Введение к работе
Актуальность проблемы. Непременным условием всех современ-к работ по созданию и усовершенствованию профилактических и [агностических препаратов являются исследования в области антенной структуры микроорганизмов и определения функциональ-ій роли биомолекул, составляющих клеточную организацию микро->в.
Несмотря на то, что риккетсиология располагает большим :спериментальным материалом, позволяющим составить представле-[е о морфогенезе, репродукции, биологических свойствах, мета-шизне и химическом составе риккетсии, сведения о липидной ютавляющей риккетсиальной клетки ограничены.
Анализ химического состава риккетсии, проведенный еще в >46 году В.й.Товарницким и М.К.Кронтовской и в более поздних следованиях, свидетельствовал о значительном удельном весе в руктуре риккетсиальной клетки фосфолипидов, содержание кото-їх достигает 16% от сухого веса риккетсии (В.И. Товарниц-й.М.К. Кронтовская,1946; TovarnicKij V. I., Krontovskaja М.Н., 146; Cohen S. S., Chambers L.A..Clawson J.H.,1950; Winkler H.H., Her E.Т., 1978; Е.Г.Зезеров, В.С.Логинов, А. С.Березнева, 1985).
Многие исследователи, занимающиеся в области липидологии ікроорганизмов. в частности, O'Leary (1977), склонны считать, о "состав липидов, их обмен и, вероятно, их функции представит собой именно те особенности, по которым микроорганизмы и. обенно, бактерии, наиболее отличаются от других форм жизни... что именно в этом могут скрываться объяснения многих непонят-х до конца аспектов изучения микроорганизмов, включая таксо-мическую индивидуальность и дифференциацию видов, тип патотеза и чувствительность или резистентность к антибиотикам и .огие другие особенности".
Исходя из того, что липиды, в частности, фосфолипиды, яв-ются основным и обязательным компонентом клеточных мембран ех типов микробных клеток в последние годы возрос интерес к яснению структурно-функциональной роли бактериальных липидов жизнедеятельности микроорганизмов. Показано, что многие пекты химической природы, биосинтеза бактериальных жирных слот разных видов имеют значение как таксономические критерии
для идентификации микроорганизмов. А механизмы и пути их биосинтеза рассматриваются как многообещающие мишени для химиотера-певтического воздействия (0'Leary,l967; Г.А.Грибанов,1975; Е.Л.Рубан,1980; Б.В.Каральник, М.П.Разбаш, Е.А.Ахметова,1981; Л.М.Пинчук, Е.А.Воронова, 1982; З.П.Васюренко,1982; Т.С.Саатов, Э. И. Исаев, С. А. Бурханов, 1990).
Известно также, что фосфолипидные фракции таких микроорганизмов, как коринебактерии, микобактерии, микоплазмы и хлами-дии, обладают выраженной антигенной активностью, что определило их применение в серологической диагностике инфекций, вызываемых этими возбудителями -(Takahashi Y., Опо К., 1961;Е.К.Алимова,А.Т. Аствацатурьян, 1970;И. С.Николаева, Ю.В. Езепчук, Ю.В.Вертиев, 1970; Brett S.J. et al.,1972; С.Н.Головачева с соавт., 1975; Н.П..Разбаш, Б.В.Каральник, 1973,1975,1978; Andrew А.Т., Carter Р. В., 1977; Morris J. A., Stevens А.Е., 1977; Reggiardo Z. .Vazguez Е.,1981; Ю.М.Краснопольский с соавт.1986).
В то же время, оценивая современные сведения об антигенных компонентах риккетсий группы сыпного тифа, следует указать, что роль этих соединений в формировании антигенных свойств риккетсий не изучена.
В этом плане особого внимания заслуживали исследования М.Volkert и P.Moller-Cnristensen (1955), выделивших фосфатидкые серологически активные антигены для реакции связывания комплемента из хламидий пситтаци, микроорганизмов близких риккетсиям группы сыпного тифа по условиям культивирования и некоторым биологическим свойствам (Bergey, 1974; Weiss Е., Moulder J. V/. ,1984).
При конструировании хламидийного эритроцитарного диаг-ностикума с использованием метода М.Volkert и P.Moller-Cnristensen для получения специфического антигена хламидий нами ранее в соавторстве с Э.С.Горовицом была изучена не только гемосенсиби-лизирующая активность этого антигена, но и подтверждена его фосфолипидная природа (Э.С.Горовиц, 0.А. Тимашева, 1976,1978,1979).
Фосфолипиды характеризуются весьма своеобразными физико-химическими свойствами, выделяющими их из общего класса ли-пидов. В силу своей амфифильности фосфолипиды обладают уникальной способностью в водной фазе формировать бислоиные структуры - липосомы, которые рассматриваются в последние годы как модели природных биологических мембран.
Эта особенность фосфолипидов определила и аспекты их изучения в области биомедицинских исследований: во-первых, использование их для изучения или модификации поведения биологических клеток, механизмов межклеточных взаимодействий, и, во-вторых, на основе этих данных применение липосом с целью улучшения действия лекарств и иммунопрофилактических препаратов, основываясь на адъювантных свойствах липосом (Gregoriadis G., Allison А. С, 1983).
В литературе мы не встретили данных, касающихся изучения фосфолипидов риккетсии группы сыпного тифа в составе липосо-мальных препаратов.
Исходя из вышеизложенных предпосылок, нам представлялось актуальным и обоснованным определить возможность выделения фосфолипидных фракций из риккетсии группы сыпного тифа и изучить их свойства.
Цель настоящего исследования
Выделение и иммунобиологическая характеристика фосфолипидных антигенов риккетсии группы сьшного тифа и оценка перспектив их практического использования.
Основные задачи исследования
-
Разработка метода выделения фосфолипидных антигенов (ФЛА) риккетсии группы сыпного тифа и сравнительный анализ химического состава ФЛА риккетсии Провачека и хламидий пситтаци.
-
Изучение антигенной активности и специфичности ФЛА риккетсии группы сыпного тифа.
-
Изучение ФЛА риккетсии группы сыпного тифа з качестве специфического иммуносорбента и оценка перспектив его практического использования.
-
Разработка способа получения жпосомальных риккетсиальных
композиций на основе ФЛА риккетсии Провачека.
5. Изучение иммунобиологических свойств липосомальных рик
кетсиальных препаратов.
Научная новизна исследования
Впервые получены фосфолишдные антигены из культур рик-кетсий Провачека и риккетсий тифи, репродуцированных в желточных мешках развивающихся куриных эмбрионов, в легких белых мышей и в кишечнике переносчика - платяных вшей. В составе фос-фолипидных антигенов риккетсий Провачека идентифицированы 4 основных и 2 минорных фосфолипида, а также углеводный компонент, представленный 3-мя моносахарами. Определяющая роль фосфолипи-дов подтверждена редукцией специфической активности ФЛА фосфо-липазами.
Впервые установлены качественные и количественные различия фосфолипидных композиций и углеводного компонента риккетсий Провачека и хламидий псигтаци при одних и тех же условиях выделения фосфолипидных фракций.
Впервые определена специфическая природа и высокая серологическая активность фосфолипидных антигенов риккетсий группы сыпного тифа, показана их высокая гемосенсибилизирущая активность. Показано, что ФЛА. в составе риккетсиальной клетки проявляют себя как антигенная детерминанта.
Впервые на основе ФЛА риккетсий группы сыпного тифа сконструирован оригинальный иммуносорбент (авт.свидетельство N 1007676, приоритет от 30.03.1981), с использованием которого разработан метод выделения "чистых" антител и метод истощающей иммуносорбши, благодаря которой были получены модифицированные иммунные сыворотки, обеспечивающие видоспецифическую дифференциацию риккетсий Провачека и риккетсий тифи в РСК и нМФА. Показано, что в специфическом пуле иммуноглобулинов иммунной сыворотки присутствуют антитела, комплементарные к ФЛА риккетсий.
Разработан и рекомендован для внедрения метод получения фосфолипидных антигенов из промышленных отходов субстрата культивирования риккетсий Провачека (авт.свидетельства N 782201, приоритет от 06.06.1979 и N 1330786, приоритет от 11.03.1985). Применение ресурсосберегающей технологии позволило повысить рентабельность производства риккетсиальных диагностических препаратов.
Впервые получены липосомальные риккетсиальные препараты на основе протеинового и фосфолипидного антигенов риккетсий Прова-
чека. Электронномккроскопическими исследованиями подтвержден факт образования липосом фосфолипидшши антигенами и включения в липосомы протеинового антигена риккетсий.
Впервые показано, что риккетсиальные фосфолипидные антигены в сочетании с химической сыпнотифозной вакциной (липосомаль-ные риккетсиальные препараты) усиливают ее иммуногенную активность, для характеристики которой изучены не только показатели гуморального иммунного ответа, но и клеточного иммунитета. Выявлены определенные закономерности формирования иммунного ответа на ранних сроках после введения различных иммуногенов. Установлена иммунологическая безвредность липосомальных препаратов в отношении иммунной системы экспериментальных животных.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Фосфолишдная фракция риккетсий Провачека дифференцируется в виде комплекса, представленного 4-мя основными и 2-мя минорными фосфолипидами и углеводным компонентом. Для риккетсий Провачека и хламидий пситтаци характерны качественные и количественные различия фосфолипидных композиций и углеводного компонентов.
-
Фосфолипидные антигены риккетсий группы сыпного тифа характеризуются специфичностью, антигенной и гемосенсибилизирую-щей активностью. Фосфолипидный компонент в составе ФЛА необходим для реализации антигенных свойств.
-
Метод повышения видоспецифической дифференцирующей активности иммунных сывороток к риккетсиям группы сыпного тифа на основе иммуносорбента, имеющего в качестве специфического лиганда фосфолипидные антигены риккетсий группы сыпного тифа.
-
Фосфолипидные композиции в составе клеточной мембраны риккетсий как антигенные детерминанты индуцируют выработку комплементарных специфических антител.
-
Гуморальная и иммуноклеточная характеристика эффективности липосомальных риккетсиальных препаратов как иммуногена.
Практическая значимость работы
Предложена ресурсосберегающая технология на основе разработанного метода получения фосфолипидных антигенов из промышленных отходов субстрата культивирования риккетсий Провачека.
Разработан метод повышения видоспецифической дифференцирующей активности иммунных сывороток с применением истощающей им-муносорбции с оригинальным иммуносорбентом.
Предложен способ повышения эффективности иммуногенного материала для получения высокоактивных иммунных сывороток к рик-кетсиям группы сыпного тифа (авт.свидетельство N 1733004, приоритет от 09.01.1990).
Внедрение в практику
На основе проведенных исследований разработаны "Изменения к регламенту производства сухого "цельного" антигена для РСК", одобренные Ученым Советом Пермского НИИ вакцин и сывороток (протокол N И от 13.12.1986 г.), прошедшие экспертизу в ГИСК имени Л.А.Тарасевича и реализованные в условиях производства Пермского НПО "Биомед".
Принцип способа получения высокоактивных иммунных -сывороток к риккетсиям группы сыпного тифа был использован в производстве для получения хламидийных иммунных сывороток в НПО "Биомед".
Материалы работы были использованы в лекционном курсе кафедры микробиологии для студентов Пермской государственной медицинской академии и врачей на курсах повышения квалификации.
Апробация работы
Материалы исследований доложены и обсуждены на:
пленарных заседаниях Пермского филиала Всероссийского общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (1981,1982,1987, 1991, 1994);
научных конференциях Пермского НИИ вакцин и сывороток (1983,1984.1985,1986,1988);
Всесоюзной конференции "Эпидемиология, диагностика и
профилактика риккетсиозов" (Москва,1985);
Международном симпозиуме "Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине" (Уфа, 1995);
научной сессии Пермской медицинской академии (Пермь,1997).
Диссертация прошла экспертизу и апробирована на расширенном заседании Научно-технического совета Пермского НПО "Биомед".
Публикации
По теме диссертации опубликовано 23 работы, в том числе, "4 авторских свидетельства на изобретения".
Структура и объем работы
Проведенные исследования выполнены под руководством и непосредственном участии автора в лаборатории хламидий и рик-кетсий ПНИИВС НПО "Биомед" в рамках "Отраслевой программы НИР по бактерийным и вирусным препаратам в институтах вакцин и сывороток" по госзаказу (Ш гос. регистрации 80025865; 01.82.0.084.259; 01.82.0.084264 и 01.86.0.032811) при содействии лаборатории биохимии микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УО АН РФ (зав.лаб. к.м.н. В.П.Коробов), кафедры микробиологии Пермской медицинской академии (зав.каф. д.м.н., проф.Э.С.Горовиц), кафедры гистологии ПМА (зав.каф. к.м.н., доц. В.А.Четвертных),лаб.электронной микроскопии ЦНИЛ ПМА (зав.лаб. к.б.н. Л.Е.Глазачева).
Диссертация состоит да введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы и приложения. Работа изложена на 347 страницах машинописного текста, включая 64 таблицы, 53 рисунка, в том числе, 6 фотографий, 3 электроннограммы, 13 микрофотографий. Указатель цитируемой литературы содержит 588 источника, из них 309 отечественных и 279 иностранных авторов.
Автор признателен всем участникам совместных исследований, особенно доктору медицинских наук, профессору Э.С.Горовиц и кандидату биологических наук А. В. Тупицыну.