосфор (Na2HPO4) или фитат, также растения выращивали в условиях без добавления источников фосфора. На среде без источников фосфора наблюдали ухудшение состояния растений (образование антоцианов в листьях, измельчание листьев). Через 2 недели растения на бесфосфорной среде погибали, что исключило возможность проведения их анализа.

Определяли фитазную активность во внутриклеточных растворимых белкых фракциях корней. На средах с обоими источниками фосфора фитазная активность в растениях дикого типа и линии A125 была в переделах 0.5-2.01 и 0.5-2.6 Ед/мг белка (рис. 13А). У трансгенных растений с геном B. ginsengihumi (К1725) и с геном P. agglomerans (G214) на среде с неорганическим фосфором активность фитазы составляла около 4 Ед/мг. На среде с фитатом активность фитазы у трансгенных растений линии G214 не отличались от дикого типа, тогда как у трансгенных растений линии К1725 составляла до 5 Ед/мг белка (рис. 13А). A

Фитазная актив ность в корнях трансгенных растений. А – 8 растворимая белковая фракция к8орней. Б- фракция белков, связвнных с клеточной стенкой корней, ( P 08.05), WT – Дикий тип растений, A125 – Нулевой контроль, К1725 – тра8н сгенные растений с геном фитазы B. ginsengihumi, G214 – трансгенные растений с геном фитазы P. agglomrens. ( P 0.05). Определяли фитазную активность во фракции белков, связанных с клеточной стенкой корней. На среде с неорганическим фосфором статистически значимых различий в фитазной активности растений линий K1725 и G214 по сравнению с диким типом и нулевым контролем А125 не обнаружили (рис. 13Б). Фитазная активность составила 3.9±1.02 Ед/мг, и 3.4±0.6 Ед/мг, соответственно для К1725 и G214 линий, 1.4±0.7 Ед/мг и 1.5±0.02 Ед/мг для растений дикого типа и линии А125 (рис.13 Б). Однако на среде с фитатом фитазная активность трансгенных растений в 2.5-3 раза выше (Р 0.05) по сравнению с растениями дикого типа и линии А125(нулевой контроль). Фитазная активность у растений линий К1725 и G214 составила 8.5±1.06 и 9.04±1.7 Ед/мг белка, соответственно (рис. 13 Б). Отметим незначительное различие в фитазной активности между линиями трансгенных растений: у растений G214 (paPhyC) линии активность фитазы на 6.3% выше по сравнению с растениями линии K1725 (bgPhyC).

Таким образом, высокая фитазная активность в белковых фракциях клеточной стенки корней трансгенных растений на среде с фитатом свидетельствует об индукции тканеспецифической экспрессии рекомбинантных микробных фитаз в условиях фосфорного голодания. Обе фитазы активны в клеточных стенках трансгенных растений.

Для изучения влияния экспрессии микробных фитаз на морфологию трансгенных растений на среде с различными источниками фосфора использовали гидропонную систему, что позволило контролировать состав среды и исключило отрицательное влияние таких факторов, как гипоксия и другие стрессы, возможные в закрытых стерильных колбах. Также на гидропонной среде возможно получение большого количества тканевого материала без потери в процессе его отбора. Для анализа растений гомозиготные трансгенные линии растений с генами фитаз B. ginsengihumi (К1725) и P. agglomerans (G214), нулевого контроля (A125) и растения дикого типа(WT) выращивали на гидропонной сиcтеме со стандартной средой с добавлением Na2HPO4 или фитат в качестве единственного источника фосфора. Растения выращивали в течение 25-28 дней. Затем проводили анализ морфологии побегов и корневой системы, а также определяли сухой вес растений и содержание неорганического фосфора в тканях растений.

Анализ влияния микробных фитаз на морфологию листьев трансгенных растений проводили на основе следующих параметров: диаметр и площадь розеток, сухой вес розеток и содержание фосфора в них.

Для анализа влияния микробных фитаз на развитие листьев (розетки) индивидуальные растения фотографировали и анализировали с помощью программного приложения ImageJ. Измеряли общую площадь листьев розетки, диаметр розетки. Далее растения высушивали и измеряли сухой вес. Диаметр и площадь листовой розетки. По диаметру и площади листовой розетки на среде с добавлением неорганического фосфата растения трансгенных линий, нулевой трансгенной линии и дикого типа не имели видимых различий. Измерения параметров также показали статистически незначительные различия (Р 0.05) между растениями дикого типа и трансгенными линиями (рис. 14 А, Б). Диаметр розетки в среднем для всех растений составил 3.2 – 4.5 см/растение, общая площадь листовой розетки дикого типа, нулевого контроля А125, трансгенных растений K1725 и G214 составила 6.06, 3.5, 4.9, и 6.6 см2/растение, соответственно (статистических различий нет, P 0.05) (рис. 15А и Б). Однако на среде с фитатом трансгенные растения значительно лучше растут по сравнению с диким типом и А125 линией (рис. 15 А и Б). Диаметр розетки растений дикого типа и линии А125 уменьшался в 2.2 и 1.4 раза, соответственно, по сравнению с растениями, выращенными в присутствии неорганического фосфора, тогда как статистически значимых различий между измеряемыми параметрами для трансгенных линий, выращенными на среде с фитатом или с фосфатом, не обнаружили (3.6 и 3.7 см/растение на среде с фитатом; 3.9 и 4.5 на среде с неорганическим фосфатом для линий K1725 и G214, соотвтетсвенно) (рис. 15А).