Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. На протяжении всех семи пандемий холеры возбудителями этой особо опаной инфекции были Vibrio cholerae 01 серогрупп классического и эльтор био-варов. Холерные вибрионы других серогрупп (V. cholerae не 01 или НАГ-вибрионы) могли быть причиной лишь локальных вспышек или отдельных случаев диарейных заболеваний, а также раневых инфекций , септицемии и т.д. ( Ермольева З.В., Краснова И.Н. с соавт.,1970; Дунаев Г.С, Зыкин Л.Ф., 1Э30; Мединский Г.М., Воронежская Л.Г., Сомова А.Г. с соавт.,1988;Honda Т., Both В.A., Bossman-Finkelste-ІП М., Finkelstein R.А.,1987; Dhar R. et al.,1989).
Первая большая эпидемия холеры, вызванная НАГ-вибрионами была зарегистрирована в 1992 -1993 гг. в Индии и Бангладеш. Возбудителем этой эпидемии стал штамм новой ранее не-известной серог-руппы 0139. Возбудитель холеры новой серогруппы из Индии и Бангладеш проник в Пакистан, Китай, Таиланд, Афганистан, Казахстан и другие страны, вызвав там вспышки холеры. В этой связи, ряд исследователей считают,что V. cholerae 0139 серогруппы может стать возбудителем 8ой пандемии холеры.
Новый НАГ-вибрион по ряду биохимических и молекулярно-биологических свойств сходен с холерными вибрионами 01 серогруппы биовара эльтор. TaK,V. cholerae 0139 продуцирует холерный токсин, не отличимый от холерного токсина вибрионов эльтор. Кассета вирулентности, включающая структурные гены трех токсинов ctxAB,zot,ace, а также гены фактора колонизации сер, окружены, так же как у эльтор вибрионов, двумя копиями IS-подобной последовательности RSI (Hall R.H.et al.,1993; Waldor M.K., Mekalanos 3.3,1994; Manning P.A..Stroecher V.H.,1994; Вік E.M. et al.,1995). Ряд штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы продуцируют такой же термолабильный гемолизин, что и вибрионы биовара эльтор и т.д.
В тоже время,в отличие от традиционных возбудителей холеры обоих биоваров.У.cholerae 0139 продуцирует полисахаридную капсулу и новый соматический антиген 0139 серогруппы. Гены, контролирующие биосинтез 0139-антигена (rfb0139) и капсулы (cap), являются новыми генами вирулентности и иммуногенности для возбудителей холеры , происхождение которых до сих пор не известно.
В настоящее время высказано два предположения относительно происхождения холерных вибрионов 0139 серогруппы. Согласно данным Johnson З.А. с соавт.(1992,1994),холерные вибрионы 01J9 серогруппы существовали во внешней среде, но не имели генов токсигеннос-ти. В результате обмена генетической информация гены токсигеннос-ти были приобретены ими от циркулирующих в этом районе продуцирующих энтеротоксин холерных вибрионов. Вместе с тем, Morris J.G. с соавт.(1994 ) , Вік Е.М. с соавт.(1995) и Pajni S. с соавт. (1995) предпологают, что НАГ-вибрион новой серогруппы является мутантом V. cholerae биовара эльтор по продукции О-антигена, который одновременно приобрел от других вибрионов ген cap. Однако, до сих пор механизм такого преобразования не известен.
Несмотря на огромный интерес многих исследователей к V. cholerae 0139 серогруппы, к настоящему времени достигнуты лишь определенные успехи в изучении структуры генома нового возбудителя холеры. Проведенная рядом зарубежных исследователей работа по клонированию и секвенированию отдельных генов вирулентности не смогла дать необходимую информацию о генетической организации V. cholerae 0139. Из-за отсутствия эффективных методов обмена генетической информацией до сих пор неизвестна локализация на хромосоме генов rfb0139 и cap.Неизученным также остается один из интереснейших вопросов, касающийся экспрессии в клетках V. cholerae 0139 чужеродных генов вирулентности.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ - генетическое картирование генов, контролирующих синтез 0139-антигена и капсулы;
изучение особенностей наследования и экспрессии клонированных генов холерного токсина и В-субъединицы холерного токсина V. colerae биовара эльтор в клетках V. cholerae серогруппы 0139.
-
Получить спонтанные и транспозонные мутанты V. cholerae серогруппы 0139 с измененной продукцией капсулы и 0139-антигена; выявить роль капсулы в вирулентности V. cholerae 0139.
-
Создать систему коньюгационного переноса хромосомных генов V. cholerae серогруппы 0139,состоящую из донорных и реципиен-тных штаммов.
-
Определить участок хромосомы V. cholerae серогруппы 0139,
содержащий гены 0139-антигена и капсулы.
4. Изучить особенности наследования и экспрессии клонированных генов холерного токсина и его В-субъединицы в клетках V. cholerae серогруппы 0139.
Впервые установлено, что формирование спонтанных бескапсуль-ных мутантов V. cholerae серогруппы 0139 сопровождается утратой клетками умеренного 0139-фага. Впервые выделен транспозонный мутант ,лишенный капсулы, но сохранивший 0139-антиген.
Получены новые данные о вирулентности бескапсульнных мутантов. Показано, что значительное снижение их вирулентности связано не только с отсутствием капсулы,которая обеспечивает резистентность холерных вибрионов 0139 серогруппы к бактерицидному действию нормальной человеческой сыворотки, но и с пониженной продукцией маннозо-чувствительных геагглютинирующих пилей адгезии, а также с уменьшением подвижности, которые являются факторами пато-генности.
Впервые для генетического анализа V. cholerae серогруппы 0139 создана система коньюгационного переноса хромосомных генов, состоящая из донорных и реципиентных штаммов. Донорные штаммы соответствуют типу Hfr и имеют различные точки начала переноса. Поли-маркированные реципиентные штаммы несут мутации как в различных генах ауксотрофности, так и в ряде генов вирулентности.
В результате применения созданной коньюгационной системы впервые построена генетическая карта участка хромосомы V.cholerae 0139, включающая 23 генетических маркера. Определена также локализация на хромосоме генов rib 0139 и cap, контролирующих синтез 0139-антигена и капсулы, соответственно.
Впервые показано стабильное наследование и эффективная экспрессия в клетках V. chlerae 0139 клонированных генов ctxAB и ctxB, определяющих биосинтез холерного эльтор токсина и его Всубъединицы. Показано, что присутствие чужеродных генов вирулентности в составе рекомбинантных плазмид не влияет на экспрессию ряда собственных факторов патогенности.Важным итогом этой работы явилось получение двух штаммов V. cholerae серогруппы 0139 с повышенной продукцией холерного токсина и иммуногенной В-субъединицы холерного токсина.
Создана коллекция генетически маркированных штаммов V. cholerae 0139 серогуппы два донорных и семь реципиентных штаммов, которая депонирована в Российской коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ "Микроб". Данные штаммы могут быть использованы для изучения генетической организации холерных вибрионов 0139 серогруппы и создания штаммов с необходимыми свойствами. Полученные штаммы V. cholerae серогруппы 0139 с повышенной продукцией холерного токсина и его В-субъединицы могут быть использованы для приготовления вакцинных препаратов.
По материалам диссертации написаны методические рекомендации" Идентификация капсульных и бескапсульных штаммов V. cholerae 0139 серогруппы с помощью 0139-агглютинирующей сыворотки.", которые были одобрены Ученым советом Российского науцно-исследова-тельского противочумного института "Микроб".