Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время к числу актуальных и сложных медицинских и социальных проблем, на решение которых направлены значительные усилия и средства здравоохранения, относится проблема борьбы с сифилисом. Отмечается рост числа заболеваний сифилисом как у нас в стране, так н за рубежом. Общепризнанно, что одним из направлений борьбы с сифилитической инфекцией, является повышение эффективности ее лабораторной диагностики, ведущее место в которой занимает серодиагностика.
Результаты исследований в области серодиагностики сифилиса на данный период проанализированы в целом ряде работ как отечественных (Беднова В.Н., Лосева А.К., 1985; Овчинников Н.М., Беднова В.Н., Делекгорский В.В., 1987; Дмитриев ГА., Брагина Е.Е., 1996), так и зарубежных (Johonson P.C.Farnie MA., 1994; Larsen SA. et al., 1995,и др.) авторов. Полученные данные позволили, с одной стороны, определить комплекс диагностических тестов, предназначенных для массовых обследований на сифилис и диагностики различных клинических форм сифилитической инфекции, а, с другой стороны, использовать в тестах все более специфические трепонемные антигены.
Так в Российской Федерации регламентирован комплекс стандартных реакции (КСР) серодиагностики сифилиса, в который входит РСК со специфическим ультраозвученным трепонемным (УЗТА) и неспецифическим жардиолнпиноБЫМ (КА) антигенами. Известным ограничением РСК с УЗТА является недостаточные специфичность и чувствительность при ранних и поздних формах сифилиса, а достоинством - широкое ее использование в лабораториях любого уровня и возможность количественной оценки результатов (Овчинников Н.М., Беднова В.Н., Делекгорский В.В., 1987).
Диагностика ранних, поздних и латентных форм сифилиса, а также дифференцирование неспецифических положительных результатов КСР обеспечиваются за счет постановки РИФ-абс, ее модификации с определением в сыворотке крови людей IgM, а также реакции иммобилизации трепонем (РИТ) (Борисенко К.К., Беднова В.Н. с соавт., 1990; Дмитриев ГА., Брашна Е.Е., 1996; Oranne G., D'Halhvyn М.А., Larsen S.A., 1993).
Вместе с тем недостатком данных реакций являются технологическая сложность их обеспечения и высокая стоимость реализации. Кроме того, в настоящее время для данных тестов в нашей стране отсутствует решение задачи производственного выпуска антигенов (Дмитриев ГА., БрапшаЕ.Е., 1996).
В последние годы разрабатываются, разработаны и применяются, как дополнительные, новые специфические тесгы на сифилис - нммуно-ферментный анализ (ИФА) и его модификации с определением в сыворотке крови людей антитрепонемных IgM или IgG антител и реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). Достоинством данных тестов является гюстаточная их чувствительность и специфичность, а к числу недостатков следует отнести отсутсгаие количественной оценки результатов реакций (ИФА, РПГА), сложность выделения и клонирования биохимических комплексов трепонем с различной молекулярной массой и высокая стоимость ИФА теста (Paris - Hameliu A. el al., 1985; Silletti R.P., 1995; Дмитриев Г.А., 1996; Беднова В.Н. с соавт., 1985). Выше перечисленные тесты в качестве антигена используют достаточно хорошо изученные дезинтеграты ПБТ, КБТ, выделенные из них химические фракции и биохимические комплексы с различной молекулярной массой.
Таким образом, решение задачи совершенствования серодиагностики сифилиса может быть получено на уровне использования трепонемных антигенов с известными функциональными свойствами в новых модифицированных тестах, на уровне использования новых трепонемных антигенов в известных, широко используемых тестах на сифилис и на уровне использования новых трепонемных антигенов в новых тестах на сифилис.
История развития серодиагностики сифилиса показывает, что наиболее значительные результаты были получены на последних двух уровнях. В этом направлении нами (Пожарская В.О., 1986) были проведены предварительные исследования по изучению антигенных свойств клеточных структур кульгуральных бледных трепонем, которые показали более высокую по сравнению с разрушенными клетками антигенность клеточных стенок и наружных фибрилл и перспективность их использования в РСК. Однако они не носили системного характера, были направлены на решение частной научной задачи и не доведены до уровня разработки препарата.
Актуальность дальнейшего изучения функциональных свойств клеточных структур КБТ подтверждается также результатами последних работ, в которых показана перспективносгь применения для серодиагностики сифилиса биохимических комплексов с различной молекулярной массой, выделенных из фибрилл (Petersen C.S. et al., 1981; Perm C.W. el al., 1985) и наружных оболочек (Radoir Y.D., 1995; Antoni G. ei al., 1996; Blanko D.R. el al., 1995) патогенных трепонем. Выполненные исследования также носят предварительный характер, направлены на решение частных научных задач, связаны с использованием патогенных трепонем и не доведены до уровня реализации в диагностических тестах, при этом технология выделения биохимических фракций отличается сложностью и высокой стоимостью.
Изучение функциональных свойств культуральных бледных трепо-нем с позиций методологии системного анализа позволяет дифференцировать их функциональные свойства и на этой основе, за счет полученной на новом уровне научной информации, теоретически обосновать, экспериментально и практически подтвердить диагностическую ценность разработанных специфических препаратов на сифилис. Решение задачи производственного выпуска, отличающегося простотой технологии получения и низкой стоимостью новых, более эффективных антигенов из клеточных'структур трепонем, обеспечит их широкое использование в практике серодиагностики сифилиса - в РСК, ИФА и РИФ-абс.
Многоплановые исследования функциональных свойств клеточных структур культуральных бледных трепонем являются актуальными не только для совершенствования серодиагностики, но и для определения перспективных направлений совершенствования лечения сифилиса.
Цель исследования - научно-производственная разработка новых, более эффективных диагностических препаратов на сифилис на основе использования установленных функциональных свойств клеточных структур культуральных бледных трепонем.
Задачи исследования:
-
Разработать методики производственного получения клеточных структур трепонем и определения их биохимического состава.
-
Определить функциональные свойства клеточных структур трепонем при взаимодействии их с сыворотками крови людей, больных си-фшисом и свободных от сифилитической инфекции, и разработать на этой основе технологию безотходного производства новых диагностических препаратов на сифилис с использованием антигена из клеточных стенок и наружных фибрилл для РСК и ИФА тест-системы с определением в сыворотке крови людей антитрепонемных IgM и IgG антител с визуальным учетом результатов, а также сорбента из содержимого цитоплазма-тического цилиндра трепонем - для РИФ-абс.
3.Изучить функциональные свойства клеточных структур трепонем при взаимодействии их с организмом здоровых животных и животных с экспериментальным сифилисом и разработать на этой основе технологию получения высокотитражных контрольных положительных кроличьих сывороток на сифилис.
4.0ценить ьлияние in vitro клеточных стенок с фибриллами трепонем на Е-рецепторную активность лимфоцитов крови людей, больных сифилисом и свободных от сифилитической инфекции, и сравнить полученные результаты с влиянием известных иммунопрепаратов.
Научная новизна. В работе, с позиций системного анализа, теоретически обоснованы схемы изучения функциональных свойств клеточных егрукгур'трепонем, реализация которых обеспечила получение новых научных результатов.
Разработана методика получения новой тиогликолевой питательной среды на основе использования в ней экстракта пищевых дрожжей. Установлено, что данная среда активизирует функции роста и размножения бледных трепонем, обеспечивает одинаковый выход биомассы различных штаммов при сохранении стабильных антигенных свойств уль-траозвученного трепонемного антигена (УЗТА) и выделенных клеточных структур трепонем в процессе их производственного выпуска. Установлена зависимость стабильности антигенных свойств клеточных структур от способа разрушения клеток трепонем. Показано, что в условиях производственного выпуска, использование ультразвука для разрушения биомассы трепонем в разведении влажного осадка 1:10 обеспечивает высокую технологичность процесса, а выделенные из дезинтеграта клеточные структуры обладают высокой антигенной активностью и стабильностью характеристик.
Разработана новая методика определения моносахаров в клеточных структурах бактерий способом газожидкостной хроматографии, которая позволила определить как качественный и количественный состав, так и процентное соотношение моносахаров в клеточных структурах трепонем. Выявлено отсутствие в клеточных структурах трепонем галактозы и арабинозы, а наибольший процент Сахаров составили глюкоза и манноза. Это позволяет предположить их преимущественное содержание в гликолипндопротеиновых комплексах, что и может являться причиной низкой гетерогенности трепонем, определяя этим особенности клинического течения заболевания и иммунитета при сифилисе.
Доказано, что клеточные стенки и наружные фибриллы трепонем, по сравнению с разрушенными клетками, обладают следующими функциональными свойствами: меньшей антикомплементарностью и большими чувствительностью и специфичностью; при введении в организм здоровых кроликов - не вызывать выработку неспецифических антикардио-липиновых антител, а при введении в организм кроликов с экспериментальным сифилисом - активизировать его течение как в части развития специфического орхита, так и в части выработки специфических и неспецифических (антикарднолшшновых) антител. Установлено функциональное свойство клеточных стенок и наружных фибрилл трепонем повышать in vitro Е-рецеїпорную активность лимфоцитов крови людей, больных сифилисом и свободных от сифилитической инфекции.
Содержимое цитоплазматического цилиндра трепонем обладает функциональным свойством в большей мере по сравнению с разрушенными клетками абсорбировать группоиые неспецифические антитела в сыворотке крови людей; при его введении в организм здоровых кроликов - не вызывать выработку неспецифических антикарднолипиновых акт-тел, а при совместном введении с КСТ - подавлять выработку специфических антитрепонемных антител.
Практическая значимость.
!. Разработанные на основе системного анализа схемы изучения функциональных свойств клеточных структур КБТ могут быть использованы для изучения и других трепонемных антигенов.
-
Изученные функциональные свойства клеточных структур КБТ открывают новые возможности для дальнейшего совершенствования серодиагностики сифилиса, подхода к лечению и коррекции иммунного статуса,больных сифилисом.
-
Установленные более высокая чувствительность и специфичность клеточных структур и наружных фибрилл трепонем по сравнению с ультраозвученным трепонемным антигеном обосновали применение КСТ для повышения диагностической ценности РСК на сифилис, широко используемой в практике лабораторий различного уровня.
-
Впервые установлено функциональное свойство содержимого ци-топлазматнческого цилиндра трепонем абсорбировать групповые неспецифические антитела в сыворотке крови человека. Доказана большая абсорбционная емкость ЦТ по сравнению с УЗТА-сорбентом, что позволило предложить новый способ серодиагностики сифилиса, а использование нового сорбента в РИФ-абс на сифилис - повысить чувствительность и специфичность теста. Разработанная методика стандартизации нового сорбента при производственном выпуске позволила унифицировать постановку реакции и снизить трудозатраты.
-
Разработанный способ получения антигенов из культуральных бледных трепонем обеспечил решение задачи безотходного производства двух новых препаратов из клеточных структур трепонем.
-
Установленное наличие в клеточных стенках и наружных фибриллах трепонем групповых неспецифических антигенов позволило повысить специфичность КСТ-антигена с помощью аффинной очистки и разработать новую, более эффективную ИФА тест-систему с определением в сыворотке крови человека антитрепонемных IgM, IgG антител с визуальным учетом результатов. Обосновано применение новой ИФА тест-системы при диагностике и массовых обследованиях на сифилис в лабораториях любого уровня.
-
Методика получения новой модифицированной питательной среды для выращивания бледных трепонем снизила на 20% производственные затраты за счет увеличения выхода биомассы трепонем различных штаммов при сохранении их функциональных свойств.
8. Разработанный способ получения гнпериммунной положитель
ной контрольной кроличьей сыворотки на сифилис обеспечил повыше
ние рентабельности ее производства. Установленное функциональное
свойство КСТ-антигена активизировать течение сифилитической инфек
ции теоретически обосновывает разработку нового подхода к лечению
сифилиса.
9. Установленное функциональное свойство КСТ-антигеца повы
шать in vitro Е-рецепторпую активность лимфоцитов крови больных си
филисом и свободных от сифилитической инфекции лиц обосновывает
разработку нового иммунокорректора.
10. Диссертационная работа направлена па выполнение Общесо
юзной программы 0.69.09 "Микроанализ" (1989-1993 г.г.), раздела
"Усовершенствование лабораторной диагностики сифилиса, путем ис
пользования в качестве антигена клеточных структур культуральиых
бледных трепонем" (договор 39 "а", шифр 0.48/02, тема 3/131 /39"а"), Го
сударственного заказа промышленным отраслям народного хозяйства на
изделия медицинского назначения (1990-1995 г.г.) - на антиген из клеточ
ных стенок трепонем (утв. МЗ РФ от 02.11Л989 г., шифр 20/10/75).
Внедрение в практику результатов научных исследований. Результаты проведенных исследований апробированы и внедрены в утвержденные на уровне ЦНИКВИ (г. Москва) "Регламент производства на антиген Пожарской из клеточных структур трепонем (КСТ) сухой для РСК (N1), на сорбент сухой для РИФ-абс на сифилис (N2)" (по заявке на патент N 96106615), "Регламент производства на тест-систему иммуноферментную для качественного выявления антител к возбудителю сифилиса в сыворотке крови человека (АТ-Треп-ИФТС), "Изменение к Регламенту производства сыворотки контрольной положительной, сухой для РСК (сыворотка положительная сухая)" (по заявке на патент N 95121709). Фармакопейные статьи и Инструкции по применению на выше перечисленные препараты находятся па угаерждеиии в Фармакопейном Комитете РФ.
На ФГУП "Аллерген" (г.Ставрополь) осуществляется научно-производственный выпуск АТ-Треп-ИФТС, контрольных положительных сывороток для диагностики сифилиса по новой технологии.
Новая модифицированная питательная среда используется на ФГУП "Аллерген" при выпуске ультраозвученного трепонемиого антигена для РСК в соответствии с Регламентом производства (по заявке на патент N96103048).
Способ серодиагностики сифилиса по авторскому свидетельству N1650098 внедрен в Регламент производства на сорбент сухой для РИФ-абс па сифилис (N2) и его Фармакопейную статью.
Положения, выносимые її» .защиту:
1. Клеточные стенки и наружные фибриллы культуральиых бледных ірепонем обладают следующими функциональными свойствами: более высокой по сравнению с разрушенными клетками чувствительностью, специфичностью и меньшей антикомплементарностыо, позволившими в РСК на сифилис повысить вдвое чувствительность, а при первичном се-ронегативпом сифилисе на 12,5% - диагностическую ценность (в среднем на 1,3%) и па 0,7% - специфичность теста. Применение КСТ-антигена в
АГ-Треп-ИФТС с определением в сыворотке крови людей антитрепо-немных IgM и IgG антител с визуальным учетом результатов обеспечивает 100% специфичность теста, в то время как выпускаемые в Российской Федерации тест-системы IgG-ИФА и ИФА-анти-Люис имеют специфичность (96...97)%.
-
Клеточные стенки и наружные фибриллы культуральных бледных трепонем при введении их в организм здоровых кроликов обладают функциональным свойством не вызывать выработку неспецифических антикардиолипиновых антител. При введении их в организм кроликов с экспериментальным сифилисом активизировать его течение, что теоретически обосновывает новый способ получения высокотитражной контрольной положительной кроличьей сыворотки на сифилис.
-
Содержимое цитоплазматичесхого цилиндра культуральных бледных трепонем обладает функциональным свойством в большей мере, по сравнению с разрушенными клетками, абсорбировать групповые неспецифические антитела в сыворотке крови людей. Это позволило при использовании ЦТ в качестве сорбента в РИФ-абс на сифилис повысить на 8,3% чувствительность теста при первичном серонегативном сифилисе и на 18.2% - специфичность неспецифических ложноположительных в КСР сывороток крови людей.
На введение ЦТ структур в организме кроликов не вырабатываются неспецифические антикардиолипиновые антитела. При совместном введении их с КСТ-антигеном подавляется выработка специфических ан-титрепонемных антител, что теоретически обосновывает более высокую антигенность клеточных стенок и наружных фибрилл трепонем по сравнению с разрушенными клетками.
-
Клеточные стенки и наружные фибриллы трепонем обладают функциональным свойством повышать in vitro Е-рецепторную активность лимфоцитов крови людей, больных сифилисом и свободных от сифилитической инфекции, что позволяет обосновать гипотезу об иммунокоррек-тирующем влиянии КСТ на иммунную систему человека и определить перспективное направление совершенствования схем лечения сифилиса.
-
Научно-производственная разработка новых специфических да-: агностических препаратов на сифилис, которая включает методику получения новой искусственной питательной среды для выращивания трепонем, использование которой повысило рентабельность производства УЗТА на 20%; методики получения КСТ и ЦТ структур, их стандартизации, определения углеводного профиля; получение на основе КСТ высокотитражной положительной контрольной сыворотки на сифилис, позволившей повысить рентабельность их производства на (80...90)%.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 работы в центральных журналах, материалах съезда, международных конгресса, симпозиума и конференций, а также в сборниках научных трудов институтов и в одном авторском свидетельстве на изобретение.
Апробации работы. Диссертация апробирована на заседании научно-координационного совета Ставропольской государственной медицинской академии при участии представителей кафедр иммунологии и вирусологии, дермато-иеперологии, представителей Ставропольского научно-исследовательского противочумного института, ФГУП "Аллерген" (протокол N 3 от 19 ноября 1996 года). Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на съезде, конгрессе, симпозиуме, международных, всероссийских и др. конференциях, перечень которых приведен в автореферате в разделе "Список работ, опубликованных по теме диссертации".
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 247 страницах машинописного текста, состоит из введения, девяти глав, заключения и списка литературы, включающего 355 источников (208 отечественных и 147 зарубежных авторов). Работа содержит 35 рисунков и 35 таблиц.
Основные теоретические и экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены автором. Исследования проводились также в соавторстве с соискателями ученой степени кандидата наук, работающими под научным руководством диссертанта. Техническое обеспечение экспериментальных исследований осуществлялось сотрудниками ФГУП "Аллерген", Краевого кожно-венерологического диспансера, иммунологической лаборатории Краевой клинической больницы (г.Ставрополь).