Введение к работе
' _Актуальность_пр9<5лешь Способность бобовых растений усваивать молекулярный азот атмосферы является результатом их эффективного симбиоза с почвенными бактериями родов Rhizoblum и Bradyrhizobium. Фиксация молекулярного азота и его включение в метаболизм растения осуществляются в специализированных органах бобового - корневых клубеньках, формирование и функционирование которых основано на взаимозависимой экспрессии многих растительных и бактериальных генов (Quispel et al, 1988). Интенсивное изучение бобово-ризобиального симбиоза в последнее время определяется не только ' экономической и экологической значимостью фиксации атмосферного азота, но и общебиологическими проблемами. Это связано с тем, что в ходе сложных последовательных взаимодействий между бактериями и. растением происходит взаимное влияние партнеров на такие фундаментальные процессы, как клеточное деление и дифференцировка,' характер питания и метаболизм (Long, 1989). Возможность разнообразного экспериментального манипулирования-симбиотическим процессом делают его удобной моделью для изучения таких явлений. Поэтому всесторонний биохимический, генетический и молекулярно- биологический анализ симбиотических взаимоотношений является вкладом в'понимание механизмов явлений общебиологического порядка и, в частности, в углубление наших представлений о дифференциальной экспрессии растительных генов. Дифференциальная экспрессия генов растения в клубеньках приводит к синтезу de novo некоторых белковых продуктов (нодулинов - N) и к усилению синтеза ряда других, так называемых клубеньково- стимулируемых, полипептидов (Nst-полипептидов). Идентификация таких белковых продуктов и анализ- их роли в клубеньках бобовых представляют несомненный интерес. Известно, что N- и Nst- полипептидани в клубеньках могут являться,- в частности, субъединицы некоторых ферментов. Выбор в качестве объекта изучения аспартатаминотрансферазы (ААТ) диктовался большой значимостью этого фермента для амид - транспортирующих бобовых, и предполагаемым существованием Nst-формн фермента у не изученного в 3.T0M отношении- гороха. Поскольку синтез N- и Nst- полипептидов подвергается контролю со стороны обоих симбиотических партнеров, то исследование таких ферментов перспективно и с точки зрения изучеігая регуляции дифференциальной экспрессии контролирующих их .генов.
Цель и задачи работьи Целью настоящей работы явились
выявление растительных полипептидов, дифференциально сантезирущихся в клубеньках гороха, а такзе подробный анализ одного из них - изофермента ААТ-2, синтез которого стимулируется при клубенькообрэзоваши.
Конкретные задачи работы состояли в следующей:
- определить природу (растительную или бактериальную) и
характер синтеза (конститутивный или органоспецифический)
идентифицируемых в клубеньках цитоплазматических водорастворимых
полипептидов;
- определить количество водорастворшшх N- и Nat-полипептидов
н проанализировать возможности различных методических подходов для
их выявления;
выявить изменения^ в активности ААТ, происходящие при клубенькообразовании, и идентифицировать ААТ-2- подобную форму фермента;
с помощью электрофореза и иммуноблоттинга ' изучить субъединичную структуру МТ-2;
определить характер наследования ААТ-2 и хромосомную локализацию кодирующего ее гена;
- изучить особенности ААТ в неэффективных клубеньках с целью
сравнения вклада шкро- к ыакросимбионтов в
синтез ААТ-2.
Нау_чная_новизна^ Продемонстрировано возрастание активности ААТ при клубенькообразовании, обусловленное усиленным синтезом list- формы фермента - ААТ-2. Изучена экспрессия различных изофорш МТ-2 у разных форм гороха, определен их характер наследования п внутриклеточная локализация. Проанализирован вклад растительного ц бактериального партнеров в синтез и активность ААТ-2. Впервые, ..на база ультраструктурного-и биохимического анализа 4-х типов Р1х~-клубеньков, образованных различными бактериальными мутантами, изучено влияние микросимбионта на синтез и активность-растительного фермента. Анализ ААТ-2 в онтогенезе Fix+-. и І?іх--клубеньков позволил выдвинуть гипотезу о' контроле синтеза изофермента при симбиог'енезе. Обнаруженное влияние бактериального "партнера на синтез растительной ААТ позволяет значительно расширить круг моделей для изучения регуляции синтеза ферментов.
ОЕ2ктическ0Я_значимость. Подобранные модели симбиоза могут быть использованы в исследованиях по изучению генетического
контроля и регуляции синтеза клубеньковых форм ферментов. Исследование последних представляет практический интерес и при разработке селекционных программ: изучение регуляции N- и Nst-ферментов позволит понять биохимические основы эффективности ассимиляции азота в клубеньках и, на основе подбора сочетаний форм ферментов, определить пути повышения эффективности сиыбиотической азотфиксации.
Апробация_работы^ Результаты работы были представлены на: VIII всесоюзном Баховскоы коллоквиуме по азотфиксации (Кобулети, СССР, 1988), V международном симпозиуме по молекулярной генетике взаимодействия растений с микроорганизмами (Интерлакен, Швейцария, 1990), I всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пушино, СССР, 1991), VIII восточноевропейском симпозиуме по биологической азотфиксации "Nitrogen!ix-92" (Саратов, Россия, 1992), VIII (Ноксвилл, США, 1990) и IX (Канкун, Мексика, 1992) международных конгрессах по азотфиксации.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.
Структураи^объенработы^ Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, описания результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа'изложена на 189 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц, 23 рисунка. Список литературы включает 283 наименований, в том числе 19 на русском языке.