Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 27
1.1 Общие сведения о туляремийном микробе 27
1.2 Таксономия и вирулентность рода FranciseНа 32
1.3 Лабораторная диагностика i7. tularensis 33
1.4 Внутривидовая дифференциация F. tularensis
1.4.1 Генотипирование F. tularensis 36
1.4.2 Генетические основы основных биохимических различий подвидов F. tularensis 47
1.5 Заключение по обзору литературы 59
Результаты исследований 62
Глава 2 Генотипирование штаммов туляремийного микроба 62
2.1 Генотипическая гетерогенность и географическое разнообразие штаммов F. tularensis из коллекции ГНЦ ПМБ по данным VNTR-типирования их ДНК по A. Johansson 62
2.2 Обнаружение F. tularensis subsp. mediasiatica на территории Российской Федерации
2.3 Определение минимального числа VNTR-локусов, позволяющего сохранить разрешающую способность MLVA 75
2.4 Обсуждение и выводы 76
ГЛАВА 3 Изучение генетических основ биохимических различий подвидов туляремийного микроба 77
3.1 Изучение генетических детерминант Р-лактамазной активности F. tularensis 77
3.1.1 Анализ распространененности генов Р-лактамаз и их последовательностей у штаммов разных подвидов F. tularensis 78
3.1.2 Изучение расположения генов Р-лактамаз в геноме штаммов разных подвидов F. tularensis 86
3.1.3 Изучение экспрессии генов Р-лактамаз в культурах F. tularensis штаммов 15 НИИЭГ и 120 Apur 89
3.1.4 Получение и оценка биологических свойств вариантов штамма і7, tularensis 15 НИИЭГ с инактивированными генами Р-лактамаз 89
3.1.5 Получение Ablal и АЫаЗ мутантові7, tularensis 15 НИИЭГ с помощью плазмиды pGM5 90
3.1.6 Получение плазмиды pGM6 91
3.1.7 Получение АЫа2 мутантові7, tularensis 15 НИИЭГ с помощью плазмиды pGM6 92
3.1.8 Оценка ростовых, патогенных и протективных свойств му-тантных шаммов 15АЬ1а2 и 15АЬ1а123 93
3.1.9 Изучение экспрессии мРНК в штаммах с инактивированными генами Р-лактамаз
3.1.10 Изучение чувствительности F. tularensis к антибиотикам класса Р-лактамов 95
3.1.11 Сравнение чувствительности к 3-лактамам штаммов F. tularensis в зависимости от подвидовой принадлежности 96
3.1.12 Определение чувствительности к антибиотикам штаммов F. tularensis с инактивированными генами Р-лактамаз 101
3.1.13 Комплементация чувствительности к ампициллину плазми-дами, несущими маркер ампициллин-резистентности 107
3.1.14 Изучение сравнительной Р-лактамазной активности F. tularensis subsp mediasiatica и holarctica 108
3.2 Изучение генетических основ цитруллинуреидазной активно сти і7, tularensis 116
3.2.1 Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей гена цитруллинуреидазы у представителей рода Fransicella и гетерологичных микроорганизмов с помощью алгоритма UPGMA 117
3.2.2 Сравнение нуклеотидных последовательностей генов цитруллинуреидазы штаммов туляремийного микроба разных подвидов 119
3.2.3 Сравнение аминокислотных последовательностей генов цитруллинуреидазы штаммов туляремийного микроба разных подвидов 1 3.3 Выявление генетических особенностей, потенциально ответственных за устойчивость F. tularensis subsp. holarctica bv. II к эритромицину 126
3.4 Выявление генетических основ различной способности подвидов і7, tularensis к сбраживанию сахарозы 128
3.5 Применение ПЦР для идентификации F. tularensis и ее подви-довой дифференциации в смеси культур и клиническом материале 138
3.6 Изучение возможности одновременного применения прайме-ров комплементарных гену iglC с праймерами chifl в тест-системе для подвидовой идентификации F. tularensis 144
Заключение 146
Выводы 149
Перечень сокращений, условных обозначений, символов, Единиц и терминов 151
Список использованных источников 153
Список работ опубликованных по теме диссертации 1
- Внутривидовая дифференциация F. tularensis
- Обнаружение F. tularensis subsp. mediasiatica на территории Российской Федерации
- Оценка ростовых, патогенных и протективных свойств му-тантных шаммов 15АЬ1а2 и 15АЬ1а123
- Применение ПЦР для идентификации F. tularensis и ее подви-довой дифференциации в смеси культур и клиническом материале
Внутривидовая дифференциация F. tularensis
Для инактивации генов Р-лактамаз нами используется метод гомологичной рекомбинации. Для трансформации использовали плазмиду pGM5, любезно предоставленную А. Н. Мок-риевичем, а также полученную нами на ее основе в данной работе плазмиду pGM6 (таблица 7). Данные плазмиды несут маркер устойчивости к ампициллину и хлорамфениколу, а также ген SacB, продукт которого обеспечивает суицидальность данной плазмиды в клетках F. tularensis при выращивании на среде с сахарозой. В плазмиды были проклонированы лигаты областей генома, фланкирующие соответствующие гены бета-лактамаз размером от 150 до 1500 п.о. В случае с арилсульфатазой использовали лигат 3 и 5 областей гена с введенными стоп-кодонами и сбитой рамкой считывания. Фрагменты ДНК, фланкирующие гены Р-лактамаз у F. tularensis, были наработаны в ПНР с использованием в качестве матрицы ДНК F. hilarensisXb НИИЭГ с использованием пар праймеров, указанных в таблице 9. Полученные ампликоны об-работатывались эндонуклеазами рестрикции BamHI и Bglll, в зависимости от того, какой сайт рестрикции содержался в праймерах, и попарно лигировали между собой, после чего продукт лигирования был обработан эндонуклеазой рестрикции Sail. После этого полученные фрагменты разделяли электрофорезом в 1%- агарозном геле при 180В в течении 45 минут, что позволяло отделить целевой фрагмент, представляющий из себя лигат 5 и 3 - фланкирующих ген областей ( так называемых левого и правого плеча ) от димеров этих плеч. После очистки из геля целевые фрагменты, фланкированные сайтами рестрикции для Sail лигировали с предварительно обработанной этой рестриктазой плазмидой pGM5, либо с обработанной рестриктазой Xhol плазмидой pGM6 при молярном соотношении вектора и вставки 1:1. После этого лигазной смесью трансформировали E.coli DH5d или F. tularensis\5 НИИЭГ. Отбор клонов, несущих плазмиду, проводили на FT-arape с хлорамфениколом (5 мг/л). Из отобранных клонов E.coli DH5d плазмида затем вновь выделялась и использовалась для трансформации F. tularensisl5 НИИЭГ
Выявление клонов, содержащих плазмиду с целевой вставкой проводили методом ПНР, используя лизаты клеток в качестве матрицы с соответствующими праймерами (таблица 9). При этом у несущих плазмиду клонов кроме фрагмента, амплифицирующегося с хромосомы и содержащего целевой ген, выявлялся дополнительный ампликон меньшего размера. Разница в размере соответствовала размеру делеции целевого гена. Отобранные клоны растили на FT-агаре, содержащем 5% сахарозы с последующим отбором клонов, утративших плазмиду. Полученные единичные колонии подвергали скриннингу методом ПЦР. При этом у клонов, утративших ген в результате гомологичной рекомбинации, выявлялся ампликон меньшего размера по сравнению с клонами, содержащими исходный неделетированный ген. Для подтверждения корректности структуры полученных мутантов использовали дополнительный вариант ПЦР с помощью праймеров, комплементарным внутренним областям целевого гена.
Определение устойчивости к антибиотикам диско-диффузионным методом Из суточной агаровой культуры F. tularensis готовили миллиардную микробную взвесь в забуференном физиологическом растворе с использованием стандарта мутности ОСО, 1 мл взвеси наносили на поверхность чашек с подсушенным FT-агаром, посредством покачивания чашки культуру равномерно распределяли по поверхности среды с последующим отсасыванием избытка жидкости пипеткой. Засеянные чашки 5-10 мин подсушивали, затем на поверхность среды накладывали стандартные диски с антибиотиками с антибиотиками (ОХОШ). Диски располагали на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии и 2-2,5 см от края чашки. Через 24 часа измеряли зоны торможения роста бактериальной культуры вокруг соответствующих дисков с антибиотиками.
Определение устойчивости к антибиотикам методом серийных разведений Для проведения теста в 96-луночных полипропиленовых микропланшетах готовили двукратные разведения антибиотиков в объеме 100 мкл. Антибиотики использовали в концентрациях от 2 до 10 000 мг/л.
Взвесь микроорганизмов для исследования готовили из суточной агаровой культуры F. tularensis на забуференном физиологическом растворе по стандарту мутности в концентрации 5x10 м.к./мл и разводили в 25 раз жидкой питательной средой для туляремийного микроба до концентрации 2x10 м.к./мл. Затем в каждую лунку приготовленных планшетов с разведениями антибиотиков добавляли по 100 мкл бактериальной суспензии. Таким образом, конечная концентрация микробных клеток составляла 1x10 м.к./мл, а конечные концентрации ампициллина - от 1 до 5000 мг/л. Микропланшеты инкубировали при температуре 37 С в течение 24 часов для роста культуры F. tularensis. Чувствительность к антибиотикам мутантных и исходного штамма сравнивали по степени бактерицидного эффекта после инкубации клеток туляремийного микроба в присутствии антибиотика. Для этого мы использовали колориметрический тест МТТ, основанный на способности мембранных дегидрогеназ восстанавливать желтую соль МТТ (3-(4,5-диметитиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид) до синего формазана. Данная реакция происходит только в живых клетках с активными ферментами. Степень синей окраски в лунке коррелирует с количеством живых туляремийных клеток.
После 24 часовой инкубации во все лунки 96-луночного планшета добавляли по 10 мкл раствора МТТ в забуференном физиологическом растворе (5 мг/мл) и дополнительно инкубировали в течение 4 ч при температуре 37 С, затем содержимое лунок растворяли добавлением 50 мкл 10%- ного раствора додецилсульфата натрия, приготовленном на 0,01 М соляной кислоте, и измеряли оптическую плотность полученного лизата при длине волны 595 на многоканальном спектрофотометре (Пикон, Россия). Бактерицидный эффект рассчитывали как процент живых клеток в лунках с антибиотиком, по сравнению с контрольными лунками без антибиотика: процент живых клеток = OD595a6 / ОВ595КОНТроль х 100.
Штаммы F. tularensis растили ночь в жидкой питательной среде, половину проб выращивали в присутствии ампициллина (200 мг/л). Через 24 часа половину объема каждой пробы отбирали отдельно и готовили осветленные ультразвуковые лизаты.
Затем жидкую питательную среду с нитроцефином (500 мг/л) вносили в 96-лун планшет по 100 мкл, добавляли в каждую лунку по 100 мкл культуры F. tularensis или осветленного лизата, ставили планшет в термостатируемую ячейку планшетного спектофотометра при температуре 37 С и немедленно измеряли оптическую плотность (абсорбцию ) при 495 нм. Затем проводили измерение оптической плотности каждый час в течение суток.
Определение цитруллинуреидазной активности Цитруллинуреидазная активность F. tularensis определялась в цветной реакции с с нин-гидрином по методу, предложенному Родионовой [28], основанной на на способности фермента цитруллинуреидазы разлагать цитруллин до орнитина, который в реакции с нингидриновым реактивом дает розовое окрашивание [10]. Для этого к густой суспензии F. TULARENSIS (10 м.к./мл) в фосфатном буфере (рН 6,5) добавляли равный объем 0,7 % раствора цитруллина и инкубировали при 30 С в течение 20 ч. Затем 10 мкл суспензии добавляли в 490 мкл свежего нингидринового реактива, кипятили 1 час на водяной бане и при появлении розовой окраски диагностировали цитруллинуреидазную активность. В качестве положительного контроля при этом использовали заведомо обладающий активностью штамм F. tularensis Schu. Нингидрино-вый реактив готовили в день эксперимента растворением 625 мг нингидрина в 10 мл 6 М Н3РО4 и 15 мл ледяной уксусной кислоты при нагревании в течение нескольких минут.
Обнаружение F. tularensis subsp. mediasiatica на территории Российской Федерации
Известно, что сахароза используется некоторыми бактериями в качестве источника углерода и энергии. Гидролиз сахарозы может проходить как внутриклеточно, так и внеклеточно, либо же она полимеризуется внеклеточными ферментами. Эти полимеры могут играть роль в обеспечении патогенности микроорганизма или служить источником энергии при истощении пула других питательных веществ [53, 84].
Среди бактерий способность использовать сахарозу варьирует и может распространяться мобильными генетическими элементами. Например, показано, что бактерии рода Salmonella, а также Е. coli, могут приобретать данный признак с конъюгативной плазмидой pUR400 Salmonella enterica serovar Typhimurium [53] и транспозоном CTnscr94 [96].
У бактерий в транспорте сахарозы и другие углеводов в клетку участвуют специфические мембранные транспортные белки. Мезофильные бактерии транспортируют углеводы в клетки с помощью различных механизмов, в том числе катион- или протон-зависимых транспортеров, ABC-транспортеров, и фосфоенолпируват-зависимой фосфотрансферазной системы (PTS). Археи и термофильные бактерии утеряли PTS и используют ABC-транспортеры для транспортировки углеводов [109, 130, 154, 193].
Гены катаболизма сахарозы организованы в катаболические опероны, образующие регу-лоны. Они экспрессируются только в присутствии сахарозы и при отсутствии более предпочтительных источников углерода и энергии. Регуляция происходит на уровне транскрипции и осуществляется путем катаболитной репрессии.
PTS система катаболизма Сахаров у бактерий состоит из двух цитоплазматических белков EI и НРг, и сахароспецифической пермеазы, описываемой, как ферментативный комплекс EII. EI катализирует перенос фосфорильной группы фосфоенолпирувата на остаток гистидина белка НРг. Белок ЕП катализирует перенос этой фосфорильной группы от НРг к транслоци-рующемуся через мембрану сахару с образованием его производного. Сахароспецифические пермеазы ЕП у разных организмов могут быть представлены либо одним полипептидом, либо комплексом из двух или трех полипептидных цепей [130, 154]. ЕП могут работать в комплексе с другими сахароспецифическими мембрано-ассоциированными белками ЕШ. Поступающий в клетку сахарозо-б-фосфат-Р-Б-фруктофуранозид затем расщепляется фруктогидролазой (ин-вертазой, К.Ф. 3.2.1.26) на P-D-фруктозу и a-D-глюкозо-б-фосфат [166].
У Е. coli описан также хромосомно-кодируемый кластер катаболизма сахарозы - esc ре-гулон, кодирующий альтернативный PTS путь сбраживания сахарозы. В состав esc регулона входят 4 отрытые рамки считывания, кодирующие: пермеазу CscB, инвертазу CscA, фруктокиназу CscK и негативный регулятор транскрипции CscR, который репрессирует транскрипцию в отсутствие сахарозы и при низких концентрациях сахарозы ( 2 г/л) [48, 103]. Пермеаза CscB транспортирует сахарозу в клетку, внутриклеточная сахароза затем расщепляется до глюкозы и фруктозы белком CscA, представляющим собой инвертазу. Эти два сахара затем фосфорилируются в глюкозо-6-фосфат и фруктозо-6-фосфат с помощью глюкокиназы и CscK, соответственно. Фосфорилированные сахара затем используются в гликолизе [159].
Альтернативный механизм метаболизма сахарозы был описан для Agrobacterium tumefaciens. Сахароза транспортируется в периплазму, где под действием D-глюкозид-З-дегидрогеназы образуется 3-кетосахароза, которая затем поступает в цитоплазму, где гидроли-зуется а-3-кетоглюкозидазой до 3-кетоглюкозы и фруктозы. 3-кетоглюкоза может быть преобразована в глюкозу с помощью 3-кетоглюкозо редуктазы [167].
Таким образом, основным этапом катаболизма сахарозы является ее гидролиз (или же ее производных), в подавляющем большинстве случаев осуществляемый инвертазами (КФ 3.2.1.26; Р-фруктофуранозидазы) [http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/].
Как было сказано выше, утилизация сахарозы является одним из признаков, используемым для внутривидовой диагностики F. tularensis. Однако, обеспечивающие этот диагностический признак различия в активности тех или иных ферментативных систем, как и обуславливающие их генетические различия, до сих пор не освещены в научной литературе.
Следующим диагностически важным признаком типирования F. tularensis является чувствительность к эритромицину.
Туляремийный микроб чувствителен к данному антибиотику, и только внутри голарктического подвида выделяется биологический вариант F. tularensis, резистентный к эритромицину (биовар II, в отличие от чувствительного биовара I).
Известно, что бактерии противостоят действию макролидных антибиотиков, к которым относится эритромицин тремя способами: (1) - модификации в рибосоме целевого сайта связывания с антибиотиком (метилирование или мутации), (2) - активный транспорт антибиотика из клетки, (3) - ферментативная инактивация препарата. Эти механизмы были найдены у продуцентов макролидов и линкозамидов, которые часто сочетают несколько подходов, чтобы защитить себя от производимого ими антимикробного препарата. У патогенных микроорганизмов воздействие этих трех механизмов по-разному влияет на устойчивость к макролидам. Так, модификация рибосомы придает устойчивость к широкому спектру макролидов и линкозамидов, в то время как эффлюкс и инактивация антибиотиков оказывают влияние на устойчивость лишь к некоторым из них [116]. S.Biswas на основе сравнения нуклеотидной последовательности генов 23S-PHK 7 штаммов разных подвидов туляремийного микроба предположил, что причиной устойчивости к эритромицину у единственного исследованного резистентного штамма - F. tularensis subsp. holarctica LVS - может служить замена А на С в 2052 положении [47]. Проведенные позже В. Gestin исследования спонтанных мутантов 10 штаммов I биовара голарктического подвида, пробредших устойчивость к макролидам показали замены в 2057 (А на Т),2058 (А на G и А на Т), и 2611 (С на Т) положениях гена 23S-PHK, что поставило вопрос о роли аналогичных замен в устойчивости к эритромицину штаммов Егуг (II) биовара голарктического подвида [85].
Таким образом, влияние на резистентность к эритромицину отдельных нуклеотидных замен в гене 23S-PHK у F. tularensis показано лишь на примере 10 спонтанно пробредших устойчивость к нему мутантов, и одного изначально устойчивого штамма. Очевидно, что такая выборка не является репрезентативной, следовательно для решения вопроса о механизме эрит-ромицинустойчивости F. tularensis subsp. holarctica bv. II требуется проведение исследований на достаточном количестве штаммов данного биовара.
Бета -лактамазная активность F. tularensis является одним из основных диагностических признаковм для дифференциации среднеазиатского подвида, так как это единственный подвид туляремийного микроба, не обладающий ею.
Бета-лактамазная активность микроорганизмов определяется ферментами, способными расщеплять бета-лактамное кольцо антибиотиков, и потому названными бета-лактамазами. Бе-та-лактамазы, присутствующие в геноме большинства патогенных микроорганизмов, тесно связаны с понятием антибиотикорезистентности.
Открытие антибиотиков явилось одним из самых важных открытий в истории терапевтической медицины, позволившим спасти огромное количество жизней. Эпоха антибиотиков началась в 1929 г., когда Александр Флеминг опубликовал свои наблюдения об ингибировании роста Staphylococcus aureus на чашке с агаром, загрязненной Penicillium notatum [79]. Три года спустя было показано, что ингибирование роста было обусловлено действием вещества, названного пенициллином [63]. Первые клинические испытания с пенициллином были предприняты в 1941 г. [38]. В 1945 г. Hodgkin и Low показали, что он относится к Р-лактамам [67]. Более детально химическая структура пенициллина была изучена в середине 50-х годов, когда было установлено, что основой молекулы пенициллина является 6-аминопенициллановая кислота, состоящая из двух колец: тиазолидинового и Р-лактамного [157]. Модификация Р-лактамного кольца путем присоединения боковых цепей послужила отправной точкой для создания новых представителей данного класса антибиотиков (рисунок 3). В течение следующих лет широко применялись природные, синтетические и полусинтетические Р-лактамы, включая цефалоспорины, карбапенемы, клавуланат, монобактамы и пенемы.
Оценка ростовых, патогенных и протективных свойств му-тантных шаммов 15АЬ1а2 и 15АЬ1а123
Схема получения АЫа2 мутантов была такой же, как и при получении штаммов с деле-циями генов других Р-лактамаз. Единственным отличием было то, что клонируемый фрагмент лигировали с плазмидой pGM6, предварительно обработанной эндонуклеазой рестрикции Xhol при молярном соотношении вектора и вставки 10:1. После этого лигазную смесь вновь подвергали рестрикции Xhol, в расчете на то, что образовавшийся в тех молекулах вектора, которые содержали вставку, гибридный сайт GTCGAG не узнается данным ферментом, в отличии от не несуших вставки молекул вектора, которые при этом линеализуруются, и не способны к репликации внутри трансформированных ими клеток. Эта лигазная смесь использовалась затем для электротрансформации F.tularensis 15 НИИЭГ и полученного ранее штамма F.tularensis 15 НИИЭГАй/а13. После чего нами были отобраны наиболее крупные клоны, кличество которых составляло около 5% среди всех выросших клонов. Последующий ПЦР- анализ отобранных клонов показал, что доля несущих плазмиду со вставкой среди них составляла до 35%, то есть была значительно выше, чем при использовании плазмиды pGM5. Количество клонов, у которых прошла целевая рекомбинация на следующем этапе отбора составляло около 5%. Таким образом, были получены мутантные штаммы с инактивированным геном Ыа2 и тройной мутант с инактивированными генами blaJ, Ыа2, ЫаЗ.
Следует отметить, что эффективность трансформации полученной лигазной смесью клеток E.coli DH5d была невелика (эффективность трансформации около 10 ), однако количество искомых целевых клонов при этом составляло около 60 %, в то время, как при использовании плазмиды pGM5 клоны не вырастали вовсе. Таким образом, можно заключить, что полученная нами плазмида pGM6, и используемый нами метод клонирования являются более пригодными для практического использования, чем использовании плазмиды pGM5. Сравнительная эффективность плазмид pGM5 и pGM6 при проведении гомологичной рекомбинации для других генов нами не проверялась и остается предметом дальнейших исследований.
В итоге нами было отобрано для дальнейшей работы по три клона каждого мутантного штамма с делециями генов Р-лактамаз. Таким образом, нами был получен представительный ряд изогенных мутантов по всем обнаруженным в геноме F. tularensis генам бета-лактамаз, а также двойной и тройной мутанты с инактивированными генами blal, ЫаЗ и blal, Ыа2 и ЫаЗ, соответственно.
Однако, нам не удалось инактивировать ни одним из вышеописанных способов ген арилсульфатазы. Используя метод гомологичной рекомбинации с применением обоих плазмид - pGM5 и pGM6 - мы произвели многочисленные попытки инактивации этого гена путем его полной или частичной делеции, введением в его последовательность стоп-кодонов, сдвигом его рамки считывания. Однако во всех случаях после высева несущих плазмиду клонов на плотную питательную среду с сахарозой, среди выросших колоний не обнаруживалось ни одного клона с целевой рекомбинацией. Более того, при попытке делетировать ген ars совместно с перекрывающимся с ним геном blal, нами в итоге был получен только 1 клон, у которого делетирован лишь ген blal, а ген ars оставался неизмененным, что указывает на то, что данный ген был восстановлен вследствии репарационных процессов. Возможно, активность кодируемого им фермента является жизненно важной для F. tularensis, поэтому инактивация этого гена приводит к тому, что мутантные штаммы не выживают.
Проведение генетических манипуляций с геномом нередко приводит к ослаблению жизнеспособности мутантных штаммов, связанных с неидентифицированными мутациями, неучтенным влиянием инактивированного фермента на метаболизм, и нарушением систем регуляции экспрессии других белков. Поэтому мы изучили основные биологические свойства полученных штаммов F. tularensis с инактивированным геном Ыа2 и с тремя инактивированными генами.
Экспериментальные штаммы не уступали в скорости роста родительскому штамму на жидких и плотных питательных средах и не утратили способности размножаться внутри мышиных макрофагоподобных клеток J774.1A, хотя уровень размножения снизился на порядок (таблица 16). Таблица 16 - Размножение штаммов F. tularensis с инактивированным геном Ыа2 и исходного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ в макрофагах линии J774.A1. Результаты представлены в Logio
Мы сравнивали чувствительность клеток F. tularensis к антибиотикам лактамного ряда, используя микробную взвесь в стандартной концентрации 10 м.к./мл. Поскольку туляремий-ный микроб обладает природной устойчивостью к бета-лактамам, при данном методическом подходе нам не удалось установить величину МИК, поскольку она значительно превышала использованный нами диапазон концентраций ампициллина - от 1 до 2048 мг/л. Поэтому сравнение антибиотикорезистентности обоих штаммов проводили по проценту снижения жизнеспособности микробной суспензии в присутствии различных доз антибиотика (таблица 21). Для определения жизнеспособности мы использовали колориметрический тест МТТ, основанный на способности клеточных дегидрогеназ восстанавливать желтую соль МТТ (3-(4,5-диметитиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид) до синего формазана. Данная реакция происходит только в живых клетках с активными ферментами. Степень синей окраски в лунке коррелирует с количеством живых микробных клеток, что подтверждается сравнением количества колоний при высеве на плотную питательную среду из исходной взвеси и после инкубации с антибиотиком.
Применение ПЦР для идентификации F. tularensis и ее подви-довой дифференциации в смеси культур и клиническом материале
Эритромицин (Erythromycin) — является первым антибиотиком, положившим начало классу макролидов. Впервые получен в 1952 году из почвенного актиномицета Streptomyces erythreus. Обратимо связывается с 508-субъединицей рибосом, что нарушает образование пептидных связей между молекулами аминокислот и блокирует синтез белков микроорганизмов. Основными механизмами устойчивости бактерий к эритромицину являются: снижение проницаемости клеточной стенки для антибиотиков, активация систем активного транспорта их из клетки в окружающую среду, ферментативный гидролиз, а также конформационное затруднение связывания эритромицина с рибосомой вследствие метилирования рибосомальной РНК, изменения ее нуклеотидной последовательности и аминокислотной последовательности рибо-сомальных белков.
В пределах F. tularensis subsp. holarctica, кроме японского биовара, выделяют еще два, различающихся по устойчивости к эритромицину - I - чувствительный к макролидам, и, в том числе к эритромицину и II - нечувствительный.
Ранее было показано влияние на резистентность к эритромицину отдельных нуклеотид-ных замен в гене 23S-PHK у F. tularensis на примере одного изначально устойчивого штамма [47] и 10 спонтанно приобретших устойчивость к нему мутантов [85]. Так как такая выборка явно не является репрезентативной, для исследования вопроса о причинах устойчивости к эритромицину F. tularensis subsp. holarctica bv. II требуется проведение исследований на большем количестве штаммов данного биовара.
Нами было проведено сравнение нуклеотидных последовательностей генов 23-S РНК десяти штаммов голарктического подвида из «ГКПМКК-Оболенск», из которых два были чувствительными к эритромицину, и восемь - устойчивыми (таблица 30), а также последовательности генов 23-S РНК штаммов, аннотированные геномы которых представлены по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gOv/genome/511. (см. таблицу 6).
При этом выявилось, что у всех исследованных штаммов с природной устойчивостью к эритромицину наблюдается замена GGACAGA на GGAAAGA . Таким образом, нами подтверждено предположение о замене А на С в положении, соответствующему 2052 нук-леотиду штамма F. tularensis subsp. holarctica LVS, как причины устойчивости II биовара голарктического подвида туляремийного микроба к действию эритромицина (рисунок 26).
Как было сказано выше, способность к сбраживанию сахарозы является одним из признаков, используемым для внутривидовой диагностики у F. tularensis. Способность к сбраживанию сахарозы с образованием кислоты была описана только у F. tularensis subsp. novicida, и не выявлена у остальных подвидов возбудителя туляремии [73]. Также было обнаружено, что сахарозу способны сбраживать представители вида Francisella philomiragia и некоторые штаммы, относящиеся к роду Francisella, систематическое положение которых не уточнено [97]. Однако причины различий в способности франциселл к гидролизу сахарозы остаются не изученными, и в этой главе мы попытались их изучить.
При анализе аннотированных геномов (таблица 6) у всех исследованных штаммов F. tularensis были обнаружены гены Р-фруктофуранозидгидролазы. Сравнение их последовательностей выявило ряд видовых, подвидовых, и штаммовых различий, но наиболее важным фактом, на наш взгляд, является то, что у всех исследуемых штаммов, кроме относящихся к F. tularensis subsp. novicida и к F.philomiragia, то есть способных к сбраживанию сахарозы, де-летирована 5 - область гена, хотя у F. tularensis subsp. holarctica LVS также присутсвуют деле-ции в середине гена и с 3 -конца (рисунок 27).
При трансляции in silico эти замены у F. tularensis subsp. holarctica LVS и у F. tularensis subsp. tularensis OSU18 приводили к сдвигу рамки считывания, однако, по всей видимости, наиболее критичным для утраты способности ферментировать сахарозу в данном случае является утрата N-концевой области фермента, так как известно, что для ферментативной активности белков семейства GH32, к которому относится инвертаза, важны аспартат и глутамат, расположенные в N-концевой области белка [160].
Кроме того, у всех неферментирующих сахарозу штаммов делетированный ген инверта-зы фланкирован мобильным генетическим элементом IS Ftul. Дальнейший анализ показал, что ген Р-фруктофуранозидгидролазы у F. tularensis subsp. novicida расположен на расстоянии 75 п.о. в 3 -направлении от кластера генов метаболизма 3-изопропилмалата, в который у штамма U112 входят гены 2- изопропилмалатсинтазы, изопропилмалат изомеразы (большая и малая субъединицы) и изопропилмалатдегидрогеназы (5 —»-3 ). У F. philomiragia АТСС 25017 в этом же кластере расположен ген предполагаемого протон-зависимого транспортера олигопептидов (YP_001677495.1). Кластеры генов метаболизма изопропилмалата были выявлены также в геноме штаммов голарктического подвида, и более того, рядом с этими кластерами обнаружены области, аналогичные 5 -концевым областям гена Р-фрукто-фуранозидгидролазы, а также межгенный участок с предположительно находящимся в нем промотором данного гена, идентичный таковому штамма U112. Эти участки в 3 -области были фланкированные IS Ftul-элементами. По все видимости ген Р-фрукто-фуранозидгидролазы у F. tularensis subsp. holarctica был инактивирован в результате транспозиционного переноса большей части его последовательности мобильным генетическим элементом ISFtul. У F. noatunensis subsp. orientalis. Toba 04, как видно из рисунка 26, ген сахаразы значительно укорочен, что видимо, говорит об отсутствии у этого микроорганизма сахаразной активности, хотя литературных данных о его способности к гидролизу сахарозы нам найти не удалось.
Также у F. noatunensis subsp. orientalis. Toba 04 по соседству с геном сахаразы расположен кластеры генов метаболизма изопропилмалата, однако входящие в него гены направлены в другую сторону от гена Р-фрукто-фуранозидгидролазы, то есть кодируются другой цепью, в отличие оті7, tularensis subsp. novicida, у которого все эти гены сонаправлены.