Введение к работе
Актуальность дроблены. Биологически активные вещества природного происхождения в настоящее'врєня успешно КОНКУРИРУЮТ в практике с соединениями, синтезированными химически.
Разрабатываемая для использования в медицине в качестве противовирусного (Жданов. 1984) и противоопухолевого средства (Березов. 1973). рибонуклеаза Bacillus lntermedlus, предлагаемая также к использованию в качестве ростостииулятора в биотехнологии и сельском хозяйстве (Захарова и др.. 1939.1991; Егоров и др..1989.1991).достаточно полно изучена с точки зрения структуры, биосинтеза, биохимических, каталитических свойств (Яковлев и др. ,1979; Balaban et al.. 1980). Токсические свойства Фермента на культуре клеток и на уровне целостного организма представлены в работе Сергеевой (1991).
Тем не менее закономерности взаимодействия экзогенных нуклеаз с живой клеткой и вопросы мутагенного действия чистых белков исследованы недостаточно. Известно, что окончательный ответ клетки на действие чужеродного соединения будет обусловлен всем многообразней ответных реакций. Происходит ли проникновение экзогенного чужеродного фернента в клетку; как осуществляется контакт Фермента с неибраной;как функционирует в данной случае система вторичных иессенджеров; пряно или опосредованно происходит возникновение повреждений в ДНК - все эти вопросы относятся к проблеме создания полной картины последовательных этапов мутагенеза, вызываемого экзогенными белками. Бактериальные системы оденки генотоксичности в этом плане кажутся более заслуживающими внимания, чем мы привыкли считать. Конечный определяемый параметр - генотоксичность может служить значимым показателей всей цепи реакций клеточного ответа. Кроме того, классические исследования дозо-зависимых эффектов редко проводятся в области малых концентраций, где зачастую наблюдаются труднообъяснимые эффекты, изучение которых в свою очередь может внести свой вклад в цельное представление о механизме взаимодействия Фермента с клеткой.
В настоящее время известно немало случаев, когда мутагены в малых дозах проявляют аятимутагенные эффекты. Следовательно, особый интерес представляют исследования низких концентраций белковых препаратов, предлагаемых к использованию в каче>-Т5с лекарственных.
На сегодняшний день практически не установлены точные механизмы действия на клетку многих биологически активных веществ, предлагаемых для широкого практического использования. Бактериальная рибонуклеаза, как препарат, имеющий широкий спектр полезного в практическом понимании действия, нуждается в установлении детально определенного механизма взаимодействия с іивой клеткой, начиная от первичных контактов с мембраной, кончая воздействием на геном. Лотэнпиглькые возможности данного препарата изучены далеко не полностью: возможность применения РНКазк как антивирусного препарата имеет определенные перспективы в борьбе с таким серьезным заболеванием, как СПИД.
В с'язи с этин особенно актуальны исследования генетической активности рибонуклеази Bacillus intermedius.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение генотоксических свойств внеклеточной рибонуклеази Bacillus Intermedius 7Р на бактериальных тест-системах, на клеточном уровне в условиях In vitro и на уровне целостного организма (In vivo), а также изучение ее возможной антимутагенной активности. В соответствии с поставленной целью в задачу исследования входило:
-
Исследовать мутагенные свойства РНКазы В. Intermedius в серии бактериальных тестов с метаболической активацией (in vitro) и без нее.
-
Охарактеризовать качественные к количественные показатели исследуемых коммерческих микросомных фракпий.используемых для метаболизма соединений In vitro в микробных тестах.
-
Оценить генотоксическое действие РНКазы по интегральным и специфическим тестам на некоторые этапы мутагенеза и попытаться изучить на этой основе возможный механизм генотокси-ческого действия Фермента на микроорганизмы.
-
Проверить возможность мутагенного действия препарата in vivo, а также на культуре клеток человека in vitro.
-
Провести сравнение генотоксических свойств РИ50НУКЛЄ-азы В. intermedius с близким аналогом - РНКазой реконбинантного штамма Е. сої і НВ 101 РТИ 416 в бактериальных тест-системах.
6. Исследовать антимутагенные свойства РНКазы in vitro.
Научная новизна. В результате проведенных исследований
впервые установлено наличие слабого мутагенного эффекта экзо-
- 5 -генной бактериальной рибонуклеази в серии бактериальных тестов. Метаболическая активация микросомальными фракциями растения и млекопитающих In vitro снижает этот нутагенный эффект.
Изученные генотоксические эффекты рибонуклеазы являются гес-А зависимыми и обусловлены ее способностью вызывать SOS-ответ клетки. Предложена гипотетическая схема возможного нехакизма генотоксического действия Ферментного препарата. В ходе исследований показано, что генотоксические свойства исследуемого препарата главным образом связаны с Еативной структурой белка.
Впервые изучены антииутагенные свойства Фермента в ряде модифицированных микробных тестов, показано наличие протекционных свойств рибонуклеази в низких концентрациях.
Практическая значимость. Полученные результаты по мутагенности и антимутагенности рибонуклеазы микробного происхождения вносят определенный вклад в создание конкретной схены биохимических реакций и процессов, происходящих в результате взаимодействия экзогенного белка с живой клеткой.
Данные об антимутагенном действии малых доз РНКазы могут быть использованы в разработке схем применения ферментов в комбинированной терапии опухолей, а также в перспективной профилактике лиц, подвергавшихся контакту с мутагенными соединенияии.
Представлены полные биохимические характеристики коммерческих лиоФилизированных Фракций растений и млекопитающих, используемых, в бактериальных тест-системах. Найдены оптимальные условия экспериментов с метаболической активацией in vitro, являйтеся индивидуальными для каждой исследованной Фракции.
апробация работы: Диссертация доложена на совместном заседании кафедры микробиологии. НИЛ биохимии и биоинженерии Ферментов Казанского государственного университета (1993). Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на итоговых научных конференциях КГУ (1990.1991.1992), Всесоюзных конференциях "Нуклеазы и их практическое использование" (Рига.1955: 1969). Конференции молодых ученых "Синтез и иссле- дование биологически активных соединений" (Рига. 1969). Секции генетических аспектов конференции "Человек и биосфера" (Самарканд, 1990).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.
структура и обЪем диссертации. Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста; состоит кз обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 19 таблиц. 15 рисунков, список литературы содержит 191 отечественных и 170 иностранных авторов.