Содержание к диссертации
Введение
1. Актуальные аспекты изучения иксодовых и аргасовых клещевых боррелиозов; проблемы лабораторной диагностики
1.1 Боррелии
1.1.1 Таксономия
1.1.2 Морфология
1.1.3 Организация генома
1.1.4 Белки OspA и Р83/100 боррелии комплекса В. burgdorferi s.l.
1.2 Экология и эпидемиология
1.2.1 Экология боррелии переносимых клещами
1.2.2 Эпидемиология
1.3 Молекулярные механизмы патогенеза
1.4 Патогенез
1.4.1 Иксодовые клещевые боррелиозы
1.4.2 Аргасовые клещевые боррелиозы
1.5 Диагностика боррелиозов
1.5.1 Прямые методы
1.5.2 Серологические методы
2. Экспериментальная часть (материалы и методы)
2.1 Реактивы и материалы
2.1.1 Реактивы
2.1.2 Синтетические олигонуклеотиды
2.1.3 Буферы и основные растворы
2.1.4 Бактериальные штаммы и коньюгаты
2.1.5 Образцы крови больных
2.1.6 Клещи I. persulcatus и образцы крови мелких млекопитающих
2.1.7 Базы данных и программы
2.2 Методы
2.2.1 Изоляция боррелии от таежных клещей на среде BSK-H
2.2.2 Изоляция боррелии на среде BSK-H из крови больных
2.2.3 Вьщелсние нуклеиновых кислот из различных биологических источников
2.2.4 Амплификация фрагментов ДНК
2.2.5 Анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции ПЦР фрагментов (ПДФР)
2.2.6 Подготовка ПЦР-фрагментов для проведения определения нуклеотидных последовательностей
2.2.7 Очистка продуктов реакции секвенирования ДНК
2.2.8 Определение нуклеотидных последовательностей
2.2.9 Филогенетический анализ
2.2.10 Денатурирующий электрофорез белков в SDS-ПААГ
2.2.11 Иммуноблот анализ 58
2.2.12 Выявление антител в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) 58
2.2.13 Статистический анализ 59
3. Результаты и обсуждение 60
3.1 Выявление боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. в образцах от клещей /. persulcatus, крови мелких млекопитающих и людей 60
3.1.1 Выявление ДНК боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. в крови больных, госпитализированных с признаками инфекционных заболеваний и присасыванием клещей в анамнезе 60
3.1.2 Выявление ДНК боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. в крови мелких млекопитающих 62
3.1.3 Выявление ДНК боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. в образцах от клещей I persulcatus 63
3.1.4 Изоляция боррелий от клещей I. persulcatus методом культивирования в искусственной среде 64
3.2 Выявление ДНК В. miyamotoi в образцах из Новосибирской области 67
3.2.1 Выявление ДНК В. miyamotoi в образцах от клещей I. persulcatus и крови мелких млекопитающих 67
3.2.2 Выявление ДНК В. miyamotoi в крови лихорадящих больных 69
3.2.3 Изоляция боррелий из крови лихорадящих больных 71
3.2.4 Анализ нуклеотидных последовательностей В. miyamotoi 71
3.3 Установление видовой принадлежности боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. 74
3.3.1 В. burgdorferi s.l. с типичной последовательностью межгенного спейсера 74
3.3.2 В, burgdorferi s.l. с нетипичной последовательностью межгенного спейсера 81
3.4 Молекулярно-генетический анализ генов, кодирующих иммунодоминантные белки OspA и Р83/100 85
3.4.1 Молекулярно-генетический анализ гена ospA 85
3.4.2 Молекулярно-генетический анализ генар83/100 94
3.5 Сравнительный анализ генов р83/100 и ospA 102
3.6 Выявление антител к белкам боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. в крови людей, заболевших после присасывания клещей 111
3.6.1 Сравнение выявления ДНК боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. и противоборрелиозных антител в крови больных с эритемной формой ИКБ 114
3.6.2 Сравнение выявления противоборрелиозных антител в крови больных с КЭ и лихорадочными состояниями, развившимися после присасывания клещей 117
3.6.3 Иммуноблот анализ 120
-Заключение 125
-Выводы 130
-Список литературы 131
- Белки OspA и Р83/100 боррелии комплекса В. burgdorferi s.l.
- Иксодовые клещевые боррелиозы
- Клещи I. persulcatus и образцы крови мелких млекопитающих
- Выявление ДНК боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. в крови больных, госпитализированных с признаками инфекционных заболеваний и присасыванием клещей в анамнезе
Введение к работе
Актуальность проблемы. Иксодовые клещевые боррелиозы (ИКБ) – природно-очаговые трансмиссивные заболевания, занимающие по широте распространения и уровню заболеваемости значительное место среди природно-очаговых заболеваний. Возбудитель ИКБ – спирохеты комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.), – передаются человеку клещами рода Ixodes (Korenberg E.I., 2002; Wang G., 1999). Помимо боррелий комплекса B. burgdorferi s.l. в клещах рода Ixodes выявлены боррелии Borrelia miyamotoi, генетически относимые к клещевым возвратным лихорадкам (КВЛ) (Fukunaga M., 1995). Встречаемость B. miyamotoi на территории России на сегодняшний день не изучена.
ИКБ протекают в острой, а чаще в хронической форме и проявляются в виде множественных органных повреждений (Aguero-Rosenfeld M., 2005; Воробьева Н.Н. 2000, 2003; Ананьева Л.П., 2000; Wilske B., 2003). Боррелиоз поддается терапии на ранней стадии заболевания, при переходе в хроническую стадию лечение становится более длительным и сложным, поэтому актуальной проблемой является своевременная диагностика этого заболевания (Ананьева Л.П., 2002; Wilske B. 2002; Dumler J., 2001). Вопрос о приемлемости метода ПЦР для выявления ДНК в крови больных ИКБ не однозначен, все чаще говорится о возможности применения ПЦР для диагностики ИКБ (Рудакова С.А., 2007; Nowakowski J., 2001; Wilske B., 2002, 2003). Однако четкого представления о сроках и целесообразности применения данного метода нет.
Для идентификации боррелий комплекса B. burgdorferi s.l. применяются лабораторные методы: фенотипические, серологические и молекулярно-генетические (Wang G., 1999; Wilske B., 2005; Ананьева Л.П, 2002; Steere A., 2004; Merljak Skocir L, 2007). Наиболее распространены серологические методы, основанные на определении антител к антигенам возбудителя, поэтому изучению поверхностных белков боррелий комплекса B. burgdorferi s.l. уделяется особое внимание. У больных ИКБ наблюдаются отличия в реагировании антител с белками разных видов боррелий комплекса B. burgdorferi s.l. (Casjens S, 1993). Вероятно, это связано с высокой вариабельностью иммунодоминантных белков, поэтому изучение структуры и свойств белков имеет большое значение для разработки эффективных средств диагностики и профилактики.
Анализ клиники ИКБ в различных регионах России указывает на преобладание неврологической симптоматики (Воробьёва Н.Н., 1998, 2000), в то же время принято считать, что вид Borrelia garinii связан с неврологическими проявлениями ИКБ (Liveris D, 2002). Однако в большинстве проводимых в настоящее время работ по изучению генетической гетерогенности и патогенных свойств B. garinii западносибирские штаммы не используются. Изучение в основном проводится с использованием штаммов, изолированных в Европе от клещей Ixodes ricinus. За рамками рассмотрения остается большая генетическая подгруппа вида B. garinii – NT29, переносимая только клещами Ixodes persulcatus (Korenberg E.I., 2002; Wang G., 1999).
Целью работы являлось изучение генетической гетерогенности спирохет рода Borrelia, переносимых клещами I. persulcatus в Западной Сибири.
В процессе исследования были поставлены следующие задачи:
Выявить региональные особенности видового состава и встречаемости боррелий комплекса B. burgdorferi s.l. в клещах I. persulcatus и мелких млекопитающих, а также в крови больных иксодовыми клещевыми боррелиозами.
Оценить выявляемость и генетическую гетерогенность боррелий вида B. miyamotoi в клещах I. persulcatus и мелких млекопитающих. Провести выявление B. miyamotoi в крови больных, госпитализированных с признаками инфекционных заболеваний и присасыванием клещей в анамнезе.
Провести молекулярно-генетический анализ генов, кодирующих иммунодоминантные белки Р83/100 и ОspA. Оценить возможность определения видовой принадлежности боррелий комплекса B. burgdorferi s.l. по последовательностям гена p83/100. Изучить возможные корреляции определения видовой принадлежности западносибирских изолятов по последовательностям генов p83/100 и оspA.
Провести сравнительный анализ выявления ДНК и антител к белкам боррелий комплекса B. burgdorferi s.l. у больных ИКБ, клещевым энцефалитом и с лихорадочными состояниями и присасыванием клещей в анамнезе.
Научная новизна и практическая значимость работы.
В ходе выполнения работы показано, что помимо широко распространенных видов B. garinii и B. afzelii, циркулирующих в клещах и мелких млекопитающих, детектируются боррелии с нетипичной структурой межгенного спейсера 5S-23S рРНК, относимые к виду B. garinii. Установлено, что возбудителями ИКБ в Новосибирской области являются виды B. garinii и B. afzelii, однако независимо от формы ИКБ у больных чаще выявляется B. garinii подгруппы NT29. Впервые определена последовательность гена p83/100 изолятов B. garinii подгруппы NT29. Обнаружена высокая гетерогенность гена p83/100 боррелий вида B. garinii, поэтому при использовании белка Р83/100 для диагностики необходимо учитывать иммунореактивные свойства белка. Для боррелий вида B. garinii показана высокая гетерогенность гена ospA, впервые показано наличие не только гомологичной рекомбинации, но и латерального переноса плазмиды lp54 кодирующей белок ОspA для западносибирских изолятов B. garinii. Впервые на территории Западной Сибири в I. persulcatus выявлены боррелии вида B. miyamotoi, относящиеся к группе клещевых возвратных лихорадок. В крови больных с острыми лихорадочными состояниями и присасыванием клещей в анамнезе не только детектирована ДНК B. miyamotoi, но также получены изоляты, не сохраняющие способность к дальнейшему росту при дальнейшей культивации. Показано, что на стадии раннего ИКБ до начала лечения метод ПЦР применим в комплексной диагностике ИКБ.
Публикации и апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 12 статьях и 14 тезисах докладов, в том числе 10 статей в журналах, рекомендованных ВАК для публикации основных научных результатов докторских и кандидатских диссертаций, из них 3 международные. Результаты представлены на Российских и международных конференциях: “Актуальные вопросы современной медицины”, Новосибирск, 2004; «Ежегодная научно-практическая конференция невропатологов и инфекционистов», Новосибирск, 2004; «Фундаментальные науки медицине», Новосибирск, 2005, 2006, 2008; «Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в XXI веке», Томск, 2006; IX International Jena Symposium on Tick-borne Diseases «Climate change and tick-borne diseases», Йена, Германия, 2007; Russian-Great Britain workshop of young scientists «Emerging Diseases: Tick-transmitted and influenza», Новосибирск, 2007; «Актуальные вопросы региональной инфекционной патологии», Иркутск, 2007; «Биотехнология в Казахстане: Проблемы и перспективы инновационного развития», Алматы, Казахстан, 2008.
Основные положения, выносимые на защиту:
Структура популяции боррелий в природных очагах иксодовых клещевых боррелиозов Западной Сибири гетерогенна. Помимо широко распространенных видов высока вероятность выявления боррелий с нетипичной организацией генома как в переносчиках, так и в резервуарных хозяевах. B. garinii подгруппы NT29 - основной этиологический агент ИКБ в Западной Сибири.
Таежные клещи в Западной Сибири участвуют в поддержании циркуляции B. miyamotoi. В одном природном очаге возможна циркуляция не только боррелий комплекса B. burgdorferi s.l., но и B. miyamotoi.
Гены иммунодоминантных белков p83/100 и ospA B. garinii Западной Сибири высоко гетерогенны. Группы, выделенные на основании анализа нуклеотидных последовательностей генов р83/100 и ospA, соотносятся между собой.
Метод ПЦР, наряду с иммунологическими методами анализа, применим на ранней стадии диагностики ИКБ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 147 страницах, содержит 25 рисунков и 18 таблиц. Библиография включает 305 литературных источников, из которых 78 работы отечественных и 227 – зарубежных авторов.
Белки OspA и Р83/100 боррелии комплекса В. burgdorferi s.l.
Антитела при ИКБ вырабатываются более чем к 20 антигенам, кодируемым генами, локализованными как на хромосоме (белки ВтрА, флагеллин, Р58, Р66, Р83/100 и др.), так и на плазмидах (OspB, OspC, OspE, OspF, Ospl7, VlsE и др.). Состав белков-антигенов и их соотношение могут значительно отличаться не только среди боррелий разных видов, но также в изолятах одного вида [108, 175, 176]. В данном разделе приведена характеристика генов ospA и р83/100, кодирующих иммунодоминантные белки Р83/100 и OspA. широко применяемые для средств диагностики и вакцинопрофилактики. ospA. Ген ospA (bbal5), кодирующий белок OspA, локализован на линейной плазмиде 1р54 в позиции 9700-10521 п.н. (для В. burgdorferi s. s. штамм В31). Длина гена ospA варьирует для патогенных видов комплекса В. burgdorferi s.l.: 822 п.н. для В. burgdorferi s.s., В. spielmanii и В. afzelii; от 819 до 828 п.н. для В. garinii. Ген ospA находится в одной рамке считывания с геном ospB, показано, что белки OspA и OspB экспресируются одновременно, кроме того, для некоторых изолятов вида В. garinii показан высокий уровень гомологии этих двух генов [97]. Как говорилось выше, нуклеотидные последовательности гена ospA видов В. burgdorferi s.s. и В. afzelii имеют высокий уровень гомологии внутри вида, в то время как для вида JS. garimi, наоборот показана большая гетерогенность гена ospA [149, 189, 261,J. Это может быть объяснено гомологичной рекомбинацией или латеральным переносом генов, который был ранее показан на примере гена ospA [102]. Наиболее вариабельный район, локализованный в 3 -половине гена и имеет отличия, как по длине, так по числу и положению нуклеотидных замен [129, 299]. На основании анализа нуклеотидных последовательностей гена ospA изолятов боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. полученных в Хабаровском крае выделены три филогенетически различимые группы вида В. garinii [149].
Белок OspA - основной поверхностный антиген боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. с молекулярной массой 31 кДа. Первые 25 а.о. в аминоконцевой части белка наиболее консервативны для всех видов комплекса и содержат сигнал пептидазы П и цистеин (Cys-17) по которому происходит присоединение липидного фрагмента, обуславливающего фиксацию аминоконцевой части белка в мембране клетки [188]. В настоящее время определена вторичная структура OspA, показано, что белок имеет необычную продолговато-складчатую структуру состоящую из 21 повторяющихся ан ти параллельных Р-слоев и последующей единичной а-спирали .
Эти элементы формируют аминоконцевой «сандвич», центральный слой и карбоксиконцевой цилиндрический barrel-домен [134]. Карбоксиконцевой barrel-домен образован 14-21 р-слоями и включает в себя наиболее гипервариабельный район белка. Основным мотивом в этом домене считают три аминокислоты: Arg-139, Glu-160 и Lys 189, в настоящее время подобного мотива не найдено ни в одной из известных белковых структур [134]. Карбоксиконцевой домен белка может служить потенциальным сайтом связывания с гидрофобным лигандом имеющим отрицательный заряд. Природа этого лиганда не ясна, это могут быть короткие пептиды, линейные сахара или выступающие белковые структуры [134]. OspA играет существенную роль для адгезии, колонизации и выживания боррелий в кишечнике клеща [93, 158]. Недавно был идентифицирован рецептор TROSPA (tick receptor for OspA) для белка OspA, который представляет собой гликозилированныи белок. Данный белок локализован в межклеточном пространстве внутренней поверхности эпителиальных клеток кишечника клеща. TROSPA, взаимодействуя с белком OspA, обуславливает присоединение спирохет к внутренней поверхности кишечника клеща (рис. 4) [290].
Во время питания клеща экспрессия OspA и TROSPA, значительно снижается, что уменьшает взаимодействие спирохет с клетками эпителия кишечника клеща. Это позволяет боррелиям покинуть кишечник и переместиться в слюнные железы клеща, откуда боррелий легко могут проникнуть в организм млекопитающего [193, 290]. В тоже время, при питании клеща увеличивается экспрессия белка OspC и поверхностного белка клеток эпителия слюнных желез клеща — Salpl5. Белок OspC связывает, индуцируемый при питании, белок Salpl5 и транспортирует его в связанном состоянии (рис. 4) [179, 183]. Белок Salpl5 проявляет иммуносупресирующее и иммунопротективное воздействие, поскольку ингибирует CD4+ зависимую Т-клеточную активацию и инактивацию боррелий при помощи антител (рис. 4) [226, 285].
При попадании боррелий в организм теплокровного, где температура значительно выше, экспрессия белка OspA отсутствует, в то время как экспрессия высоко вариабельного липопротеина OspC значительно возрастает [193]. Этим объясняется отсутствие иммунного ответа на ранней стадии заболевания на OspA и выраженный - на OspC. Однако в некоторых случаях антитела к OspA могут появиться на поздних стадиях заболевания [84].
Эпитопы для моноклональных антител LA-2, обладающие высокоэффективным протективным эффектом картированы на карбоксиконцевом участке белка [272]. Возможно, антитела к OspA обладают перекрестной реакцией с белками экспресирующимися нервными клетками человека, такими как нейроны головного и спинного мозга [85]. Взаимодействие белка OspA с поверхностными белками нервных клеток, рассматривают как один из возможных механизмов патогенеза при нейроборрелиозе. Показано, что белок OspA обуславливает адгезию с эндотелиальными и нервными клетками [79, 84]. Кроме того, антитела к белку OspA детектированы в цереброспинальной жидкости 75% больных с нейроборрелиозом, причем у 42% больных детектированы IgM антитела, тогда как в крови антител к белку OspA не выявлено [266].
Липопротеины боррелий, в частности OspA, связываясь с CD4+ и Toll-подобными рецепторами на макрофагах, активируют воспалительную реакцию, кроме того, предполагают, что OspA может участвовать в развитии аутоиммунного артрита, через дифференциацию Th клеток, экспресирующих IL-17 [288]. В результате взаимодействия боррелий с макрофагами происходит выделение IL-1, который индуцирует воспалительный процесс. Накопление IL-17 в области мигрирующей эритемы приводит к уменьшению количества эпидермальных клеток Лангерганса, запуская тем самым механизм хронизации инфекции [209].
Иксодовые клещевые боррелиозы
ИКБ — полисистемное заболевание, при котором возможно поражение опорно-двигательного аппарата, нервной и сердечно-сосудистой систем, а также кожи [21, 269-271]. Возможно, полиморфизм клинических проявлений при ИКБ имеет в своей основе генетическую гетерогенность боррелий, хотя прямая зависимость не доказана [301]. Получены косвенные доказательства ассоциации вида В. burgdorferi s.s. с суставными патологиями, поскольку у больных в Америке встречаемость артритов (60%) намного выше, чем у европейцев (3-15%). Кроме того, с этим видом связывают и кардит, широко встречающееся клиническое проявление у североамериканских (4-10%) и европейских (0.5-4%) больных ИКБ. Хронический атрофический дерматит (болезнь Пика-Герксгеймера) характеризуется увеличивающимися красными повреждениями на разгибательной поверхности конечностей и вызывается всеми тремя видами боррелий со значительным преобладанием В. afzelii. Нейроборрелиоз — наиболее тяжелое проявление ИКБ, которое характеризуется поражением как центральной, так и периферической нервной системы [209, 199, 171]. Все три вида: В. garinii, В. afzelii и В. burgdorferi s.s., -известны как причина иксодового клещевого нейроборрелиоза, однако в Европе доказано значительное преобладание В. garinii [21]. Возможно вовлечение нескольких патогенных механизмов при развитии инфекции. Некоторые синдромы, такие как менингит и радикулит, вероятно, отражают результат прямой инфекции органа [282]. Такие синдромы как артрит и полиневрит могут быть связаны с непрямым эффектами, вызванными вторичным аутоиммунным ответом [199].
Ранние наблюдения, до применения антибиотиков, у жителей города Лайма, позволили описать стадийность заболевания, условно выделяют три стадии боррелиозной инфекции: локальная, или ранняя; диссеминированная и персистирующая [92]. Сходная, классификация предложена в нашей стране Лесняк О.М. [43]. Деление на стадии весьма условно, не всегда возможно выделение самой ранней локальной стадии, поскольку в большинстве случаев эритему в короткий промежуток времени начинает сопровождать комплекс других симптомов и синдромов болезни [1, 6]. Выраженный клинический полиморфизм в остром периоде заболевания свидетельствует о ранней диссеминации боррелий. Особенностью клинических проявлений острого течения ИКБ в России считают раннее, на 2-3 неделе болезни, поражение различных органов и систем [4, 7, 48, 77]. На основании анализа клинической картины острого течения безэритемной формы ИКБ выделено семь наиболее типичных клинических вариантов раннего ИКБ: неврологический, артромиалгический, гриппоподобный, сердечно-сосудистый, регионарный лимфаденит, гепатит и смешанный [8]. В России, как в раннем, так и позднем периоде ИКБ, при хронических манифестных формах, отмечается более частое поражение нервной системы и редкие случаи артритов [6, 77, 192].
Продолжительность I стадии составляет в среднем от 3 до 30 дней. В этот время в месте укуса клеща может появиться мигрирующее по периферии эритематозное кольцо так называемая кольцевая мигрирующая эритема (МЭ). МЭ появляется на коже в результате воспалительной реакции. МЭ является лучшим критерием ранней инфекции, однако наблюдается она только у 40-70% пациентов с подтвержденным боррелиозом [270, 271]. Примерно у 25-75% больных кожные проявления сопровождаются ознобом, слабостью, миалгиями, артралгиями и лимфоаденопатией, которые являются сигналом диссеминации боррелий [271] У больных с МЭ чаще наблюдается подострое и постепенное начало заболевания без симптомов интоксикации [77]. Безэритемная форма, подтвержденная серологически, начинается, как правило, остро с подъёма температуры тела до 38,5С и выше [73]. В этот период специфический иммунный ответ минимальный и характеризуется образованием иммуноглобулинов класса М против Р41, OspC и Р39 [126], а к концу периода антитела класса IgG против Р35, Р37, Ospl7, Р58, Р66 [185, 284, 300]. Следует отметить, что обнаружение в крови пациентов антител к В.burgdorferi s.l. не обязательно сопровождается клиническими проявлениями ИКБ, и, наоборот — у 30% больных с МЭ специфические IgM и IgG на первой стадии болезни могут не определяться [47, 66, 68, 69, 155, 292]. Таким образом, отсутствие симптомов болезни на ранних сроках после укуеа клеща не исключает развитие инфекционного процесса в дальнейшем. На начальном этапе ИКБ (I стадия) вполне возможно выздоровление, вероятность которого значительно возрастает при проведении адекватного антибактериального лечения. Лечение лучше проводить в наиболее ранние сроки после заражения. Показано, что если антибактериальная терапия проведена в первые 2 недели после укуса клеща, заболевание либо не развивалось, либо заканчивалось на I стадии и отдаленные симптомы, как правило, не развивались [14, 22, 31]. При проведении антибактериальной терапии па I стадии пациентам с низкой концентрацией антител практически не наблюдается повышения титров антиборрелиозных антител [22, 269]. Антибактериальная іерапия, проведенная больным с высокими титрами антител, не приводит к их заметному снижению в течение некоторого времени. Значения титров антител могут сохраняться на детектируемом уровне в течение длительного времени (от нескольких месяцев до нескольких лет) [210]. Показано, что антитела класса IgM у больных нейроборрелиозом определяются в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) в течение трех-пяти лет после проведенного лечения [199]. При отсутствии адекватного лечения даже при исчезновении МЭ и нормализации температуры тела заболевание может перейти в поздний период, включающий II и III стадии [270].
II стадия ИКБ развивается в примерно через 1 месяц после инфицирования. В течение этого времени происходит диссеминация боррелий и поражение ими различных органов и тканей [271]. Для II стадии характерен значительный полиморфизм клинических проявлений, поскольку боррелий могут поражать миокард, сетчатку глаза, мышцы, суставы, печень, селезенку, спинной и головной мозг. К неврологическим проявлениям II стадии относят: менингоэнцефалит, миелит, поражение черепно-мозговых нервов, периферическая радикулопатия; к кардиальным: атриовентрикулярная блокада, миокардит, перикардит. Кроме того, отмечено проявление вторичных поражений кожи: эритематозная сыпь на ладонях, диффузная эритема, доброкачественная лимфоцптома кожи [270, 271]. Иногда первоначально появившиеся признаки заболевания исчезают, а затем ИКБ проявляется в виде новых органных повреждений [48]. В это время, происходит изменение выработки антител к боррелиям, IgM антитела постепенно замещаются на IgG [68]. Максимальное количество специфических IgG появляется, как правило, через 1,5-3 месяца после инфицирования и к концу второй стадии они преобладают. Развитие заболевания сопровождается расширением спектра антител к антигенам боррелий, IgG на этой стадии продуцируются как к выше перечисленным белкам, так и к: Р58, Р60, Р66, Р77 [132, 299]. В это же время могут определяться IgM, к тем же белкам, что и на ранней стадии, так, например, у некоторых больных антитела класса IgM к белку OspC могут определяться в крови в течение нескольких месяцев [185].
Клещи I. persulcatus и образцы крови мелких млекопитающих
Таежные клещи I. persulcatus, отловленные на флаг с растительности весной-летом 2004-2006 гг. в окрестностях Новосибирского научного центра (ННЦ), в Искитимском, Колыванском, Тогучинском и Новосибирском районах Новосибирской области, любезно предоставлены В.В. Пановым (Институт систематики и экологии животных СО РАН, г. Новосибирск) и Е.Г. Федоровым (Территориальное управление Роспотребнадзора по Новосибирской области). Таежные клещи I. persulcatus, отловленные на флаг с растительности весной-летом 2006 г. на Северном Урале (Свердловская область, Североуральский район, Государственный природный заповедник «Денежкин Камень»), любезно предоставлены Н.Н. Ливановой (ИСиЭЖ СО РАН, г. Новосибирск).
Образцы крови мелких млекопитающих родов Apodemus, Sicista, Myodes, Sorex, Microtus, Neomys, and Eutamias, отловленных весной-летом 2003 и 2006 г. в рекреационной зоне отдыха ННЦ СО РАН, любезно предоставлены В.В. Пановым (ИСиЭЖ СО РАН, г. Новосибирск). Образцы ДНК из крови мелких млекопитающих отловленных летом 2006 г. любезно предоставлены В.А. Рар (ИХБФМ СО РАН, г. Новосибирск).
База данных Национального центра биотехнологической информации Genbank NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html использовалась для поиска опубликованных нуклеотидных последовательностей генома боррелий.
Сравнение и анализ, полученных нуклеотидных последовательностей, выполнены с помощью программ BlastN http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST и CLUSTALW http://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html. Программа MEGA 4.0 http://www.megasoftware.net/manual.html использовалась для проведения филогенетического анализа. Изоляцию боррелий проводили с использованием искусственной питательной среды BSK-H и набора антибиотиков, рекомендованных к применению с данной питательной средой (Sigma, США). Данная работа проводилась совместно с коллегами из НПО «Вирион», филиал ФГПУ НПО «Микроген», Томск. Все процедуры производились с полным соблюдением техники безопасности. Для предотвращения контаминации посторонней микрофлорой обработку клещей проводили следующим образом. Сначала клещей отмывали в 70% этаноле, помещенном в стерильный флакон, затем пинцетом переносили в другой стерильный флакон и проводили отмывку стерильной дистиллированной водой. Дальнейшая работа проводилась в боксе с соблюдением полной стерильности. Клещей переносили в стерильную чашку Петри, сагитально, отсекая брюшко, от головогруди и помещали ее в пробирку с полной средой BSK-H, содержащей смесь антибиотиков, либо в полной средой BSK-H, без антибиотиков: 0,02 г/л фосфомицина, 0,05 г/л рифампицина, 2,5 мг/л амфотерицина В. Либо, клеща фиксировали на поверхности парафина, залитого в чашку Петри, вскрывали брюшко и переносили комплекс внутренних органов клеща в среду BSK-H. Пробирки инкубировали при 31-33С в микроаэрофильпых условиях до 60 суток. Контроль за посевами вели визуально по окраске среды. При изменении окраски среды проводили первичную идентификацию с помощью фазово-контрастыой микроскопии препаратов «раздавленной капли».
Кровь объёмом 6-9 мл собирали в пробирки «Vacuette»-K3E с 0,5 М ЭДТА (Австрия и в этот же день проводили посев на среду BSK-H без антибиотиков. Для этого плазму крови отделяли от клеток центрифугированием при 350 g, затем 0,2 или 0,5 мл плазмы центрифугировали при 7000 g и помещали осадок в стерильные флаконы, содержащие 2 мл среды BSK-H. Все процедуры производились с полным соблюдением техники безопасности и полной стерильности. Кровь объёмом 6-9 мл собирали в пробирки «Vacuette»-K3E с 0,5 М ЭДТА (Австрия). Для выделения ДНК плазму крови отделяли от клеток путем отстаивания цельной крови при 4С в течение ночи, либо центрифугированием при 350 g. Для осаждения ДНК-содержащего материала плазму центрифугировали при 8000 g, выделение ДНК проводили из осадка следующей схеме. 1. К осадку в зависимости от его величины добавляли от 300 до 400 мкл лизирующего буфера, инкубировали 40 - 60 мин при 56С. 2. К полученному раствору добавляли 30 мкл суспензии реагента «Silica» (Sigma, США). Инкубировали 10-15 мин при комнатной температуре со встряхиванием. 3. Центрифугировали 1 мин 30 сек при 350 g, супернатант удаляли. 4. К осадку добавляли 400 мкл отмывочного буфера, тщательно ресуспендировали до гомогенного состояния. Центрифугировали 1 мин 30 сек при 350 g, супернатант удаляли. 5. Осадок промывали в 500 мкл 70% этанола, тщательно ресуспендируя до гомогенного состояния. Центрифугировали 1 мин 30 сек при 700 g, супернатант удаляли. 6. Повторяли огмывку в 500 мкл 70% этанола. 7. К осадку добавляли 500 мкл 96% этанола, тщательно ресуспендировали осадок до гомогенного состояния. Центрифугировали 3 мин при 1000 g, супернатант удаляли. 8. Осадок высушивали при 65С в течение 15 мин (до полного высыхания сорбента). 9. К высушенному осадку добавляли 40 мкл буфера ТЕ, инкубировали при встряхивании 10 мин при 56С. 10. Центрифугировали 3 мин при 1000 g, супернатант переносили в чистые пробирки. Для проведения ПЦР использовали 2-4 мкл раствора ДНК. Выделение из крови мелких млекопитающих Выделение ДНК проводили из цельной крови мелких млекопитающих. К 100-150 мкл цельной крови добавляли 400 мкл лизирующего буфера, инкубировали 60 мин при 56С. Далее проводили выделение по методике выделение ДНК из крови больных, начиная с п.2. Выделение от таеэюных клещей
Выделение ДНК проводили от каждого клеща индивидуально. Для этого клеща измельчали и помещали в полипропиленовую пробирку объемом 1.5 мл типа Eppendorf, добавляли 300 мкл лизирующего буфера, инкубировали 45 мин при 56С. Затем добавляли равный объем фенола рН8,0, тщательно перемешивали и инкубировали при -20С в течение 10 мин. Центрифугировали 10 мин при 11300g, отбирали водную фракцию. К водной фракции добавляли 1/10 объема З М ацетата калия рН 5,0 и равный объем изопропанола, инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Осадок собирали центрифугированием в течение 10 мин при 11300 g, промывали 2 раза 70% этанолом, 1 раз 96% этанолом, тщательно высушивали и растворяли в 30 мкл ТЕ буфера.
Выявление ДНК боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. в крови больных, госпитализированных с признаками инфекционных заболеваний и присасыванием клещей в анамнезе
В данной работе, ДНК выделяли из 3-5 мл плазмы крови больных, госпитализированных с признаками инфекционных заболеваний и присасыванием Все больные в зависимости от клинических проявлений были разделены на 5 групп (табл. 6). Группу I (139 человек) составили больные ИКБ с изолированной МЭ, у которых зафиксирована первая из трех условно выделяемых стадий ИКБ. Появление эритемы отмечали с 3 по 28 день после укуса клеща, в 5 случаях появление зуда, жжения и покраснения больные замечали в первые сутки после укусов. В этой группе ДНК боррелий детектирована в 35 пробах крови, что составило 25,2% исследованных случаев (табл. 6). Наши результаты хорошо согласуются с полученными ранее: ДНК боррелий была детектирована методом ПЦР в 18,4% образцов крови больных с эритемной формой ИКБ [100] и в 28% образцов крови больных с острым ненроборрелиозом [238]. В группу II (19 человек) вошли больные с подтвержденным диагнозом КЭ и эритемной формой ИКБ. Сочетание двух инфекций выявлено в 19 случаях (15,3% от общего числа больных с подтвержденным диагнозом КЭ), что соответствует ранее опубликованным данным по смешанной форме заболевания КЭ и ИКБ. [21, 36, 41]. В 8 случаях эритемная форма ИКБ отмечена у больных с менингеальной формой КЭ, а в 11 случаях - с лихорадочной. В этой группе ДНК боррелий выявлена в 5 пробах крови (табл. 6). Группу III (105 человек) составили больные с диагнозом КЭ, подтвержденным серологически. В этой группе ДНК В. burgdorferi s.l. обнаружена в 12 случаях (табл. 6). Группу IV (298 человек) составили больные, госпитализированные с подозрением на КЭ (лихорадка, факт присасывания клещей), у которых в ходе дальнейшего обследования диагноз не подтвердился. ДНК боррелий комплекса В burgdorferi s.l. обнаружена вії случаях (табл. 6). В группу V (40 человек) вошли больные с подтвержденным диагнозом ИКБ с признаками поражения кожи, опорно-двигательного аппарата и периферической нервной системы. Время, прошедшее после укуса клеща до взятия крови у больных в этой группе варьировало от 3 месяцев до 3 лет. В группе больных с хроническим течением боррелиоза ДНК в крови не детектирована.
При анализе различных биологических проб от больных боррелиозом количество положительных результатов отличается в зависимости от природы исследованных образцов. Наибольшее количество ПЦР-положительных проб выявляется при исследовании кожных биопгатов из периферических участков кожной эритемы [253, 301]. Спирохетемия, выявленная посевами из крови больных на первой стадии боррелиоза, определяется в 1.5% - 29% [100, 131, 152, 196], в то время как в биоптатах кожи п в синовиальной жидкости на этой стадии ДНК В. burgdorferi s.l. выявляется в 50-70% проб, а в образцах ЦСЖ больных нейроборрелиозом - в 10-30% случаев [174]. Следует отметить, что во многих обсуждаемых ранее работах наблюдался низкий процент положительных находок при анализе образцов крови больных ИКБ методом ПЦР [98, 294]. Однако большинство исследователей использовали для анализа небольшие объемы крови или\и проводили выявление ДНК методом однораундовой ПЦР, чувствительность которой ниже двухраундового метода использованного в данной работе. Кроме того, выявление ДНК боррелий проводили у больных с серологически подтвержденным диагнозом ИКБ на поздних сроках заболевания [98, 294].
В большинстве случаев циркуляция боррелий осуществляется благодаря обмену между клещами-перепосчнками и резервуарными хозяевами-позвоночными [58, 108]. Мелкие млекопитающие являются основными прокормителями личинок и нимф таежных клещей в Западной Сибири [45, 58, 59]. Ранее было показано, что мелкие млекопитающие родов Apodemus, Sicista, Myodes, Sorex, Microtus, Neomys и Eutamias являются резервуарными хозяевами боррелий комплекса Я burgdorferi s.l. [58, 59].
Мы детектировали ДНК боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. в 9,7% образцов крови мелких млекопитающих (табл. 7). ДНК выявлена преимущественно у зверьков родов Apodemus, Sorex и Myodes, значительно реже у зверьков родов Sicista и Microtus. Мелкие млекопитающие родов Apodemus, Sorex и Myodes являются фоновыми в Новосибирской области [5]. Полученные результаты согласуются с ранее опубликованными данными по выявлению ДНК В. burgdorferi s.l. в тканях внутренних органов мелких млекопитающих, отловленных в Новосибирской области [5].
Клещи I. persulcatus выполняют доминирующую роль в циркуляции трансмиссивных природноочаговых инфекций на территории Новосибирской области. По данным микроскопии встречаемость боррелий в таежных клещах на территории Новосибирской области составляет от 12,4% до 25% [46]. При исследовании фиксированных и витальных препаратов боррелий были выявлены как в голодных имаго, собранных с растительности, так и у частично или полностью напитавшихся преимагинальных фаз таёжных клещей, собранных с мелких млекопитающих [5]. Количество боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. в индивидуальных зараженных клещах крайне неравномерно и варьирует в очень широких пределах. У зараженных имаго таежного клеща большинство составляли особи со средним и высоким содержанием боррелий (более 10 боррелий на 100 полей зрения) [5, 46]. Мы анализировали выделенную от клещей ДНК методом двухраундовой ПЦР, что позволяет детектировать единичные молекулы геномной ДНК боррелий.
В данной работе выявление и последующее молекулярное типирование ДНК боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. проведено в те же годы, что и выявление ДНК в крови больных. Клещей I. persulcatus собирали в мае-июне на территории Новосибирской области, в пределах которой имеются очаги КЭ [18] и ИКБ [38, 58]. Подавляющее большинство больных ИКБ и КЭ, чья кровь была исследована в данной работе, были инфицированы в этих районах области. ДНК боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. выявлена в 267 образцах таежных клещей (табл. 7). Процентное соотношение положительных проб за время исследования варьировало от 35,5% до 45,8% и в среднем составило 39,3% (табл. 7). Полученные результаты соответствуют приводимым в литературе данным по спонтанной зараженности таежных клещей боррелиями, которая в Западной Сибири составляет от 11,9 до 58,0% [32, 46, 60, 62, 64, 65]. При ПЦР-анализе образцов от таежных клещей ДНК В. burgdorferi s.l. выявлена в 27,4% клещей, отловленных в Омской области, в 24,7% - в Архангельской области и в 24,5% - в Новгородской области. [140, 247].
Использование ПЦР без предварительного культивирования позволяет проводить лишь косвенную оценку встречаемости различных видов боррелий по наличию ДНК. Мы провели изоляцию боррелий от таежных клещей на искусственной питательной среде BSK-H. Для сравнения числа получаемых изолятов и числа положительных в ПЦР проб от клещей, одновременно проводилась изоляция и выявление ДНК боррелий от 306 таежных клещей, отловленных на территории Новосибирской области. Для этого клещей делили пополам, одну часть использовали для детекции ДНК, другую для изоляции боррелий. ПЦР анализ проведен для всех образцов ДНК и всех посевов. Кроме того, проведена изоляция и последующий анализ образцов и изолятов от 258 таежных клещей отловленных в Свердловской области.
Культивированием образцов от таежных клещей из Свердловской области на питательной среде BSK-H получено 17 первичных изолятов, 10 из которых сохранили способность к дальнейшему росту. Для оценки соотношения доли боррелий, способных к росту на среде BSK-H по сравнению с числом выявляемых методом ПЦР было проведено одновременное выявление ДНК методом ПЦР с использованием родоспецифичных праймеров, направленных к гену 16S рРНК. Праймсры направленные к гену 16S рРНК, выбраны таким образом, что позволяют выявлять все виды рода Borvelia, выявляемые в клещах / persulcatas. При исследовании образцов методом ПЦР ДНК боррелий выявлена в 117 (38.2%) и 52 (20,1%) образцах из Новосибирской и Свердловской области, соответственно.
Последующий анализ проведен с праймерами направленными к генам 5S и 23S рРНК, позволяющими детектировать только ДНК боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. При исследовании образцов таежных клещей с использованием праймеров к генам 5S и 23S рРНК, ДНК боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. выявлена в ПО (35,9%) и 48 (18,6%) образцах из Новосибирской и Свердловской области, соответственно. Количество ПЦР положительных образцов, отличалось практически в два раза для Новосибирской и Свердловской области, что соответствует полученным ранее результатам по выявлению ДНК боррелий в таежных клещах в этих областях [46, 57, 65, 113]. Кроме того, отличалось и число изолятов боррелий комплекса В. burgdorferi s.l., сохраняющих способность к дальнейшему росту 11,4% и 3,9% соответственно (табл. 8).
Ранее предполагалось, что не все генетические варианты боррелий одинаково растут на искусственных средах [144, 301]. ПЦР-анализ первичных изолятов с праймерами, направленными к генам 5S и 23 S рРНК, позволил установить, что 56 изолятов из Новосибирской и 16 из Свердловской области являются боррелиями комплекса В. burgdorferi s.l. (табл. 8). В тоже время, для 5 изолятов (4 из Новосибирской и 1 из Свердловской области) не сохранивших способность к росту, подобный анализ дал отрицательные результаты, хотя при микроскопии с предварительной окраской акридиновым-оранжевым во всех этих изолятах определялись спирохетоподобные клетки. Кроме того, при проведении ПЦР с использованием праймеров S1 и S4, направленных к гену 16S рРНК, были получены ПЦР фрагменты ожидаемой длинны (рис. 7).
![Генотипическая гетерогенность спирохет Borrelia afzelii - одного из возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов [Электронный ресурс]](/i/i/4371/180189.png "Генотипическая гетерогенность спирохет Borrelia afzelii - одного из возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов [Электронный ресурс] Фадеева Ирина Анатольевна")
