Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Кишечные инфекции, вызываемые эшерихиями, шнгеллами и сальмонеллами, широко распространены в настоящее время, несмотря на существенное усовершенствование методов профилактики, диагностики и лечения. Длительное поддержание массивной циркуляции данных микроорганизмов в значительной степени связано с их высокой изменчивостью. Последняя проявляется в постоянном появлении новых О-серогрупп эшерихий, играющих важную роль в этнологии кишечных инфекций, смене преобладающих в инфекционном и эпидемическом процессах биотипов шнгелл, выраженной способности некоторых эшерихий и шигелл к диссоциации, широком распространении внехромосомных факторов наследственности, несущих гены патогенное, устойчивости к антибиотикам и химиопрепара-там (Борисов Л. Б., 1976; Тимаков В. Д. и соавт., 1980; Брода П., 1982; Езепчук Ю. В., 1985; Тец В В., Борисов Л. Б., 1985, 1986, 1988; Пехов А. П., 1986; Смирнов Г. Б., 1988; Sansonetti P. J. et al., 1981; Keusch G. Т. et al, 1982; Law D., 1988).
Вирулентность различных микроорганизмов, как показано в последние годы, является полидетерминантным признаком-. Разнообразие способов сохранения информации о составляющих ее факторах в значительной степени объясняет высокую пластичность популяций патогенных микроорганизмов (Езепчук Ю. В., 1985; Петровская В. Г-, Бондаренко В. М., 1985; Полоцкий Ю. Е. Бондаренко В. М., 1986; Покровский. В. И. ц соавт., 1989; Gaastra W., de Graaf F., 1982; Levine M. M., 1983; Sansonetti. P. J. et al., 1983, 1986; Middlebrook J. L., 1984; Binns M, M., 1985; Ketyi I., 1985). Вместе с тем крайне мало известно о быстро возникающих у бактерий изменениях вирулентности и антигенной структуры, которые мргут иметь место в ходе инфекционного процесса и. проявляются», в частности, в зависимости от температуры окружающей среды и присутствия антимикробных препаратов. Комплексного исследования влияния последних на отдельные факторы, ви-
рулентностп н чувствительность к внешним воздействиям большинства клинически актуальных энтеробактерий, в том числе энтероинвазивных и энтеропатогенных кишечных палочек (ЭИКП и ЭПКП) и шигелл, не проводилось. Выбор ЭИКП и шигелл в качестве основного объекта изучения определялся данными о сходстве факторов вирулентности, генов патогенности и их расположения в хромосоме и плазми-дах у этих микроорганизмов, принадлежащих к разным родам, видам и серогруппам (Борисов Л. Б., 1976; Тима-ков В. Д. и соавт., 1980; Петровская В. Г., Бондаренко В. М., 1985; Полоцкий Ю. Е., Бондаренко В. М., 1986; Покровский В. И. и соавт., 1989; Sansonetti П. J. et ab, 1983, 1986; Baileau С. R. et а!., 1984; Small P. L. С, Falkow S., 1986). Для сравнения были исследованы ЭПКП и некоторые другие энтеробактерий, обладающие иными факторами вирулентности.
В последние годы объектом интенсивного изучения являются ипдуцибелыше системы изменчивости — тепловой шок (ТШ) и SOS-ответ, регулирующие активность различных генов и играющие большую роль в жизнедеятельности бактерий, способствуя их адаптации к условиям окружающей среды (Левашев В. С. и соавт., 1984; Хесин Р. Б., 1984; Лендов В. А-, 1985; Witkin Е., 1982; Gottesman S., Neidhardt F. С, 1983; Walker G. С, 1984; Smith G. R., 1987). Важной особенностью многих контролируемых этими системами изменений является их обратимость. Основные успехи в изучении системы ТШ и SOS-ответа достигнуты на модели Escherichia coli. В то же время эпидемически значимые варианты этого микроорганизма исследованы недостаточно, а шигеллы практически не становились объектом систематического анализа. Полностью отсутствуют данные о роли этих систем в изменении у ЭП1Ш, ЭИКП и шигелл таких важных признаков, как вирулентность, чувствительность к антибиотикам, антигенность, и ряда других. Неизвестно, как изменяется активность SOS-ответа и системы ТШ в присутствии основных антимикробных препаратов, используемых для лечения данных инфекций. В значительной степени изучение этих вопросов тормозится отсутствием коллекций патогенных энтеробактерий, имеющих известные дефекты в генах, контролирующих работу системы ТШ и SOS-ответа. Вместе с тем детальное исследование регуляции изменений микробной вирулентности, не сопровождающихся утратой генов патогенности, может спо-
:обствовать дальнейшему прогрессу в профилактике, диагностике и лечении инфекций, вызываемых данными микроорганизмами.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы явилось изучение функционально-морфологических особенностей эпидемически значимых штаммов патогенных энтеробактернй и роли в их изменчивости индуцибельных ре-гуляторных систем ТШ и SOS-ответа. Очевидно, что такому исследованию должно было предшествовать изучение общих свойств использованных микроорганизмов, прежде всего их вирулентности, чувствительности к действию факторов внешней среды, мутабильности и наличия внехромосомиых факторов наследственности, а также создание коллекции штаммов патогенных микроорганизмов, имеющих дефекты генов систем ТШ и SOS-ответа. В этой связи в работе были намечены следующие задачи:
-
комплексное изучение различных биологических свойств штаммов патогенных энтеробактернй, выделенных от больных;
-
конструирование штаммов патогенных энтеробактернй, имеющих дефекты генов систем ТШ и SOS-ответа, и изучение их биологических свойств, включая различные факторы вирулентности и чувствительность к факторам внешней среды;
-
изучение роли температуры культивирования в изменении биологических свойств патогенных энтеробактернй, а также участия в их регуляции системы ТШ;
-
изучение роли SOS-системы в изменчивости свойств патогенных энтеробактернй;
-
комплексный анализ роли антимикробных препаратов -в изменении биологических свойств бактерий, включая различные факторы вирулентности и активацию их SOS-системы.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ- Проведено комплексное микробиологическое, биохимическое, электронно-микроскопическое и молекулярно-бнологическое изучение патогенных энтеробактернй, полученных от больных. Среди Е. coli одной серогруппы выделены штаммы, сохраняющие S-форму и различающиеся по ультраструктуре, наличию и выраженности отдельных факторов вирулентности, чувствительности к внешним воздействиям, .мутабильности, целостности молекулы ДНК, содержанию внехромосомиых факторов наследственности и частоте S-R-днссоциащш. Прослежены изменения отдельных факторов вирулентности при S-R-днесоциа-
цни у ЭИКП. Установлено существование корреляции между адгезивностью ЭИКП, ЭШ\П и Shigella flexneri 2а и количеством связанных с ними сиаловых кислот. Описаны ранее неизвестные особенности ультраструктурной организации колоний энтеробактернй. Выявлены различия выживания в присутствии антибиотиков микроорганизмов, находящихся в составе колонии и свободно растущих на плотной и в жидкой питательных средах. Впервые создана коллекция штаммов ЭПКП, ЭИКП и S. flexneri 2а, несущих дефектные гены, регулирующие активность ^систем ТШ и SOS-ответа. Установлено неописанное ранее участие этих систем в регуляции вирулентности исследованных энтеробактернй. Показано, что микроорганизмы, несущие дефектный ген гесА56 Е. coli К-12, имеют резко сниженную вирулентность при сохранении основных антигенов її иммуногенности. Впервые описаны зависящие от условий существования ультраструктурные изменения колоннії и клеток непатогенных стандартных и патогенных штаммов энтеробактернй, имеющих повреждения генов систем ТШ и SOS-ответа. Предложено и теоретически обосновано использование периодической бактериальной культуры для изучения изменчивости и механизмов се регуляции у энтеробактернй. Показано, что данная модель дает возможность исследовать переходные состояния популяции энтеробактернй, подобные тем, которые могут возникать в течение гнфекциониого процесса in vivo. Установлено, что в ходе экспериментальной инфекции, вызванной Е. coli 0124, скачкообразно возрастает изменчивость возбудителя. Показана роль SOS-системы в регуляции естественной изменчивости популяций энтеробактернй. Выявлено участие различных антимикробных препаратов, широко используемых в клинической практике, в изменении активности этой системы- В результате комплексного изучения влияния субиигибирующих концентраций антибиотиков на ЭИКП и S. flexneri 2а установлена роль этих препаратов в изменении различных факторов вирулентности и исходе взаимодействия микроорганизмов с факторами иммунной защиты.
Разработаны оригинальные способы: а) газохроматогра-бического анализа пуриновых и пиримидиновых оснований ДНК, б) приготовления силнлированных производных оснований нуклеиновых кислот, в) использования дифенила и нафталина в качестве внутренних стандартов при газохрома-тографическом изучении нуклеиновых кислот, г) получения
рскомбинантных штаммов S-формы патогенных эшернхий, д) снижения минимальной подавляющей концентрации антибиотиков при их совместном использовании с кофеином. Принципы изменения характера взаимоотношений микроба-паразита с организмом хозяина в присутствии субингибнрую-щнх концентраций антибиотиков использованы в разработке методов профилактики и лечения заболеваний слизистых оболочек.
Получены оригинальные: а) полимерный гелеобразующий материал с антимикробными препаратами для биомедишш-екцх целей, б) штамм бактерий Е. coli 0124, имеющий сниженную вирулентность, пригодный для иммунизации животных с целью получения диагностических сывороток.
ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Полученные данные о факторах вирулентности у различных штаммов Е. coli одной серогруппы позволяют оценить пути сохранения в популяциях генов патогенности. Результаты изучения ультраструктурної"! организации колоний и выживаемости составляющих их бактерий в присутствии антибиотиков, а также действия последних на различные факторы вирулентности объясняют возможность расхождения эффективности лечения с результатами лабораторного выбора оптимального этиотропного препарата. Данные о роли нн-дуцибельных систем — ТШ и SOS-ответа — в регуляции свойств патогенных энтеробактерий представляют экспериментальную основу для оценки возможности и темпов их изменчивости в ходе инфекционного процесса in vivo и при смене среды обитания. Снижение вирулентности различных энтеробактерий за счет введения гена гесА56 от Е. coli К-12 может быть использовано в качестве дополнительного способа при создании вакцинных штаммов. Установленное изменение активности различных факторов вирулентности патогенных ЭИКП и S. flexneri 2а при повышении температуры культивирования от 37С до 42 С может быть использовано для оценки тактики лечения и предотвращения вторичных инфекций. Данные о влиянии антибиотиков на вирулентность бактерий, их взаимодействие с факторами иммунной защиты и активацию SOS-ответа позволяют по-новому оценить возможность н способы их использования для профилактики и лечения ряда инфекций, а также наметить пути снижения нежелательных эффектов индукции систем изменчивости микроорганизмов. Разработанные способы позволяют изучать
состав ДНК с помощью метода газожидкостной хроматографии, получать штаммы со сниженной вирулентностью за счет передачи им гена гесА56 от Е. coli, снижать в лабораторной работе МПК антибиотиков при использовании кофеина, повышать эффективность лечения « профилактики при ряде инфекционных состояний.
ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ. Получены 4 авторских свидетельства: «Способ изготовления стоматологических конструкций из алюминия и его сплавов» (№ 942734 от 16.03.82), «Полимерный гелеобразующий материал для биомедицинских целей» (№ 1134581 от 15.09.84), «Способ получения рекомбннантного штамма S-формы патогенных эшери-хий» (№ 1253141 от 22.04.86), «Штамм бактерий Escherichia coli VT2240,, используемый для получения диагностической О-сыворотки к эшерихиям серовара 0124» (№' 1378370 от 01.11.87). Получено одно положительное решение по заявке на изобретение «Антимикробный состав для подавления посторонней микрофлоры при выращивании микроорганизмов и культур тканей» (Заявка № 4105904, приоритет от 18.08.86, положительное решение от 12.06.89). Утверждены рационализаторские предложения: «Способ растворения пуриновых и пнримндииовых оснований нуклеиновых кислот», «Использование дифенила и нафталина в качестве внутренних стандартов при газожидкостной хроматографии нуклеиновых кислот», «Способ приготовления силилированных производных оснований нуклеиновых кислот», «Способ приготовления и нанесения антибактериального покрытия на проволочные шины, используемые в челюстно-лицевой хирургии», «Способ газохро-матографического анализа пуриновых и пиримнднновых основании в изотермическом режиме», «Антисептическая композиция пролонгированного действия», «Способ определения гемолитической активности бактерий», «Способ лечения кольпитов» (БРИЗ І ЛМИ им. акад. И. П. Павлова № 71 и № 72 от 13.10.78, № 87 и № 88 от 12-12.79, № 68 от 06.06.80, № 21 от 19.01.84, Jft 746 от 07.06.88, № 752 от 10.06.88). Разработанные способы и материалы внедрены в лечебную работу кафедр детской стоматологии, ЛОР-болезней, акушерства и гинекология I ЛМИ им. акад. И. П. Павлова,, в экспериментальную работу кафедр микробиологии, ЛОР-болезней I ЛМИ им. акад. II. П. Павлова, ІММИ им. И. М. Сеченова, института эволюционной физиологии и биохимии ям. И. М. Сеченова, Марийского государственного университета. Данные, полу-
іеппьіе в диссертационной работе, введены в курс лекций и практических занятий по микробиологии для студентов [ ЛМИ. Результаты работы включены в комплекс данных программы научных исследований АН СССР и АМН СССР «Фундаментальные науки — медицине» и региональной программы «Профилактика инфекционных болезней».
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены на конференции «Вопросы иммунологии и молекулярной биологии» (Нальчик, 1981), «Актуальные вопросы иммунологии аллергологии и молекулярной биологии» (Краснодар, 1983), «Количественный люминесцентный анализ многокомпонентных систем биологически активных веществ» (Ташкент, 1982), «Восстановительные и компенсаторные процессы при лучевых поражениях» (Ленинград, 1986), VII Всесоюзном симпозиуме «Синтетические полимеры медицинского назначения» (Минск, 1985), Всесоюзных семинарах «Вопросы антибактериальной терапии инфекционных осложнений в неинфек-циоиной клинике» (Москва, 1987), «Колонизационная резистентность к химиотерапевтическим и антибактериальным препаратам» (Москва, 1988), I съезде эпидемиологов, инфекционистов и гигиенистов Туркменистана (Ашхабад, 1986), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), II Всесоюзном съезде паразнтоценологов (Киев, 1983), II Всесоюзной конференции по актуальным вопросам теоретической и прикладной инфекционной иммунологии (Саратов, 1987), Пленуме научного совета по микробиологии АМН СССР (Махачкала, 1987) (Томск, 1985), заседании ленинградского отделения Всероссийского общества микробиологов (1988). По теме диссертации опубликовано 38 работ, в том числе 16 статей в центральных журналах и 1 монография.