Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Особенности биологии аэробных метилобактерий 9
1.1. Общая характеристика и таксономия 9
1.2. Особенности метаболизма 18
1.3. Экология аэробных метилобактерий и их роль в природе 23
1.4. Биотехнологический потенциал аэробных метилобактерий 25
Глава II. Гало(алкало)фильные микроорганизмы 26
2.1. Физиологические особенности 26
2.2. Содовые озера - источник галоалкалофильных микроорганизмов 27
2.3. Мраморные памятники как источники галоалкалофильных микроорганизмов 28
2.4. Стратегии адаптации бактерий к высоким значениям солености и рН 30
2.5. Галофильныеи алкалофильные метилобактерий 35
Глава III. Материалы и методы 41
3.1. Объекты исследования 41
3.2. Выделение накопительных культур 41
3.3. Выделение чистых культур 42
3.4. Культивирование бактерий 42
3.5. Электронная микроскопия 43
3.6. Изучение культуральных и физиолого-биохимических свойств 43
3.7. Определение активности ферментов 45
3.8. Аналитические методы 51
3.8.1. Выделение и идентификация изопреноидных компонентов 51
3.8.2. Определение фосфолипидного состава 51
3.8.3 Определение состава жирных кислот 53
3.8.4. Выделение экзополисахаридов и определение мономериого состава 53
3.8.5. Н ЯМР-анализ осмоиротекторов 54
3.8.6. ТСХ метод определения содержания осмоиротекторов 54
3.8.7. ВЭЖХ метод определения содержания эктоина 55
3.8.8. Определение внутриклеточного объема 55
3.9. Молекулярпо-генетические методы и филогенетический анализ 56
3.9.1. Выделение и очистка препаратов ДИК 56
3.9.2. Определение нуклеотидного состава ДНК 57
3.9.3. ДНК-ДНК-гибридизация 57
3.9.4. ПЦР-амплификация гена 16SpPHK 58
3.9.5. ПЦР-амплификация гена ДАБ-аминотрансферазы (ect В) 59
3.9.6. Секвенирование ДНК и филогенетический анализ 59
Глава IV. Выделение и характеристика галофильных алкалофильиых и галофильных нейтрофильных метилобактерий 60
4.1. Выделение и характеристика галоалкалофильных метилобактерий из содовых озер ..60
4.2. Выделение и характеристика галоалкалофильных метилотрофов из разрушающегося мрамора 66
4.3. Выделение и характеристика галофильных нейтрофильных метилобактерий с водорослей Красного моря 70
Глава V. Особенности метаболизма галоалкалофильных и галофильных нейтрофильных метилобактерий 73
Глава VI. Филогенетическое и таксономическое положение новых изолятов 75
Глава VII. Осмоадаптация представителей рода Methylophaga 78
7.1. Состав фосфолипидов и жирных кислот клеток в зависимости от солености среды...78
7.2. Осмопротекторы 79
Глава VIII. Обсуждение 84
Заключение 95
Выводы 97
Литература 98
- Экология аэробных метилобактерий и их роль в природе
- Стратегии адаптации бактерий к высоким значениям солености и рН
- Изучение культуральных и физиолого-биохимических свойств
- Выделение и характеристика галоалкалофильных метилобактерий из содовых озер
Введение к работе
Актуальность темы. Аэробные метилобактерии - физиологическая и таксономическая подгруппа аэробных метилотрофных прокариот, использующих окисленные или замещенные производные метана (но не СЬЦ) в качестве источников углерода и энергии. Аэробные метилобактерии усваивают биогенные и антропогенные С і-субстраты и являются природным барьером, препятствующим поступлению этих соединений в окружающую среду. Во многих экосистемах аэробные метилобактерии играют существенную роль в круговороте биогенных макроэлементов (С, N, Р). Хотя окисленные и замещенные производные метана повсеместно распространены в природе, имеется весьма ограниченная информация о биологии аэробных метилобактерии экстремальных экосистем с повышенными или пониженными значениями рН, солености и температуры. К настоящему времени лучше исследованы аэробные метилобактерии почвенных, пресноводных и морских экосистем. Выделены и охарактеризованы морские умеренно галофильные метилобактерии рода Methylophaga: М. marina и М. lhalassica (Janvier, Grimont, 1985), М. sulfidovorans (de Zvvart ct al., 1996), M. limanica (Доронина с соавт.,1997), а также Methylarciila marina и Methylarciila iciricola (Doronina et al., 2000). Однако практически не изучены метилобактерии из биотопов с высокими значениями солености и рН, втом числе механизмы их осмоадаптации.
Изучение соленых и содовых озер (минерализация до 300 г/л, рП 9.0 - 10.5) на наличие метилобактерии и их роли в галоалкалофильных микробных сообществах было начато нами 7 лет назад. Первые изоляты алкалотолерантных метилобактерии из соленых и содовых озер Южного Забайкалья были идентифицированы как представители нового вида Ancylobacter nalrunum (Доронина с соавт., 2001). Вполне очевидно, что эти изоляты не могут охватить потенциальное экофизиологическое и таксономическое многообразие галоалкалофильных/толерантных метилобактерии. Следовательно, целенаправленный поиск и изучение метилобактерии, адаптированных к условиям экстремальных биотопов, весьма актуальны для понимания роли этих бактерий в различных природных эконишах, а также в связи с перспективами использования в качестве модельных объектов для расшифровки молекулярных механизмов осмоадаптации и реализации биотехнологического потенциала.
Цель и задачи исследования. Цель работы - выделение и характеристика новых гало(алкало)фильиых аэробных метилобактерий из соленых и щелочных экосистем. Для достижения этой цели были поставлены и решались следующие основные задачи:
Выделить чистые культуры аэробных метилобактерий из соленых и содовых озер Южного Забайкалья и Монголии, водорослей Красного моря и разрушающегося мрамора.
Идентифицировать галоалкалофильные изоляты методами полифазной таксономии.
Исслсдовагь основные механизмы осмоадаптацин выделенных галофильных метилобактерий.
Научная новизна работы. Впервые выделены представители метилобактерий рода Methylophaga из соленых и содовых озер и из разрушающегося мрамора, идентифицированные на основании физиолого-биохимичсских, хемо- и генотаксономических характеристик как новые виды М. alcalica, М. natronica и М. murata. Впервые обнаружены Ві2-независимьіе метилобактерий рода Methylophaga. Бактерии выделены с поверхности водорослей Красного моря и на основании данных ссквенирования гена 16S рРПК предварительно отнесены к известному виду М. marina. Впервые показано, что в ответ на повышение солености среды гало(алкало)фильные метилобактерий рода Methylophaga синтезируют органические осмопротекторы (эктоин, глутамат и сахарозу), их суммарное внутриклеточное содержание уравновешивает осмолярность среды. Определены пути биосинтеза этих осмопротекторов из метанола. Установлено, что метилобактерий соленых и щелочных биотопов находятся в трудно разделимых ассоциациях с метанотрофами и гетеротрофами, поставляющими метилобактериям Ci-интермедиаты и ростовые факторы. Полученные результаты свидетельствуют о широком распространении и важной экофизиологической роли гало(алкало)фильных аэробных метилобактерий, как необходимого функционального компонента микробиоты соленых и содовых биотонов.
Практическое значение. Расширен спектр детально охарактеризованных коллекционных культур аэробных метилобактерий, устойчивых к высоким значениям pll и солености. Показано, что представители рода Methylophaga способны па основе дешевого непищевого возобновляемого сырья - метанола накапливать эктоин (до 20% от веса сухой биомассы), что позволяет считать их потенциальными продуцентами этого биопротектора широкого спектра действия, защищающего клетки и биомолекулы от губительного влияния высоких температур, высушивания и ультрафиолетового излучения. Исследованные галоалкалофильпые, а также галофильные нейтрофильные метилобактерии рода Methylophaga могут являться модельными объектами для выявления особенностей их осмоадаптации на молскулярно-геистическом уровне с целью создания более эффективных штаммов-продуцентов эктоина.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на V и VI конференциях молодых ученых г. Пущино (2001, 2002), на VII симпозиуме Symposium on Bacterial Genomics and Ecology (Bergen, Norway, 2002), VIII и IX Международных Путинских школах-конференциях молодых ученых (Пущино, 2004 и 2005), на молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005), а также на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (2000-2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 6 тезисов.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 114 страницах м состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 215 ссылок, из них 40 на русском и 175 на английском языках, содержит 20 таблиц и 13 рисунков.
Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов и метилотрофии в рамках плана научно-исследовательских работ ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАИ по теме "Структурно-функциональное и таксономическое разнообразие аэробных мстилотрофов" (№ Госрегистрации 0120.0403398).
Автор искренне признателен всем сотрудникам лаборатории метилотрофии и радиоактивных изотопов, способствовавшим выполнению дайной диссертационной работы, а также д.б.н., проф. Намсараеву Б.Б. (Институт общей и экспериментальной биологии СО РАИ, г. Улан-Удэ), д.б.н. Сорокину Д.Ю (Институт микробиологии им. СИ. Виноградского РАН, г. Москва), к.б.н. Петушковой Ю.П. (МГУ, г. Москва), д.б.н. Осипову Г.А. (Академическая группа ак. Исакова 10.Ф., РАМН, г. Москва), к.б.н. Калиману А.В. (Институт Белка РАН), к.б.н. Сузиной Н.Г., к.х.п. Сахаровскому В.Г., к.х.н. Шляпникову М.Г, к.х.н. Адапину В.М., Ильченко В.Я.
Особую благодарность автор выражает своим учителям д.б.н., проф. Троцснко 10.А. и д.б.н. Дорониной Н.В. за постоянное внимание и полезные советы.
Экология аэробных метилобактерий и их роль в природе
Восстановленные Сі-соединения широко распространены в природе. Многие из них (метан, метанол, формальдегид, формиат, галометаиы, метилированные амины и сульфиды) являются биогенными соединениями, но наряду с этим содержатся в газовых выбросах и сточных водах целого ряда промышленных производств. Появление некоторых Ci-соединений, например, дихлорметана, обусловлено исключительно производственной деятельностью человека. Большинство С- соединений высокотоксичны и канцерогенны, а галометаны разрушают озоновый слой нашей планеты. Метилотрофы окисляют биогенные и антропогенные Сі- соединения и таким образом участвуют в биогсохимических процессах биосферы.
Аэробные метилобактсрии широко распространены в природе: почвах, рисовых полях, илах и поверхностной пленке воды пресных водоемов и прибрежных морских зон, шахтных водах, активных илах очистных сооружений, листьях, корнях и коре растений, навозе (Доронина. 1999).
До недавнего времени основной ролью аэробных метилотрофов считали их участие в глобальном цикле углерода. Меганотрофы, окисляя метан, препятствуют проникновению этого парникового газа в атмосферу. Метилобактерии минерализуют г&тометаны (Leisinger, 1996; Троценко, Доронина, 2003), мстилссриистые соединения (deZwart et а!., 1996), метилированные амины (Троценко, Логинова, 1979). Вместе с тем исследования, проведенные в последние годы, указывают на новую, ранее не известную роль метилотрофов в природе. Метанол повсеместно встречается в природе и достигает 40-46% от общего обнаруженного летучего органического углерода атмосферы (Fall, 1996), то есть CII3OII -это второй по содержанию после метана органический газ атмосферы. В среднем, его концентрация в приграничных слоях атмосферы составляет 1 - 10 ppb (Jacob et al., 2005). Общее количество метанола, выделяемого ежегодно в атмосферу, оценивается по разным источникам в 100 - 200 млн. т. в год (Jacob et al., 2005; Galbally, Kirstine, 2002). Причем, 60 - 70% от этого количества выделяется растениями и, следовательно, растения являются глобальным источником метанола. Кроме того, экспериментально доказано, что растения образуют метанол в результате действия внутриклеточных пектинметилэстераз и лигниндеметилаз, особенно в молодых, активно растущих листьях, и являются глобальными поставщиками атмосферного CH3OII, В последнее время появились публикации о трофической связи метилобакгерии с растениями. Это объясняется функционированием "метанолыюго цикла", т.е. образованием и выделением растениями метанола, который активно используется аэробными метилобактериями как источник углерода и энергии. В свою очередь, метилотрофы поставляют растениям витамины, фитогормопы (цитокинины и ауксины), необходимые для их нормального роста (Троценко с соавт., 2001). Таким образом, аэробные метилобактерии повсеместно распространены в природе, играют важную роль в глобальном круговороте биогенных макроэлементов. 1.4. Нііотсхіїолопічсск иіі потенциал аэробных метилобактерий В настоящее время рассматривается ряд практических задач, решение которых связано с использованием метилобактерий: Получение кормового белка. Биомасса метилобактерий может быть использована в качестве белковой добавки в корма. По составу и количеству незаменимых аминокислот биомасса метилотрофов сопоставима с рыбной и соевой мукой. Биосинтез ценных метаболитов: Пояи-Р-гидроксибутират/салерат (1ІГБВ). Многие прокариоты синтезируют и запасают ПГБВ. До сих пор себестоимость получения ПГБ/В служит основным препятствием его промышленного производства и широкого внедрения. Одна из причин -высокая стоимость субстратов для культивирования микроорганизмов. ПГБ накапливающие метилобактерий могут быть использованы для производства, поскольку, метанол, имеет низкую цену, высокую чистоту, хорошую растворимость в воде. Экзополисахариды. Многие метилобактерий синтезируют из метанола полисахариды, перспективные для использования ряда отраслей промышленности. Причем выход и состав можно регулировать факторами и условиями культивирования. Витамины, Факультативные и облигатные метилотрофы образуют витамин В . Наиболее высокое содержание витамина Bj2 выявлено у представителей рода Methylobacterium, выход которого существенно выше при использовании Сі-, нежели С„-субстратов (Large, Bamforth, 1988; Иванова с соавт., 2006). Фитогормоны (цитокииины и ауксины). Установлено, что аэробные метилотрофы постоянно ассоциированы с растениями. Исследования на гнотобиотичсских растениях показали, что колонизация растений метилотрофами приводит к повышению скорости роста, регенерациоппого потенциала и способности к корпсобразованию. Обнаружено, что метилобактерий способны синтезировать ауксины и цитокииины (Иванова с соавт., 2000; 2001). В целом, способность метилобактерий стимулировать рост и морфогенез растений in vitro указывает на перспективность их применения в различных направлениях современной экспериментальной физиологии и биотехнологии растений. Ферменты. Энзимологические исследования выявили высокую активность целого ряда ферментов у метилобактерий. Это послужило основой для выделения чистых препаратов ферментов, которые могут использоваться в научных исследованиях, медицине и аналитических целях. Биодеградация токсичных соединений. В настоящее время выделены метилобактерий, способные использовать в качестве источников углерода и энергии целый ряд токсичных поллютантов (метанол, формальдегид, метилированные амины, метилсернистые соединения, галомстаны, мстилацетат, этилацстат, ацетон, толуол, МТБЕ).
Стратегии адаптации бактерий к высоким значениям солености и рН
Большой интерес к адаптации микроорганизмов к экстремальным условиям обусловлен поисками жизни на других планетах, а также установлением физико-химических пределов, в которых могла возникнуть жизнь на Земле и возможным влиянием экстрсмофильиых микроорганизмов на глобальные и локальные биогсохимические процессы. Жизнь микробов в соленых и содовых экосистемах обусловлена наличием особых механизмов, позволяющих клеткам нормально функционировать в условиях солевого стресса и щелочного рН. Устойчивость бактерий к этим экстремальным воздействиям внешней среды обусловлена реализацией нескольких стратегий адаптации. Во-первых, накопление внутри клеток неорганических ионов или низкомолекулярных органических веществ, необходимых для компенсации внешнего давления (Galinski. 1995). Во-вторых, изменение транспортных систем цитоплазматической мембраны для выброси из клетки ионов Na+, поглощения из внешней среды ионов К+ и органических осмопротскторов (Poolman, Glaasker, 1998; Venlosa et al., 1998). В-трстьих, замена или модификация клеточных компонентов, в том числе изменение жирнокислотного и фосфолинидного состава мембран (Kates, 1986), формирование дополнительных поверхностных структур (Beveridge ct al., 1997) и изменение аминокислотного состава белков наружной мембраны, в частности, увеличение доли кислых аминокислот (Кашнер, 1981), что позволяет клеткам выживать в условиях высокой осмолярности среды. Кроме того, обитателям содовых экосистем необходимо поддерживать рН-гомеостаз и, следовательно, возникает потребность в функционировании Na /ІҐ аптипорта (Скулачев, 1985). рН-гомсостаз. Главной проблемой микроорганизмов, растущих при высоком рН, является регулирование внутриклеточного рН в пределах, близких к нейтральным. Эга регуляция должна быть оперативной и эффективной во избежание ингибироваиия роста и даже гибели клеток. Поддержание внутриклеточного рП в узком диапазоне, несмотря на резкое и значительное изменение рН окружающей среды, называется рН-гомеостазом. Для алкалофильных бактерий различных физиологических групп было показано, что их внутриклеточный рі I не превышает 9.0 - 9.5 при рН среды 10.5- 11.5 (Krulwich, 1995). Для поддержания рП в цитоплазме па определенном уровне клетки используют как пассивный, так и активный механизмы. К пассивным механизмам можно отнести снижение проницаемости мембран для ионов и забуферивание цитоплазмы аминокислотами белков, а также органическими осмолитами. Активные механизмы включают транспорт ионов натрия, калия и протонов (Booth, 1999).
Ос.моадаптация. Как известно, в микробном мире реализуются две стратегии поддержания и регуляции осмотического равновесия (Roberts, 2005; Хочачка. Сомеро, 1988). Первая стратегия предусматривает избирательное накопление неорганических ионов в цитоплазме (так называемый "солевой" тип осмоадаптацин), что требует дополнительной приспособленности клеточных органелл и всей ферментативной системы. Солевую стратегию используют две филогенетически удаленные группы: аэробные экстремально галофильные археи порядка Halobacteriales и анаэробные галофильные бактерии порядка Halanacrobiales (Galinski, Truper, 1994; Galinski. 1995; Orcn,1999). Вторая стратегия - уравновешивание осмотического давления окружающей среды, связана с накоплением низкомолекулярпых органических соединений, не влияющих на физиологические функции клетки (стратегия "совместимых растворимых веществ"). Такой тип осмоадаптацин не предполагает существенных структурно-функциональных изменений клеток, что обеспечивает более гибкий способ адаптации к осмотическим колебаниям. Следует отметить, что многие совместимые растворимые вещества -осмопротекторы, накапливаемые клетками в молярных концентрациях, ответственны за осмотический баланс и в тоже время метаболически инертны (Galinski. Truper, 1994.).
Идентифицирован целый ряд таких соединений, характерных для разных групп гачофилов (Roberts, 2005). Эукариоты (водоросли и дрожжи) накапливают главным образом углеводы (полиолы, глицерин, маннит, арабшюзу и др.), реже - аминокислоты и неорганические ионы (Апдреищева, Звягильская, 1999). Для гетеротрофных аэробных эубактерий, (не)галофилов и галотолераптов характерно накопление при высокой солёности среды азотсодержащих соединений (аминокислот, бетаинов и эктоинов) (Galinski. 1995).
Проведенный скрининг осмопротекторов у более чем 200 галофильпых изолятов в сочетании с данными о присутствии органических осмопротекторов у цианобактерий (Reed et al., 1984), апоксигениых фототрофных бактерий (Triiper, Galinski, 1986), аэробных хемогетеротрофов позволил Galinski (1995) разделить эти соединения на следующие основные группы: сахароза, иолиолы и их производные (глюкозилглицерин); цвиттериоииыс соединения и бетаины (глицинбетаин); аминокислоты (пролин, глутамат, 5-оксопролин); Л-ацетилированные диаминокислоты (ацетилорнитин, ацетиллизип); амидные производные глутамата (/У-карбамоилглутамиламид); эктоины (экгоин, гидроксиэктоии), метилированные сульфосоедипения (такие как диметилсульфониопропионат), которые накапливаются у цианобактерий и морских водорослей. В итоге эти исследования привели к ряду важных обобщений: 1. Синтезируемые cle novo иолиолы, такие как глицерин, арабит, инозит, часто накапливаются у галофильных/галотолераитных грибов, устойчивых к солям растений, но не обнаружены у галофильпых бактерий. 2. Заряженные аминокислоты, такие как глутамат, /?-глутамат, бетаинглутамат и другие, никогда не накапливаются в очень больших количествах (до 400 мМ). 3. Все осмолиты, синтезированные или поглощаемые из среды, накапливаются в концентрациях, превышающих 500 мМ, и являются полярными, хорошо растворимыми молекулами, не несущими суммарного заряда.
Представляет интерес разделение осмолитов на основании затрачиваемых клеткой энергетических эквивалентов для их биосинтеза (Оген, 1999). При этом наиболее энергетически выгодным является синтез глицерина, затем эктоина и глицин-бетаина, а наименее выгоден биосинтез сахарозы/трегалозы. Многие бактерии способны накапливать одновременно несколько осмопротекторов, при этом преобладание того или иного осмолита во многом определяется энергетическим статусом клетки и доступностью источника азота.
Накопление эктоина, 5-оксопролина и сахарозы в ответ на увеличение солености среды недавно обнаружено у меганотрофов Methylomicrobium alcciliphilum 20Z и Melhylobacler modestohalophilus 10S (Khinelcnina et al., 1999). Показано также, что аэробные галофильные мстилобактерии рода Mcthylarcula синтезируют два основных осмопротектора- глутамат и эктоии (Doronina et al.,2000).
Накопление сахарозы, как правило, свойственно цианобактериям, обитающим в пресноводных и морских экосистемах, и обнаруживается у цианобактерий с низкой устойчивостью к солевому стрессу (до 0.7 М NaCl). Сахароза часто присутствует у галофильпых бактерий как минорный компонент ( 500 мМ) в сочетании с другими более эффективными совместимыми веществам, такими как бетаин и эктоин (Severin et а!.. 1992). Установлено, что сахароза предохраняет мембраны, белки и целые клетки от обезвоживания, связанного с увеличением солености среды (Louis et al.,1994), а также при замораживании-оттаивании (Billi ct al., 2000).
Глутамат - широко распространенный бактериальный осмолит. Уровень глутамата у бактерий, подвергнутых солевому стрессу, как правило, не превышает 500 мМ. Это значение достигается временно, перед запуском последующих адаптационных механизмов, то есть аккумуляция глутамата является первичным ответом на солевой стресс, являясь, по-видимому, общим свойством грам отри нательных бактерий (Antranikian. 1998).
Изучение культуральных и физиолого-биохимических свойств
Трансальдолазу (НФ 2.2.1.2) определяли с сопрягающими ферментами (Colby. Zatman, 1975). Реакционная смесь в 2 мл содержала (мкмоль): глицил-глициновый буфер, рН 7.6 -100; MgCl2 - 2; ТИФ - 0.2; НАДФ - 1,0; глюкозо-6-фосфатдегпдрогеназу - 0.4 ед.; рибозофосфатизомеразу - 3 ед.; транскетолазу - 2 ед.; рибулозофосфатэпимеразу - 3 ед.; экстракт. Реакцию начинали добавлением 5 мкмоль рибозо-5-фосфата. Не было необходимости добавлять глюкозофосфатизомеразу, так как фермент присутствовал в бесклеточных экстрактах.
Цитратсннтазу (НФ 4.1.3.7) определяли спсктрофотомстричсски по восстановлению дитионитробепзоата (ДТНБ) при 412 им (Levering et al., 1984). Реакционная смесь в 2 мл содержала (мкмоль): Трис - ПС1 буфер, рН 8,0 - 100; ацетил-КоА-0,6; ДТНБ - 0,2; экстракт. Реакцию начинали добавлением 1 мкмоль оксалоацетата натрия. Изоцитратдсгидрогсиазу (Цф 1.1.1.42) определяли по скорости восстановления НАДФ. Реакционная смесь в 2 мл содержала (мкмоль): К-фосфатный буфер, рН 7.3 - 150; ПАД(Ф) - 1; DL-изоцитрат натрия - 10; экстракт. Реакцию начинали добавлением изоцитрата натрия.
Изоцитратлиазу (НФ 4.1.3.1) определяли спектрофотометрически - по образованию фепилгидразона глиоксилата при 324 им (Dixon, Kornberg, 1959). Реакционная смесь в 2 мл содержала (мкмоль): К-фосфатиый буфер, рН 6.8 - 150; MgCb - 10; фенилгидразин -6.5; цистеин-ІІСІ -4; экстракт. Реакцию начинали добавлением 5 мкмоль изоцитрата калия. Мала і сии і азу (НФ 4.1.3.2) определяли по восстановлению ДТНБ при 412 нм (Levering et al., 1984). Реакционная смесь в 2 мл содержала (мкмоль): К-фосфатный буфер, рП 8.2 - 50; MgCb - 5; ДТНБ - 0.1; ацетил - КоА - 0.3; экстракт. Реакцию начинали добавлением 0.3 мкмоль глиоксилата натрия.
Глутаматцсгидрогсназу (НФ 1.4.1.2) определяли в реакционной смеси, содержащей в 2мл (мкмоль): Трис - IIC1 буфер, рП 7.5 - 100; NH4C1 - 80, НАД(Ф)Н - 0.5, экстракт. Реакцию начинали добавлением 10 мкмоль ожетоглутарата натрия (Doherty, 1970). Глутаматсшггазу (НФ 1.4.1.13) определяли по окислению ПАД(Ф)П (Meers. Tempest, 1970). Реакционная смесь в 2мл содержала (мкмоль): Трис - НС1 буфер, рП 7.6 - 100; сх-кетоглутарат - 10; ПАДИ или ПАДФП - 0,25. Реакцию начинали добавлением 25 мкмоль глутампна.
Глутаминсинтетазу (НФ 6.3.1.2) определяли колометрически модифицированным методом (lllliot et al.,1955) в у-глутамилтрапсферазпой реакции. Реакционная смесь содержала в 7.52 мл (мкмоль): имидазольный буфер рП 7.15 - 6.75: MgCb-0.135; арсенат натрия - 12.5; ЛДФ - 0.18; гидроксиламин - 20; экстракт. Реакцию начинали добавлением 20 ммоль L-глутамина, смесь инкубировали 10 мин при 30С и останавливали добавлением 0.6 мл раствора, содержащего 55 г FeCl.?, 20г ТХУ и 21мл ПСІ в 1л воды. Контролем служила та же смесь, но без L-глутамипа. Затем смесь центрифугировали и измеряли поглощение при 540 им. 0.63 единицы поглощения в 2мл кювете соответствуют 1мкмоль/мл глутамилгидроксамата - продукта реакции.
УДФ-глюкозопирофосфорилазу (ЕС 2.7.7.9) и сахарофосфатсшпазу (ЕС 2.4.1.14) определяли по скорости образования УДФ, регистрируя с помощью сопрягающих ферментов лактатдегидрогеназы (ЛДЕ) и пируваткшшы (ПК). Реакционная смесь в 2мл содержала (мкмоль): Tris-HCl буфер (рН 7.8) - 10; УТФ -0.5; глюкозо- 1- фосфат натрия -0.5; ФЕП - 5; MgCl2 - 50; НАДИ - 0.25; ПК - 4 Ед.; и ЛДГ -1 Ед. Реакцию начинали добавлением 0.5 мкмоль фруктозо-6-фосфата натрия.
Аснаріаткішазу (НФ 2.7.2.4) определяли двумя методами. 1) Регистрируя образование АДФ с помощью сопрягающих ферментов лактатдегидрогеназы (ЛДЕ) и пируваткиназы (ПК) (Wampler and Westhead, 1968). Реакционная смесь в 1 мл содержала (мкмоль): Трис-НС1 буфер рП 7.5 - 100, L-аспартат натрия - 1, ЛТФ - 5, фосфоенолпируват натрия - 0.5, MgCh - 50, НАДН - 0.5, ПК - 10 ед., ЛДЕ - 10 ед., экстракт. Реакцию начинали добавлением L-аспартата натрия.
2) По образованию аспаргилгидроксамата (Truffa-Bachi and Colien, 1970). Реакционная смесь 0.5 мл содержала (мкмоль): Трис-HCl рП 8.0 - 100, КС1 - 200, MgCb -12, гидроксиламин - 50 (нейтрализованный КОН), АТФ -10, L-аспартат натрия -15. Реакцию начинали добавлением аспартата и смесь инкубировали 30-60 мин при 30С. Реакцию останавливали добавлением 0.75 мл раствора хлорида железа (10% FeCl3x6H20, 3.3% ТХУ, 0.7N НС1). После центрифугирования (5 мин, 14000 об/мин), определяли оптическую плотность супернатанта при 540 им. За единицу активности аспартаткиназы принимали образование 1 мкмоль аспаргилгидроксамата в 1 мин.
Аснартатиолуальдсгид дешдрогеназу (НФ 1.2.1.11) определяли спектрофотометрически по окислению НАДФН. Реакционная смесь в 1 мл содержала (мкмоль): Трис-HCl буфер рП 7.5 - 100, L-аспартат натрия - 10 тМ, АТФ - 8, ПАФИ - 0.5, экстракт. Днаминобутиратацетилтраисферазу (ДАБАцТ) (НФ 2.3.1.178) определяли при 20С по образованию 5-тио-2-питробспзойной кислоты (Є412 13,6 мМ"1 см ) в результате взаимодействия 5,5 -дитиобис-(2-нитробензойной кислоты) (ДТНБ) с сульфгидрильными группами KoASH, образующимися в ходе реакции (Srere, 1969). Реакционная смесь (1 мл) содержала (мкмоль): Tris-HCl буфер - 100, рН 9.0, ДТНБ -0.1, ацетил-КоА - 1, КС1 - 200 и Ь-2,4-диаминобутират (ДАБ) - 10. За единицу активности (11) ДАБАцТ принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкмоль KoASI 1 за 1 мин. Диаминобутиратамннотрансферазу (НФ 2.6.1.76) определяли модифицированым методом, регистрируя образующийся глутамат с о-фталевым альдегидом (Дарбе. 1989). Реакционная смесь (1 мл) содержала (мкмоль): К-фосфатпый буфер рП 8.0 - 100, пиридоксальфосфат - 0.2, u-кетоглутарат натрия - 30, ДАБ - 20, экстракт. Смесь, содержащую буфер, экстракт и пиридокс&чьфосфат, инкубировали 20 мин при 25С, затем добавляли ДАБ и инкубировали в течение 1 ч при той же температуре. Контролем служили варианты без а-кетоглутарата. Фиксировали 5 мкл 1 М хлорной кислоты и центрифугировали (12000 об/мин 5 мин). Супсрнатант нейтрализовали 1 М КОН, повторно центрифугировали и определяли глутамат хроматографией на ВЭЖХ.
Реактив: 50 мг г;-фталевого альдегида растворяют в 1.25 мл метанола и добавляют 50 мкл 2-меркаптоэтаиола и 11.2 мл 0.4 М боратного буфера, подщелоченного до рН 9.5 4 М NaOII. Реактив стабилен в течении 1-2 педель. мкл образца смешивали с 5 мкл раствора реактива. Через 1 мин добавляли 45 мкл ацетата натрия (рН 7.0) и немедленно наносили на колонку SEPARON SIX С-18 (150x3.3 мм, 5 мкм, Чехия), скорость потока 1 мл/мин. В качестве внутреннего стандарта служила соответствующая аминокислота. Анализируемый раствор вводили с помощью инжекционного клапана, снабженного петлёй 20 мкл. Хроматографические пики записывали и обрабатывали с помощью интегратора ("LKB 2220"). Измерения проводили на флуориметре ("Gilson 121") с кюветой 9 мкл и фильтрами для возбуждения при 305-395 им и эмиссии при 420-650 им. Для градиентного элюирования смешивали предварительно дегазированные растворы: 0.1 М ацетат натрия рН 7.2 и метанол. Эктоинсинтазу (НФ 4.2.1.108). Активность фермента определяли по образованию эктоина (Peters et al, 1990). Реакционная смесь (1 мл) содержала (мкмоль): 100 - Na-фосфатный буфер, рН 9.0, 300 - NaCl, 20 - Л у-ацетилдиамипобутирата. После инкубации при 25С в течение 30 мин реакцию останавливали кипячением. После центрифугирования (12000 об/мин, 20 мин) супсрнатант высушивали па вакуумном испарителе. Эктоин регистрировали методами ВЭЖХ и НЯМР.
Выделение и характеристика галоалкалофильных метилобактерий из содовых озер
Содовые озера принадлежат к экстремальным экосистемам и характеризуются рядом неблагоприятных физико-химических условий - высокой минерализацией, соленостью и рН. Несмотря на это, в содовых озерах обнаружено широкое разнообразие микробного сообщества, которое представлено преимущественно ирокариотными организмами (Заварзин с соавт., 1999). 13 этих биотопах показано присутствие представителей различных физиологических групп, осуществляющих продукцию и деструкцию органического вещества.
Из образцов ила содовых озер Южного Забайкалья и Монголии нами впервые выделены 21 ассоциативные аэробно метилотрофпые культуры, активно растущие при рП 9-Ю на среде с метанолом в качестве источника углерода и энергии. В чистые культуры были выделены 7 ачкалофильных умеренно галофильных штамма, 6 из которых являются облигатными метилотрофами, а 1 - ограниченно факультативным.
Все выделенные алкалофильные и умеренно галофильные штаммы сходны по морфологии и физиолого-биохимическим свойствам, но имеют ряд отличий. Так, штаммы М9, М39, Бур2 и БТ на агаризованной среде образуют колонии с гладкой поверхностью и ровным краем, а штаммы М8, М50 и Бур4 - с шероховатой поверхностью и неровным краем. Оптимальная концентрация соли в среде для штаммов Бур2, Бур4 и БТ составляет 3 - 4%, а для штаммов М8, М9, М39 и М50 - 3-6%. Шесть изолятов (М8, М9, М39, М50, Бур4 и БТ) являются облигатными метилотрофами, а один (Ьур2) ограниченно факультативным. В жирнокислотном составе клеток у галоалкалофильных штаммов преобладают С6:о, Ci6:i и d8:i.
Из выделенных нами галоалкалофильных бактерий содовых озер наиболее детально были исследованы штаммы М39, М50 и Бур2. Уровень ДНК гомологии новых изолятов с типовыми штаммами рода Methylophaga (Л/, marina АТСС 35842 , Л/, thalassica АТСС 331461" и М. sulfuiovoram RBI LMP 95.210х) составил 25 - 30 %, что определенно свидетельствует об их принадлежности к этому роду. ДНК-ДНК гибридизация этих штаммов между собой выявила высокий уровень гомологии штамма М39 со штаммом М50 (92-95%), что указывает на их принадлежность к одному виду. На основании фено- и геиотипических особенностей, а также уровней ДНК-ДИК гибридизации и по данным секвенирования генов 16S рРНК, выделенные галоалкалофильные штаммы отнесены к новым видам рода Melhylophaga: Л/, alcalica (штаммы М39 и М50) и Л/, nalronica (штамм Бур2). Штаммы М8 и М9 предварительно отнесены к новому виду Л/, alcalica. Каменные памятники подвержены активным процессам биодеструкции микробными сообществами. Микроорганизмы биопленок на поверхности камня связаны трофическими взаимодействиями. Большим разнообразием микроорганизмов характеризуются поверхности разрушающегося мрамора. Отдельные представители этой микробиоты отличаются высокой устойчивостью к неблагоприятным внешним факторам, способностью проникать в толщу субстрата и длительное время развиваться на мраморе, вызывая его постепенное разрушение (Воск,1993; Горбушина, 2002).
Выделенный из образца разрушающегося мрамора новый галоалкалофильный ограниченно-факультативный метилотроф КрЗ реализует РМФ путь Сі метаболизма. По физиолого-биохимическим и хемотаксономическим свойствам штамм КрЗ близок метилобактериям рода Aklhylophaga. Кроме того, штамм КрЗ имеет сходство на уровне рода с типовыми культурами рода Methyiophaga, по данным ДНК-ДНК гибридизации (23 -41%) и секвенирования гена 16S рРНК (94 - 96%). Однако в отличие от известных видов рода Methyiophaga новый изолят растет в более широком диапазоне рН, концентраций NaCl, температур (табл. 4), т.е. имеет более гибкий метаболизм и способен адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды. На основании проведенных исследований штамм КрЗ отнесен к новому виду рода Methyiophaga - М. murata. Интересно отмстить, что к этому виду предварительно отнесены штаммы Бур 4 и БТ, выделенные из содовых озер Южного Забайкалья, имеющие сходства по данным секвенирования гена 16S рРНК 99.3 - 99.5%) с М. murata. Это указывает на широкую распространенность нового вида и независимость от специфических местообитаний. Отличительной особенностью штамма КрЗ является способность к росту при низких температурах (до 0 С). Кроме того, обнаружено, что при снижении температуры культивирования в клетках штамма КрЗ возрастает относительное содержание ненасыщенных жирных кислот. У бактерий жирные кислоты сосредоточены в основном в фосфолипидах мембран и переход от жидкого к кристаллическому состоянию протекает при более низкой температуре у тех фосфолнпидов, которые содержат больше ненасыщенных жирных кислот. Поскольку степень текучести мембраны определяет ее функциональную способность, наблюдаемые изменения в жирнокислотном составе липидов штамма КрЗ, вызванные повышением или снижением температуры роста, представляют собой гомеостазиый механизм.
При лимите по азоту, фосфору, железу, а также при недостаточной аэрации изолят КрЗ синтезирует ЭПС, который способен предохранять клетки от высыхания. Обнаружено, что штамм КрЗ закисляет среду обитания, образуя муравьиную кислоту (до 10 мМ), что, может быть одной из причин, вызывающих разрушение мрамора. Таким образом, новый метилотроф весьма приспособлен к существованию на поверхности камня, где даже в течение суток происходят существенные изменения температуры, рН и солености.
С зеленых морских водорослей Ulva hictuca и Cystoseira (rinoiles, отобранных в разных участках прибрежных зон Красного моря, выделены умеренно галофильные метилобактерии. Два изолированных аэробных грамотрицатсльных штамма являются ограниченно-факультативными метилотрофами, т.к. наряду с С і-субстратам и используют только фруктозу и реализуют РМФ- путь Сі- метаболизма.
Красное море имеет высокое содержание соли (8 % NaCl). Выделенные нами штаммы КМЗ и КМ5 приспособлены к существованию при такой солености, поскольку оптимально растут при 5-9 % NaCl, синтезируют ск novo и накапливают впутриклеточно осмопрогекторы - эктоии, глутамат и сахарозу. Показано, что содержание этих веществ в клетках исследуемых метилобактерии зависит от концентрации NaCl в среде и пропорционально возрастает при увеличении солености.
Штаммы КМЗ и КМ5 идентифицированы методами полифазной таксономии, включая секвеиирование генов 16S рРПК, как штаммы известного вида М. marina (99% сходства).
Все выделенные штаммы из проб содовых озер, соскоба разрушающегося мрамора и водорослей Красного моря принадлежат к известному роду метилобактерии Methylophaga. По-видимому, использованные среды и условия культивирования благоприятствовали выделению метилобактерии этого рода. Недавние исследования методом FISII с использованием специфичных зондов показали, что метилобактерии рода Methylophaga широко распространены в морских образцах. Так, во всех 10 исследуемых пробах морских осадков побережья Франции in situ гибридизация с зондом МРН-730, специфичным для представителей \kthylophaga, выявила присутствие метилобактерии этого рода. Более того, в 5 образцах с использованием другого видоспецифичного зонда МРН-994 обнаружены штаммы М marina (Janvier, 2003). Интересно отметить, что некультивирусмые формы метилобактерии рода Mcihylophaga были обнаружены в денитрифицирующем реакторе (Labbe et al., 2003). С использованием молекулярно-биологических методов было показано их широкое распространение: 67 из 94 полученных клонов имели 90-97% сходства по данным секвенирования 16S рДНК с представителями рода Melhylophaga, 63 из которых проявили 97% сходства с М. alcalica.