Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Углеводородокисляющие микроорганизмы 12
1.2. Строение клеточных стенок микроорганизмов 16
1.3. Наноматериалы 22
1.3.1. Нанотрубки галлуазита 22
1.3.2. Использование нанотрубок галлуазита в стабилизации нефтяных эмульсий 28
1.3.3. Магнитные наночастицы 31
1.4. Гибридные системы на основе микроорганизмов и наноматериалов 33
1.5. Методы иммобилизации наноматериалов на поверхность клеток микроорганизмов 35
1.5.1. Послойное нанесение наноматериалов с использованием противоположно заряженных полиэлектролитов (layer-by-layer) 35
1.5.2. Прямая иммобилизация наноматериалов на клетки 40
Глава 2. Экспериментальная часть 42
2.1. Материалы 42
2.2. Оборудование 43
2.3. Объекты исследования и их подготовка 44
2.3.1. Методы культивирования микроорганизмов 45
2.4. Методы исследования 48
2.4.1. Получение и подготовка наноматериалов для иммобилизации на клетки микроорганизмов 48
2.4.2. Модификация клеточной поверхности микроорганизмов наноматериалами 52
2.4.3. Характеристика наноматериалов и модифицированных клеток 56
2.4.4. Оценка жизнеспособности модифицированных клеток микроорганизмов 58
2.4.5. Оценка жизнеспособности клеток в составе сложных трехмерных гибридных систем на основе микроорганизмов и наноматериалов 62
Глава 3. Результаты исследований и обсуждение 66
3.1. Модификация поверхности клеток микроорганизмов наноматериалами 66
3.1.1. Характеристика используемых клеток микроорганизмов и наноматериалов 66
3.1.2. Модификация клеток микроорганизмов наноматериалами методом послойного нанесения (layer-by-layer) 72
3.1.3. Модификация клеток микроорганизмов наночастицами методом прямой иммобилизации 83
3.1.4. Модификация клеточной поверхности бактерий A. borkumensis 89
3.1.5. Характеристика жизнеспособности наномодифицированных клеток микроорганизмов 93
3.1.6. Применение наномодифицированных бактерий-нефтедеструкторов A. borkumensis в биоремедиации морских экосистем 109
Заключение 114
Выводы 117
Список сокращений 118
- Нанотрубки галлуазита
- Модификация клеточной поверхности микроорганизмов наноматериалами
- Модификация клеток микроорганизмов наноматериалами методом послойного нанесения (layer-by-layer)
- Характеристика жизнеспособности наномодифицированных клеток микроорганизмов
Введение к работе
Актуальность проблемы
Загрязнение нефтью, ее соединениями и нефтепродуктами водных экосистем и
прилегающих территорий является острой проблемой сегодняшнего дня. В настоящее время
экологически безопасным методом очистки окружающей среды от загрязнения углеводородами
является биоремедиация. В естественной деградации нефти участвуют микробные сообщества,
включающие микроорганизмы разных групп: бактерии, грибы, водоросли [Joutey et al., 2013].
Так, известна способность клеток Alcanivorax borkumensis [Yakimov et al., 1998], Candida
tropicalis [Palittapongarnpim et al., 1998], Escherichia coli [Nduka et al., 2012], Pseudomonas
aeruginosa [Olajire and Essien, 2014; Wolicka and Borkowski, 2012], Pseudomonas putida [Wolicka
and Borkowski, 2012], Saccharomyces cerevisiae [Abioye et al., 2013], Cunninghanella elegant
[Wolicka and Borkowski, 2012] и микроводорослей [Chekroun et al., 2014] деградировать нефть,
соединения нефти и нефтепродукты. В естественных условиях биодеградация углеводородов
обычно происходит относительно медленно и малоэффективно [Salleh et al., 2003]. Поэтому
актуальной задачей настоящего времени является проведение ускоренной и
высокоэффективной биодеградации нефти углеводородокисляющими микроорганизмами.
В настоящее время для очищения нефтезагрязненных водных экосистем активно используется смесь химических соединений, корексит. Однако проведенные исследования показали, что данное средство малоэффективно для деградации нефти; более того, оно не утилизируется, сохраняется в донных отложениях и накапливается в воде. Было показано, что данное соединение экологически небезопасно, является токсичным по отношению к флоре и фауне морей и сильно замедляет биологическую активность нефть-деградирующих микроорганизмов [Kleindienst et al., 2015]. Кроме того, для очистки водных систем от нефти и нефтепродуктов применяют сорбирующие вещества [Singh et al., 2014; Teas et al., 2001; Wu et al., 2014]. Недостатком использования сорбентов для ликвидации нефтяных разливов является их оседание вместе с нефтепродуктами на дно водных систем и их накапливание, что впоследствии может привести к вторичному загрязнению [Привалова и др., 2015].
В связи с этим актуальным является поиск новых безопасных методов и инструментов для ликвидации нефтяных загрязнений и восстановления экосистемы. Инженерия клеточной поверхности микроорганизмов-деструкторов нефти может стать одним из инструментов повышения нативной деградирующей активности клеток вследствие усиления контактов и увеличения продолжительности взаимодействия клеток с углеводородами. Модификация клеточной поверхности наноматериалами микроорганизмов-деструкторов является новой, еще не освоенной, перспективной областью исследования. Предполагается, что модификация поверхности наноматериалами повысит эффективность применения данных микроорганизмов в биоремедиации нефтяных загрязнений. Кроме того, использование углеводородокисляющих микроорганизмов с модифицированной поверхностью является экологически безопасным инструментом по сравнению с используемыми в настоящее время токсичными химическими соединениями.
Цель работы: формирование искусственных гибридных систем, состоящих из микроорганизмов и комбинаций наноматериалов различной природы, анализ их биобезопасности и характеристика процессов функционирования.
В связи с поставленной целью решались следующие задачи:
-
Разработать и охарактеризовать универсальные методы иммобилизации ряда наноматериалов (нанопленки полиионов, наносферы серебра, наночастицы магнетита, нанотрубки галлуазита) на клеточных стенках бактерий (Escherichia coli, Alcanivorax borkumensis), дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) и одноклеточных зеленых водорослей (Chlorella pyrenoidosa);
-
Оценить изменение физиологической активности (жизнеспособность, динамика роста) микроорганизмов в условиях модификации клеточных стенок наноматериалами в результате прямой и опосредованной иммобилизации;
-
Провести анализ токсичности наноматериалов по отношению к микроорганизмам – компонентам гибридных систем;
4. В условиях эксперимента охарактеризовать биоэмульгирующую и
биодеградирующую активность наномодифицированных углеводородокисляющих бактерий Alcanivorax borkumensis в отношении углеводородов и сырой нефти.
Научная новизна. Разработаны универсальные методы прямой и полимер-опосредованной иммобилизации наноматериалов на поверхность клеток микроорганизмов. Определены оптимальные условия равномерного распределения наноматериалов на поверхности клеток микроорганизмов, имеющих разную структуру и химический состав клеточной поверхности. Разработанные методы были применены для иммобилизации наноматериалов на поверхность галофильных углеводородокисляющих микроорганизмов. Наномодифицированные клетки бактерий A. borkumensis демонстрируют биоэмульгирующую и биодеградирующую активность по отношению к углеводородам и сырой нефти. В дальнейшем наномодифицированные клетки углеводородокисляющих микроорганизмов могут стать эффективным инструментом для ликвидации нефтяных разливов в морях и океанах.
Проведена стабилизация наночастиц серебра полиэлектролитами, такими как
поли(диаллилдиметиламмоний хлорид) (PDADMAC) и полиэтиленимин (PEI).
Продемонстрировано, что полиэлектролиты PDADMAC и PEI проявляют сильные антибактериальные свойства по отношению к клеткам грамотрицательных бактерий E. coli. Также показано, что полиэлектролитные пленки на клеточной поверхности задерживают деление клеток микроорганизмов.
Использование методов полимер-опосредованной и прямой иммобилизации позволяет эффективно иммобилизовать наноматериалы на клетки микроорганизмов.
Практическая значимость работы. Разработаны эффективные методы
иммобилизации следующих наноматериалов: керамических (нанотрубки галлуазита), металлических (оксида железа) наночастиц, наночастиц благородных металлов (серебряные) и магнитно-модифицированных нанотрубок галлуазита на поверхность клеток микроорганизмов. Полиионные пленки на клеточной поверхности задерживают рост клеток микроорганизмов. Данное свойство пленок можно применить при длительном хранении музейных культур микроорганизмов. Наночастицы серебра, стабилизированные полиэлектролитами PDADMAC и PEI проявляют антибактериальные свойства. Такие серебряные наночастицы могут быть основой для создания нового антибактериального материала.
Важным практически значимым результатом работы стала оптимизация способа иммобилизации наноматериалов на поверхность галофильных углеводородокисляющих микроорганизмов. Результаты по иммобилизации нанотрубок и магнитных наночастиц на клеточную поверхность бактерий A. borkumensis могут быть использованы при создании инструмента биоремедиации нефтяных загрязнений. В будущем можно использовать разработанные методы для иммобилизации наноматериалов на клеточные стенки любых морских микроорганизмов. Результаты исследования рекомендуются использовать в дальнейшем при изучении взаимодействия наноматериалов с биологическими объектами, а также при создании сложных гибридных комплексов.
Результаты и методы исследования использованы в учебном процессе в рамках дисциплин: «Микробные бионанотехнологии», «Нано- и клеточные технологии в биологии и медицине», «Биотехнология и биомедицинские производства», «Методы исследования в биологии и медицине», «Основы бионанотехнологии» ИФМиБ КФУ.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Разработаны методические подходы для прямой и полимер-опосредованной
иммобилизации нанопленок полиэлектролитов, наночастиц серебра, магнетита и нанотрубок
галлуазита на поверхности бактерий, микромицетов и одноклеточных водорослей;
-
Наномодифицированные микроорганизмы сохраняют жизнеспособность, нативную динамику роста, а также эстеразную активность;
-
Клетки A. borkumensis, модифицированные нанотрубками галлуазита, проявляют повышенные поверхностно-активные свойства на фазовой границе углеводород-вода. Магнито-
восприимчивые наномодифицированные клетки A. borkumensis приобретают способность к искусственному магнитотаксису.
Достоверность результатов проведенных исследований подтверждается
значительным объемом многократных лабораторных экспериментов, выполненных и проанализированных с использованием современных высокоточных приборов, а также публикацией полученных результатов работы в международных и отечественных журналах с рецензированием ведущими учеными в данной области.
Апробация работы. Основные результаты исследования были доложены на
всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых
«Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, 2010), III всероссийском конгрессе студентов и аспирантов – биологов «Симбиоз – Россия-2010» (Нижний Новгород, 2010), X научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Материалы и технологии XXІ века» (Казань, 2011), 17-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука ХХI века» (Пущино, 2013), VI всероссийском с международным участием конгрессе молодых ученых-биологов «Симбиоз-Россия 2013» (Иркутск, 2013), международной конференции «Functional Materials, ICFM 2013» (Украина, Крым, Гаспра, 2013), 10-й международной конференции «Nanoscience and Nanotechnology» (Турция, Стамбул, 2014), конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты биотехнологии» (Иркутск, 2015), I международной школе-конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Биомедицина, материалы и технологии XXI века» (Казань, 2015), международной конференции State-of-the-art Trends of Scientific Research of Artificial and Natural Nanoobjects STRANN 2016 (Санкт-Петербург, 2016), международной конференции молодых ученых Young researchers in life sciences YRLS (Франция, Париж, 2016).
Место выполнения работы и собственный вклад соискателя. Работа выполнена в научно-исследовательской лаборатории бионанотехнологии и на кафедре микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет».
Автором диссертации совместно с научным руководителем сформулированы цели,
задачи и основные направления исследовательской работы. Автор самостоятельно проводил
анализ данных литературы, а также интерпретировал полученные результаты, текстовый
материал статей и диссертации. На основании самостоятельно выполненной
экспериментальной работы автор решил поставленную задачу по разработке методов модификации галофильных микроорганизмов наноразмерными материалами, которые важны для разработки эффективного и безопасного инструмента биоремедиации нефтезагрязненных участков морских экосистем.
Связь работы с научными программами. Научная работа по теме диссертации выполнена в рамках Программы повышения конкурентоспособности КФУ Министерства образования и науки Российской Федерации. Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ №№ 12-04-32054, 12-04-33290, 14-04-32330, 15-34-20583, 17-04-02182) и Российского научного фонда (РНФ № 14-14-00924).
Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 27 работ, среди которых 16 работ в сборниках международных и всероссийских конференций, 1 глава в коллективной монографии и 10 статей в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК и индексируемых в базах данных Scopus и Web of Science.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, включает 53 рисунка и 11 таблиц. Библиография включает 157 источников.
Нанотрубки галлуазита
Магнитные (оксида железа), серебряные наночастицы и нанотрубки галлуазита – перспективные наноматериалы с уникальными физико-химическими параметрами. Данные наноматериалы использовались в работе при модификации поверхности клеток микроорганизмов и при создании гибридных систем. Далее приводится характеристика структуры и основных физико-химических свойств данных наноматериалов.
Галлуазит является материалом природного происхождения, представляет собой полые трубки, внешний диаметр которых составляет 50– 80 нм, внутренний диаметр 10–15 нм и длина 100–2000 нм (рисунок 3) [Abdullayev et al., 2012; Du et al., 2010; Duarte et al., 2012; Kogure et al., 2013;]. Галлуазит входит в группу алюмосиликатов и является минералом глинистого происхождения [Бетехтин, 2008].
Микрофотографии нанотрубок галлуазита, полученные с помощью СЭМ (Б) и ПЭМ (В) микроскопов [Abdullayev et al., 2011].
Химический состав нанотрубок галлуазита сложный, они состоят из оксида алюминия (Al2О3; 34,7%), из оксида кремния (SiO2; 40,8%) и воды (Н2О; 24,5%). Также, в незначительных количествах, в качестве примесей могут присутствовать и оксиды других металлов: Fe2O3, Cr2O3, MgO, FeO и иногда NiO, CuO, ZnO [Бетехтин, 2008]. Цвет галлуазита зависит от примесей в составе минерала и бывает, главным образом, белым, но иногда и с желтым, бурым, красным, голубым, зеленым оттенками [Бетехтин, 2008].
Уникальность нанотрубок галлуазита заключается не только в строении, но и в различном химическом составе внешней и внутренней поверхностей. Так, внешние слои нанотрубок галлуазита состоят из оксида кремния (Si), а слои внутренней полости – из оксида алюминия (Al) (рисунок 4). Поэтому нанотрубки галлуазита имеют внешний отрицательный заряд и внутренний положительный заряд [Vergaro et al., 2010]. Используя данное свойство, можно избирательно проводить модификацию поверхностей нанотрубок галлуазита.
В таблице 1 представлена сравнительная характеристика трех похожих наноматериалов: нанотрубок галлуазита, имоголита и углеродных нанотрубок. Из данных, представленных в таблице 1 следует, что нанотрубки галлуазита имеют больший диаметр, чем имоголит и углеродные нанотрубки. Диаметр внутренней полости позволяет загружать нанотрубки галлуазита значительным количеством химических веществ [Rawtani and Agrawal, 2012], наночастицами и макромолекулами, например, глобулярными белками [Vergaro et al., 2010; Tully et al., 2016; Lvov et al., 2016]. Проведенные исследования показали, что токсичность углеродных нанотрубок значительно превышает токсичность асбеста, длительное вдыхание которого вызывает серьезные заболевания [Lam et al., 2006]. Исследования на клеточных линиях также показали, что углеродные нанотрубки канцерогенны [Wang et al., 2011]. Наблюдается аналогия в строении имоголита и галлуазита. Внутренние слои имоголита состоят из кремния (Si), наружные слои – из алюминия (Al). Таким образом, дзета-потенциал имоголита при стандартных условиях в воде – положителен (+20 мВ), тогда как у галлуазита он отрицательный (40 мВ) [Gustafsson, 2001]. Имоголит имеет меньший диаметр, и количество его ограничено в отложениях.
Существуют также синтетические наноматериалы в виде полой трубки: дисульфиды металлов (NbS2, MoS2, WS2, TiS2), оксиды металлов (TiO2, VOx, CeO2, ZnCr2O4). Сочетание возможной экологической токсичности с высокой стоимостью данных наноматериалов делает их менее удобными для применения в биологии и медицине.
Возможность модифицировать поверхность нанотрубок галлуазита была продемонстрирована в ряде работ. Так, нанотрубки галлуазита были модифицированы оксидом железа (Fe3O4) [Duan et al., 2012; Zou et al., 2012] и Со [Zhang, Yang, 2012]. Сочетание свойств нанотрубок галлуазита и других веществ позволяет получать новые композитные материалы. Например, придание бактерицидных свойств нанотрубкам галлуазита с помощью наночастиц серебра [Xie et al., 2011] или фотокаталитических свойств – наночастиц оксида титана TiO2 [Wang et al., 2011].
Проведены исследования по модификации нанотрубок галлуазита магнитными наночастицами оксида железа Fe3O4. Магнитные нанотрубки галлуазита получали химическим методом преципитации (рисунок 5 А) [Duan et al., 2012; Zou et al., 2012]. Далее инкубировали готовые магнитные нанотрубки галлуазита с несколькими красителями: метиленовый синий, нейтральный красный, метил фиолетовый и метил оранжевый. Показано, что магнитные нанотрубки галлуазита лучше всего адсорбируют метиленовый синий, нейтральный красный и меньше метил оранжевый [Duan et al., 2012] (рисунок 5 Б). Данное свойство можно объяснить тем, что магнитные нанотрубки галлуазита, поверхность которых заряжена отрицательно, адсорбируют положительно заряженные красители. В дальнейшем нанотрубки галлуазита, модифицированные магнитными наночастицами, могут быть использованы в качестве сорбентов для удаления красителей или ионов тяжелых металлов из сточных вод [Xie et al., 2011].
Наличие у галлуазита внутренней полости обуславливает возможность загрузки ее различными веществами: антикоррозийными соединениями [Abdullayev et al., 2009], ферментами [Khodzhaeva et al., 2017], лекарственными средствами [Hanif et al., 2016], антибиотиками [Patel et al., 2016], антисептическими средствами [Wei et al., 2014]. В одном из исследований нанотрубки галлуазита загружали лекарственным препаратом – дилтиаземом [Levis et al., 2003]. Для увеличения диаметра внутренней полости и впоследствии для увеличения количества загружаемого вещества внутрь нанотрубок авторы использовали серную кислоту (H2SO4) (рисунок 5В). Серная кислота выборочно вытравляет слой алюминия внутренней полости нанотрубок галлуазита. В работе были определены условия реакции (температура, концентрация кислоты и нанотрубок галлуазита), которые позволяют выборочно вытравить внутреннюю часть трубок и увеличить диаметр с 10–15 нм до 25–30 нм, сохраняя форму трубок и внешний диаметр.
Увеличение диаметра полости нанотрубок галлуазита приводит к увеличению количества загружаемых веществ [Abdullayev et al., 2012]. В ряде экспериментальных работ было подтверждено, что нанотрубки галлуазита являются безопасным и биосовместимым материалом. В одной из работ была выполнена многослойная сборка нанотрубок галлуазита на пластиковой или стеклянной поверхности с помощью метода послойного нанесения. Добавление тонких пленок галлуазита улучшило адгезию фибробластов кожи человека, и они сохранили нативное фенотипическое строение клетки. Фибробласты прикреплялись и распределялись быстрее на подложке, покрытой нанотрубками галлуазита, чем на кремниевых или стеклянных поверхностях [Zhou et al., 2010]. Было также показано, что после модификации фибробластов полиэлектролитными пленками, сферическими наночастицами титана и нанотрубками галлуазита с помощью метода послойного нанесения клетки сохраняли свою способность пролиферировать [Kommireddy et al., 2005].
Модификация клеточной поверхности микроорганизмов наноматериалами
PAH-МНЧ наносили непосредственно на поверхность клеток (прямое нанесение), без использования дополнительных полиэлектролитных слоев, как в случае метода послойного нанесения [Joseph et al., 2014]. К 500 мкл водной суспензии клеток добавляли 500 мкл раствора PAH стабилизированных магнитных наночастиц, инкубировали 15 минут с перемешиванием и промывали раствором NaCl (1,945%) от не связавшихся наночастиц. В ходе работы изучали взаимодействие клеток с PAH-стабилизированными магнитными наночастицами (PAH-МНЧ) следующих концентраций: 0,5; 1; 1,5; 2 и 2,5 мг/мл.
В работе было исследовано влияние магнитных наночастиц на формирование биопленок бактерий A. borkumensis. Для формирования биопленок в адгезивные чашки Петри вносили 2 мл жидкой среды Difco broth, 200 мкл суспензии клеток концентрации 1 о.е. (отмытые раствором 1,945% NaCl), 200 мкл суспензии наноматериалов. Формирование биопленки происходило в течение 24–72 часов (плотность получаемой биопленки зависит от продолжительности инкубации) при перемешивании в планшетном инкубаторе (ELMI ST-3) при 30С.
В ходе работы было проведено исследование по направленному магнитно ориентированному движению модифицированных клеток A. borkumensis в сторону субстрата. Для этого смешивали 500 мкл суспензии клеток и 500 мкл полиэлектролит-стабилизированных магнитных наночастиц (2,5 мг/мл) и инкубировали 15 минут с перемешиванием при комнатной температуре. После инкубации клетки отмывали от избытка наночастиц, осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 3 минут до конечного объема 500 мкл. На агаризованную среду с нефтью и магнитом наносили тонкую полоску или каплю суспензии клеток, покрытых магнитными наночастицами. Схема нанесения клеток на чашку Петри представлена ниже (рисунок 13). В качестве модельной смеси углеводородов была использована нефть Нурлатского месторождения. Нефть данного месторождения обладает высокой вязкостью, является тяжелой, сернистой, высокосмолистой, но малопарафинистой и с низким содержанием фракции н.к. 200 С (н.к. – температура начала кипения) и со средним содержанием фракции н.к. 300 С [Ященко и Полищук, 2011].
Нанотрубки галлуазита отмывали 3 раза MilliQ H2O с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 4 минут, далее обрабатывали ультразвуком (3 минуты при 20% мощности ультразвукового диспергатора) и отмывали 3 раза MilliQ H2O.
Модификацию клеток бактерий A. borkumensis и дрожжей S. cerevisiae нанотрубками галлуазита проводили аналогично и согласно стандартному методу послойного нанесения (layer-by-layer) с использованием пары стандартных полиэлектролитов PAH и PSS [Guo et al., 2009]. К 100 мкл суспензии клеток добавляли 1 мл раствора PAH в концентрации 1 мг/мл, перемешивали, 15 мин инкубировали при перемешивании в закрытой пробирке при комнатной температуре. Затем для удаления избытка полиэлектролита осадок трижды промывали раствором NaCl, центрифугируя каждый раз в течение 2 минут при 4000 об/мин. К 100 мкл суспензии отмытых клеток добавляли 1 мл подготовленных, отмытых нанотрубок галлуазита в концентрации 2,5 мг/мл, перемешивали, инкубировали и отмывали так же, как после нанесения слоя PAH. Аналогично наносили следующие слои полиэлектролитов PAH и PSS на поверхность клеток с частицами.
В результате получали клетки, модифицированные многослойными полиэлектролитными пленками и нанотрубками галлуазит: клетка/PAH/галлуазит/PAH/PSS (рисунок 22).
Модификацию клеток PAH/PSS/PAH/PSS проводили аналогично модификации PAH/галлуазит/PAH/PSS, нанося вместо слоя нанотрубок галлуазита слой PSS. Получали клетки, покрытые многослойными полиэлектролитными пленками: клетка/PAH/PSS/PAH/PSS [Zamaleeva et al., 2010].
Модификацию клеток ФИТЦ (FITC) мечеными нанотрубками галлуазита проводили аналогично с п. Модификация клеточной поверхности бактерий A. borkumensis и дрожжей S. cerevisiae нанотрубками галлуазита. Только вместо нативных нанотрубок галлуазита были использованы модифицированные, меченые ФИТЦ.
Также проводили прямую модификацию клеток галлуазит/ФИТЦ-PAH. Для этого суспензию клеток (100 мкл) инкубировали в течение 15 мин с галлуазит/ФИТЦ-PAH и отмывали от избытка частиц раствором NaCl. Аналогично проводили модификацию клеток A. borkumensis PAH-стабилизированными нанотрубками галлуазита. К суспензии культуры клеток бактерий (500 мкл, 1 о.е.) добавляли 500 мкл полиэлектролит-стабилизированных магнитных наночастиц, инкубировали 15 минут при перемешивании. Далее отмывали от свободных, не связавшихся наночастиц раствором NaCl (1,945%) центрифугированием при 4000 об/мин в течение 4-5 минут.
В работе путем термической декомпозиции и растворения кислотой получали полые микрокапсулы на основе нанотрубок галлуазита. Процесс термической декомпозиции проводили следующим образом: на покровное стекло наносили 50 мкл образца, высушивали при 37С в термостате в течение часа, данный образец на покровном стекле помещали в керамический тигель и далее в печь, выжигание клеток проводили при 600С в течение 3 часов. Растворение клеток проводили с помощью кислоты (HCl, 38%) в течение 2 часов.
К суспензии клеток дрожжей S. cerevisiae (1 о.е.), трижды отмытой от среды раствором 0,9% NaCl, добавляли 1 мл магнитно-модифицированных нанотрубок галлуазита (1 мг/мл), инкубировали 15 мин при перемешивании, и в дальнейшем отмывали от избытка не связавшихся магнитных нанотрубок галлуазита раствором 0,9% NaCl.
К суспензии клеток дрожжей S. cerevisiae (1 о.е.) или бактерий E. coli, трижды отмытой от среды раствором 0,9% NaCl, добавляли 1 мл полимер стабилизированных серебряных наночастиц, инкубировали 15 мин при перемешивании и в дальнейшем отмывали от избытка не связавшихся наночастиц раствором 0,9% NaCl.
Модификация клеток микроорганизмов наноматериалами методом послойного нанесения (layer-by-layer)
Иммобилизацию наноматериалов (нанотрубки галлуазита) на поверхность клеток микроорганизмов проводили методом послойного нанесения с применением пары противоположно заряженных полиэлектролитов: PAH и PSS (рисунок 19) [Decher et al., 1998; Joseph et al., 2014]. Адсорбция наноматериалов на клеточной поверхности происходит за счет электростатического взаимодействия. Так, с помощью данного метода на любую подложку можно нанести неограниченное количество слоев полиэлектролитов и наноматериалов.
Схематично процесс нанесения слоев полиэлектролитов и наночастиц представлен на рисунке 20.
Методом послойного нанесения была модифицирована поверхность клеток дрожжей S. cerevisiae, бактерий A. borkumensis и микроводорослей C. pyrenoidosa нанотрубками галлуазита. Данный метод основан на использовании положительно и отрицательно заряженных полиэлектролитов, например, таких как положительно заряженный – PAH и отрицательно заряженный – PSS. Поочередное нанесение данных полиэлектролитов сопровождается сменой значения и знака дзета-потенциала клеток микроорганизмов. При нанесении положительно заряженного полиэлектролита клетки приобретают положительный потенциал, отличающийся от потенциала интактных клеток (рисунок 21).
После модификации нативных клеток дрожжей S. cerevisiae, имеющих дзета-потенциал –15,5 мВ положительно заряженным полиэлектролитом PAH, клетки приобретают положительный дзета-потенциал +30 мВ (таблица 8, рисунок 21). Аналогичные результаты наблюдаются и при модификации клеток водорослей C. pyrenoidosa. При модификации клеток водорослей C. pyrenoidosa положительно заряженным полиэлектролитом PAH наблюдается смена дзета-потенциала клеток с –26,6 мВ на +38,1 мВ. Зигзагообразное изменение значений поверхностного заряда свидетельствует об успешной и эффективной иммобилизации противоположно заряженных полиэлектролитов и нанотрубок галлуазита на поверхность клеток микроорганизмов (рисунок 21).
Первоначально характеристику микроинкапсулированных клеток дрожжей S. cerevisiae и водорослей C. pyrenoidosa проводили с помощью оптической микроскопии. На светлопольных и темнопольных микрофотографиях заметна шероховатая поверхность микроинкапсулированных клеток дрожжей S. cerevisiae (рисунок 22 Б и В) по сравнению с интактными клетками (рисунок 22А).
Для более детального исследования клеточной поверхности, модифицированной нанотрубками галлуазита, была применена сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), были получены изображения поверхности объекта с высоким (до 0,4 нм) пространственным разрешением, а также информация о составе, строении и некоторых других свойствах поверхностных слоев. При подготовке образцов для сканирующей электронной микроскопии требуются определенные методические приемы, образец должен быть токопроводящим, что достигается напылением высокоочищенных тяжелых металлов (золото, платина, палладий и их сплавы). На рисунке 23 представлены микрофотографии, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа, интактных клеток дрожжей S. cerevisiae (рисунок 23А), водорослей C. pyrenoidosa (рисунок 23В), и модифицированных нанотрубками галлуазита клеток данных микроорганизмов (рисунок 23 Б, Г).
На микрофотографиях показано, что нанотрубки галлуазита равномерно покрывают поверхность клеток дрожжей S. cerevisiae. Интактные и микроинкапсулированные клетки значительно отличаются друг от друга шероховатостью поверхности. Схожие результаты были получены и при микроинкапсуляции клеток водорослей C. pyrenoidosa (рисунок 23 В и Г). На рисунке 23 Б, Г хорошо видно, что нанотрубки галлуазита покрывают монослоем клеточную стенку дрожжей S. cerevisiae, и водорослей C. pyrenoidosa. Возможно, это связано с тем, что полиэлектролитные слои обеспечивают эффективную и равномерную иммобилизацию нанотрубок галлуазита на поверхности клеток микроорганизмов.
На рисунке 24 представлены электронные микрофотографии тонких срезов клеток дрожжей S. cerevisiae, по которым можно проанализировать внутреннюю организацию и структуру клеток. Клеточная стенка (рисунок 24А) интактной клетки гладкая и однородная. После модификации полиэлектролитами и нанотрубками поверхность клетки становится неоднородной, шероховатой и на ней четко обозначены нанотрубки галлуазита, что хорошо видно на рисунке 24 Б. Также, анализ электронных микрофотографий позволяет говорить о непроницаемости клеточной стенки дрожжей для нанотрубок галлуазита и, следовательно, нанотрубки не могут нарушить внутреннюю организацию модифицированных клеток. Кроме того, монослой галлуазита на поверхности не затрудняет транспорт низкомолекулярных веществ через клеточную стенку, т.е. в инкапсулированную клетку свободно могут проникать питательные вещества и выводиться метаболиты.
На основе микроскопических исследований можно сделать вывод о том, что метод послойного нанесения может рассматриваться в качестве эффективной методики для иммобилизации нанотрубок галлуазита на поверхность клеток разных микроорганизмов (дрожжи, водоросли и бактерии).
Характеристика жизнеспособности наномодифицированных клеток микроорганизмов
Были проведены исследования по влиянию каждого вида используемых наноматериалов на жизнеспособность клеток микроорганизмов. Для оценки жизнеспособности в работе были использованы следующие методы: рост культуры клеток – кривая роста, биохимический метод определения физиологической активности микроорганизмов с помощью флуоресцеин диацетата (ФДА) и йодистого пропидия (PI), которые часто используются при оценке жизнеспособности эукариотических [Breeuwer et al., 1995] и бактериальных клеток [Yang et al., 2012б], а также ферментативная активность клеток (резазурин, МТТ).
Одним из важных показателей жизнеспособности является рост культуры клеток. Культивирование бактерий на искусственных питательных средах, которое лежит в основе всех микробиологических исследований, позволяет выяснить морфологические, физиологические и другие особенности микроорганизмов. Исследование динамики роста культуры проводили после иммобилизации на клетки микроорганизмов следующих наноматериалов: полиэлектролитов, нанотрубок галлуазита, модифицированных нанотрубок галлуазита, магнитных наночастиц и серебряных наночастиц. Рисунки 39, 40 и 41 демонстрируют кривые роста дрожжей S. cerevisiae, бактерий E. coli и A. borkumensis. По кривым роста модифицированных нанотрубками галлуазита клеток дрожжей S. cerevisiae (рисунок 39А) можно сделать вывод о наличии более продолжительной лаг фазы у клеток, модифицированных нанотрубками галлуазита и полиэлектролитными пленками PAH/PSS/PAH/PSS по сравнению с интактными клетками. Интересно, что дрожжи, растущие в присутствии нанотрубок галлуазита, по характеру роста не отличались от интактных клеток. Это позволяет сделать вывод, что нанотрубки не оказывают ингибирующего влияния на процессы, связанные с ростом клеток, а возможной причиной увеличения лаг-фазы у инкапсулированных дрожжей являются многослойные полиэлектролитные пленки на поверхности клеток дрожжей S. cerevisiae. Возможно, полиэлектролитные слои на клеточной поверхности являются препятствием для транспорта веществ через мембрану и задерживают первое деление клеток, что ведет к удлинению лаг-фазы.
Также можно отметить, что у клеток, модифицированных слоями PAH/галлуазит/PAH/PSS и PAH/PSS/PAH/PSS, есть четко выраженная фаза ускорения роста (примерно около 10 ч), в то время как остальные варианты практически сразу переходят в экспоненциальную фазу роста.
На рисунках 40 и 41 представлены кривые роста бактерий E. coli, модифицированных полиэлектролитами и серебряными наночастицами, стабилизированными полиэлектролитами. Данные показали, что происходит полное ингибирование роста клеток бактерий E. coli в присутствии полиэлектролитов PEI и PDADMAC. Дальнейший рост и деление клеток бактерий E. coli не наблюдается (рисунок 40 Б и В). Характер роста клеток в присутствии полиэлектролита PAH не отличается от интактных клеток (рисунок 40 А). Характер роста клеток микроорганизмов, модифицированных магнитными, серебряными наночастицами, нанотрубками галлуазита или магнитно модифицированным галлуазитом, незначительно отличается от роста клеток с интактной клеточной поверхностью (рисунок 39 Б, В, Г и рисунок 41). Наночастицы в изучаемых концентрациях не влияют на жизнеспособность клеток микроорганизмов.
ФДА является флуоресцентным красителем, низкомолекулярным гидрофобным соединением, которое свободно проникает через клеточную мембрану путем пассивной диффузии и гидролизуется внутриклеточными эстеразами с образованием флуоресцентного соединения, флуоресцеина, который обладает зеленой флуоресценцией при возбуждении длиной волны 488 нм. Если мембрана клетки не повреждена, флуоресцеин аккумулируется в цитоплазме живых клеток, обеспечивая тем самым интенсивное зеленое свечение. В мертвых клетках не происходит аккумулирования ФДА, даже если эстеразы активны и продолжают работать, так как в мертвых клетках происходит деградация мембран и флуоресцирующий продукт легко выходит из клетки. Таким образом, ФДА является специфическим красителем для клеток, обладающих эстеразной активностью и ненарушенными клеточными мембранами. PI не способен проникать через мембрану нативной клетки, поэтому накапливается только в погибших клетках, имеющих мембранные дефекты, и связывается там с нуклеиновыми кислотами. При этом у мертвых клеток наблюдается красная флуоресценция. Данные методы с ФДА и PI были использованы при оценке жизнеспособности клеток микроорганизмов, модифицированных нанотрубками галлуазита (рисунок 42), магнитными нанотрубками галлуазита (рисунок 43) и серебряными наночастицами (рисунок 43).
Для определения жизнеспособности модифицированных клеток водорослей было использовано свойство автофлуоресценции. Живые клетки С. pyrenoidosa обладают интенсивной флуоресценцией благодаря наличию фотосинтетического аппарата. Автофлуоресценция водорослей возникает при возбуждении светом длиной 460 нм, соответствующая максимуму поглощения хлорофилла b. Данный тест ранее был разработан и успешно применен для оценки жизнеспособности водорослей Chlorella [Chong et. al., 2008]. Водоросли, функционализированные полиэлектролитами и наночастицами, также, как и интактные, флуоресцируют при длине волны 540 нм, в красной части спектра, что в свою очередь означает отсутствие отрицательного эффекта нанотрубок галлуазита на жизнеспособность водорослей, что продемонстрировано на рисунке 42 В, Г.
На рисунке 42 А, Б представлены оптические микрофотографии интактных дрожжей и модифицированных нанотрубками галлуазита клеток и изображения, полученных с помощью флуоресцентного микроскопа. На рисунке 42Б представлены модифицированные клетки дрожжей S. cerevisiae, имеющие зеленую флуоресценцию, из чего можно сделать вывод, что после модификации полиэлектролитными пленками и нанотрубками клетки сохраняют эстеразную активность и, следовательно, жизнеспособность.
Количественная обработка оптических микрофотографий клеток дрожжей S. cerevisiae, окрашенных красителями ФДА и йодистым пропидием, показывает, что около 81% клеток дрожжей остается жизнеспособным после микроинкапсуляции в нанотрубки галлуазит (рисунок 42Б).