Содержание к диссертации
Введение
Раздел 1 Ассоциативные микроорганизмы и продукционный процесс у растений. Рис – ценная продовольственная культура (обзор литературных данных) 13
1.1 Влияние ассоциативных микроорганизмов на продукционный процесс растений 13
1.2 Агротехнологические особенности выращивания риса 24
1.3 Биологическая активность почвы рисових полей 29
Раздел 2 Объекты и методы исследования 40
2.1 Объекты исследования 40
2.2 Методы исследования 41
2.2.1 Микробиологические методы исследования 41
2.2.2 Методы и условия проведения лабораторних, вегетационных и полевых опытов 45
2.2.3 Методы агрохимические и математического анализа результатов.. 47
2.3 Агроклиматические условия 48
Раздел 3 Выделение ассоциативных с растениями риса штаммов бактерий и изучение их свойств . 50
3.1 Выделение штаммов микроорганизмов, ассоциативных с растениями риса, и их идентификация . 50
3.2 Изучение полезных свойств выделенных штаммов . 63
3.3 Технологические свойства штаммов 76
Раздел 4 Биологическая активность ризосферы при формировании системы ассоциативные бактерии – растения риса 81
4.1 Динамика численности микроорганизмов основных эколого-трофических групп в ризосфере риса при интродуции ассоциативных с растениями штаммов бактерий 81
4.2 Динамика биологической активности почвы ризосферы риса при интродукции штаммов ассоциативных с растениями 94
4.3 Агрохимические показатели почвы ризосферы риса под влиянием ассоциативных микроорганизмов. 101
Раздел 5 Эффективность функционирования ассоциативной системы ризобактерии – растения риса 109
5.1 Биологическая продуктивность системы ризобактерии-Oryza sativa L. 109
5.2 Биоэнергетическая эффективность ассоциативной систем ризобактерии-растения риса 114
Заключение 117
Выводы . 121
Список условных обозначений и сокращений 124
Словарь терминов 125
Список литературы 126
Приложения 156
- Влияние ассоциативных микроорганизмов на продукционный процесс растений
- Изучение полезных свойств выделенных штаммов
- Динамика биологической активности почвы ризосферы риса при интродукции штаммов ассоциативных с растениями
- Биологическая продуктивность системы ризобактерии-Oryza sativa L.
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Рис одна из важных сельскохозяйственных и продовольственных культур многих стран мира. По посевным площадям (140 млн га) и валовому сбору урожая (более чем 470 млн т) рис занимает третье место в мире после пшеницы и кукурузы. В структуре посевных площадей Российской Федерации, отведенных под зерновые и зернобобовые культуры в 2014-2015 году, рис занимал 0,4%, а валовый сбор зерна составил 1079 тыс. т (среднее за два года) (Малышева, 2016). В Крыму рис выращивали до 2014 года на площади около 18 тыс. га и получали высокий урожай качественного зерна.
Значительное количество почв рисовых чеков подвержено засолению в Ростовской и Астраханской областях, в Краснодарском крае и Крыму. Промывной режим при выращивании риса способствует рассолению почвы, и это дает возможность выращивать в рисовых севооборотах другие сельскохозяйственные культуры. Рисосеяние не только обеспечивает страну ценными продуктами питания, но и улучшает почвенное плодородие.
Для получения высоких урожаев культуры риса широко применяют
интенсивные технологии (высокоурожайные сорта, минеральные и
органические удобрения, химические средства защиты растений от болезней, вредителей и сегетальных растений) (Гончарова, 2014). Выращивание риса в севооборотах 2-3 года подряд, а иногда в монокультуре, требует повышения доз минеральных удобрений и средств защиты растений от патогенов, что приводит к усугублению экологических проблем (Третьякова и др., 2016). В связи с широким применением минеральных азотных удобрений нитриты и нитраты из почвы поступают в поверхностные и подземные воды, становясь причиной эвтрофикации водоемов, фактором загрязнения питьевых источников (Бородычев и др., 2017; Мных, Поляков, 2016).
Снижение антропогенной нагрузки при выращивании риса возможно при
условии разработки элементов биологического земледелия. Одним из аспектов
биологизации земледелия является применение микробных препаратов на
основе эффективных штаммов различной функциональной направленности.
Микроорганизмы участвуют в преобразовании минеральных и органических
соединений, синтезируют биологически активные вещества, способствуют
изменениям в физико-химических свойствах почвы, стимулируют или
подавляют рост растений (Naik еt аl., 2008; Andres, 2009; Jiang еt аl., 2012).
Применение микробных препаратов позволяет повысить количество полезных
форм микроорганизмов, которые могут конкурировать с аборигенной
микробиотой и быстро занимать экологическую нишу в ризосфере растений.
Интродукция в ризосферу растений эффективных штаммов бактерий различной
функциональной направленности способна активизировать процессы,
направленные на повышение продуктивности сельскохозяйственных культур (Poonguzhali , 2008).
Несмотря на мировой опыт селекции эффективных в сельском хозяйстве микроорганизмов, поиск новых штаммов с комплексом полезных для растений свойств, устойчивых к постоянно меняющимся условиям окружающей среды (деградация гумуса, способы обработки почвы, виды удобрений и средств защиты, сорта растений) и выполняющим свою экологическую функцию является важным.
Учитывая вышесказанное, выделение штаммов бактерий, способных формировать эффективные ассоциации с растениями риса при определенных условиях, является актуальным для повышения биологического потенциала растений. Интродукция ассоциативных штаммов в ризосферу позволит активизировать естественные процессы у растений и повысить их продуктивность и качество полученной продукции.
Степень разработанности темы.
Изучению почв под культурой риса и направленности в них
микробиологических процессов посвящены труды отечественных и
зарубежных исследователей. Выявлена положительная избирательная
способность корневой системы риса для диазотрофов и целлюлозолитических
микроорганизмов (Balandreau, 1975; Yoshida, 1970, 1971; Nayk, 1981) и
отрицательная для микромицетов (Семенова, 1973; Долгих, 1977). Reinhold
(1997, 2007) описал взаимодействие азотфиксирующих бактерий рода Azoarcus,
характерных для затапливаемых территорий, с растениями. Yoshida (1975,
1977) изучил проблему повышения азотфиксирующей активности почв
рисовых полей благодаря цианобактериям. Емцев (1988, 1994), Умаров (2007)
внесли большой вклад в методологию азотфиксации бактериями. Илялетдинов
(1974), Калининская (1980), Дебривная (1969, 1970) посвятили ряд своих
исследований проблемам биологической фиксации азота в затопляемых почвах
рисовых полей и поиску путей её повышения. В их работах охарактеризованы
штаммы (культуры) микроорганизмов с высокой азотфиксирующей
активностью. Белимов (2012) изучал фундаментальные аспекты
агроэкологических условий азотфиксации микроорганизмов, а также разработал методы изучения и раскрытия механизма взаимодействия диазотрофов с рисом и другими культурами.
Исследования проводились в рамках программ научных исследований
Национальной академии аграрных наук Украины: 05. "Сельскохозяйственная
микробиология", задание «Исследовать механизмы и условия создания
эффективных микробно-растительных систем с целью повышения
продуктивности растений и их устойчивости к антропогенным и природным стресс-факторам» (ДР № 0111U003000); 03. «Агроэкология» Экологическая
безопасность агропромышленного производства, задание «Разработать научные
основы оценки агротехнологий по биодиагностическим показателям и мерам
улучшения экологического состояния агроценозов» (ДР № 0111U003003),
тематики научно-исследовательской работы отдела сельскохозяйственной
микробиологии ФБУН «НИИСХ Крыма» «Разработка научно-методических
основ технологии культивирования микроорганизмов, получения
полифункциональных микробных препаратов для использования в системе агротехнических мероприятий возделывания сельскохозяйственных культур», Раздел II "Земледелие", подраздел 6, согласно программы ФНИ на 2013-2020 гг.
Цель данной работы: оценка влияния ассоциативных штаммов диазотрофных бактерий риса при интродукции в систему ризобактерии -растение в условиях лугово-каштановой почвы.
Согласно поставленной цели задачи исследования заключались в следующем:
-
Выделить ассоциативные с растениями риса штаммы азотфиксирующих бактерий;
-
Провести первичную оценку выделенных штаммов и изучить их влияние на развитие растений риса в условиях вегетационных опытов;
-
Изучить физиолого-биохимические и технологические свойства эффективных изолятов и провести их идентификацию;
-
Выяснить влияние ассоциативных бактерий на формирование и функционирование ризосферы растений риса;
-
Исследовать влияние штаммов ассоциативных бактерий на продуктивность риса в условиях полевых опытов лугово-каштановой почвы;
-
Дать оценку биоэнергетической эффективности применения ассоциативных штаммов в агроценозах риса.
Научная новизна результатов исследования. Впервые для культуры
риса применен методический подход, разработанный Шерстобоевым Н.К. и др.,
для выделения ассоциативных с растениями бактерий. Выделены таким
методом штаммы бактерий разных таксономических групп, среди которых
преобладают представители рода Bacillus (35,7%). Штаммы Phyllobacterium
ifriqiyense 6, Agrobacterium tumefaciens 32 и близкий к виду Flavobacterium
pectinovorum штамм 72, формирующие эффективные ассоциации с растением
риса, депонированы в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов
сельскохозяйственного назначения при ФГБНУ ВНИИСХМ
() как ценный
генетический ресурс.
Исследован механизм взаимодействия ассоциативных штаммов с
растениями риса и показано, что азотфиксация, стимуляция роста растений составляет основу их функционирования в агроценозе риса. Впервые
установлена высокая степень ассоциативности бактерий рода Phyllobacterium с растениями риса. Доказано положительное влияние условно патогенных бактерий Agrobacterium tumefaciens на продуктивность риса и изучен механизм их взаимодействия с растением.
Установлено повышение биологической активности в ризосфере риса при интродукции ассоциативных штаммов в агроценоз, что способствует повышению биологической продуктивности риса на 34,8-69,6 %.
Теоретическая и практическая значимость работы. Данные результаты исследований углубляют представление о механизме микробно-растительного взаимодействия в системе почва – микроорганизм - растение.
Создана рабочая коллекция штаммов, ассоциативных с растениями риса бактерий, с комплексом полезных свойств, которые могут быть объектом фундаментальных исследований биоразнообразия рисового агроценоза.
Микробиологическому производству предлагаются перспективные
технологичные штаммы азотфиксирующих и стимулирующих рост растений ризобактерий (PGPR) для разработки микробных препаратов на их основе.
В агротехнологии выращивания риса для повышения урожайности культуры до 20-40% и улучшения качества продукции рекомендуется предпосевная инокуляция семян штаммами ассоциативных бактерий, что повышает ее биоэнергетическую эффективность.
Положения, выносимые на защиту:
-
В апикальной части корней риса преобладают ассоциативные с растением бактерии рода Bacillus.
-
Эффективные ассоциации с растением риса образуют бактерии родов Phyllobacterium, Agrobacterium и Flavobacterium, основу функционирования которых составляет азотфиксация и стимуляция роста растений, способствующие повышению содержания хлорофилла в листьях.
-
Ассоциативные штаммы Phyllobacterium ifriqiyense 6, Agrobacterium tumefaciens 32 и Flavobacterium sp. 72, активно колонизируя ризосферу растений риса, повышают ее биологическую активность.
-
Активное взаимодействие компонентов системы ассоциативные микроорганизмы - растения обеспечивает повышение биологической продуктивности риса, способствуя увеличению количества и массы зерен.
Методология и методы исследования: микробиологические: выделение штаммов микроорганизмов, ассоциативных с растением, с апикальной части корней риса, изучение их функциональных свойств, анализ ризосферы; физиолого-биохимические, культурально-морфологические и молекулярно-генетические идентификация выделенных штаммов; лабораторные, вегетационные и полевые изучение эффективного взаимодействия микро- и
макроорганизмов; математико-статистические оценка достоверности
полученных результатов и установление корреляционных связей.
Степень достоверности полученных результатов. Обоснованность и
достоверность выводов определена большим количеством лабораторных
исследований, полевых и вегетационных опытов, системным подходом,
точностью аналитических работ и подтверждена статистической обработкой
полученных данных, публикациями основных результатов в изданиях,
включенных в Перечень российских рецензируемых научных журналов,
апробацией материалов на съезде почвоведов и агрохимиков и конференциях
различных уровней. Достоверность полученных данных обеспечена
применением методик входящих в базу ГОСТов Общероссийского классификатора стандартов Российской Федерации.
Апробация результатов работы. Основные результаты исследований представлены на: ІІ Международной конференции «Молодежь в решении экологических и социально-экономических проблем современности» (Одесса, 2013); IX съезде почвоведов и агрохимиков «Охрана почв – основа устойчивого развития Украины» (Николаев, 2013); Х Научной конференции молодых ученых «Микробиология в современном сельскохозяйственном производстве» (Чернигов, 2014); 8-ой Международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений – основа стабилизации экосистем. Инновационные технологии применения биологических средств защиты растений в производстве органической сельскохозяйственной продукции» (Краснодар, 2014); Международной научно-практической конференции «Биологическая фиксация азота» (Тернополь, 2014); Международной научно-практической конференции «Природа, экология и народное хозяйство» (Воронеж, 2015); Всероссийской научной конференции, посвященной Международному году почв и 60-летию Кировского областного отделения Русского географического общества, «Почва – зеркало и память ландшафта» (Киров, 2015); IV Международной виртуальной интернет-конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее» (Казань, 2015); Научно-образовательной конференции молодых ученых «Инновационные биотехнологии в развитии АПК» (Краснодар, 2015); 21-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука ХХI века» (Пущино, 2017).
Публикации. По материалам исследований опубликовано 14 работ, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК, 6 публикаций в изданиях, внесенных в систему РИНЦ и 1 патент на изобретение.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, заключения и 11 выводов, списка использованных литературных источников. Диссертация изложена на 125 страницах печатного
текста и содержит 26 таблиц, 24 рисунка и 6 приложений. Список литературных источников включает 291 наименование, в том числе 110 иностранных авторов.
Личный вклад соискателя. Диссертация выполнена в отделе сельскохозяйственной микробиологии Федерального бюджетного учреждения науки «Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма» под руководством д-ра с.-х. наук Т.Н. Мельничук. Автором проанализирована соответствующая литература, выделены и идентифицированы штаммы, исследована их функциональная активность и эффективность в агроценозах риса, проведены лабораторные, вегетационные и полевые опыты и обобщены результаты исследований. Секвенирование гена 16S рРНК у нововыделенных ассоциативных штаммов и определение их свойств выполнены в рамках гранта (№16-34-50060 Идентификация и характеристика симбиотических свойств ростстимулирующих бактерий ризосферы риса, в ФГБНУ ВНИИСХМ) под руководством канд. биол. наук А.И. Шапошникова и д-ра биол. наук А.А. Белимова. Все данные диссертации, их интерпретация, выводы обработаны непосредственно автором.
Влияние ассоциативных микроорганизмов на продукционный процесс растений
Плодородие почвы определяется довольно сложным комплексом природных и антропогенных факторов и среди них самым важным является жизнедеятельность почвенных микроорганизмов, которые обеспечивают биологический круговорот веществ в природе, способность почвы к самоочищению [13, 48, 113, 128]. Микроорганизмы участвуют в превращении минеральных и органических соединений, синтезируют биологически активные вещества, могут обусловливать изменения в физико-химических свойствах почвы, стимулируют или ингибируют рост растений. Обеспечение растений необходимыми элементами питания является одной из наиболее важных функций микроорганизмов. Установлено, что обогащение ризосферы растений (пшеницы, сорго, проса, риса, кукурузы, подсолнечника, табака, сахарного тростника) ассоциативными, активно фиксирующими азот, бактериями, которые изолированы из корневой зоны других растений, способствует повышению урожая и содержанию азота в биомассе инокулированных растений [25, 33, 51, 145, 176]. Механизмы действия микроорганизмов на развитие растений самые разнообразные и активно обсуждаются в литературе [172,188, 210, 212, 216, 219, 220, 233, 252, 276].
Из всех факторов, определяющих продуктивность сложной системы почва-растение-микроорганизмы, последние играют чрезвычайно важную роль в ее функционировании. Микроорганизмы существенно влияют на формирование почвы, в большей степени определяют уровень ее плодородия [13, 113, 128, 147]. Микробиота чувствительна к воздействию различных факторов окружаюшей среды [19, 75, 189, 229, 266], в частности к фитопатогенам [200, 201].
Учеными разных стран разработана целая гамма микробных препаратов, которые эффективно используются в современных агроэкосистемах [78, 129, 153]. Бактериальные препараты комплексного действия обеспечивают прирост урожая, улучшение качества продукции и являются экологически безопасными [26, 32, 76]. Основой биопрепаратов являются микроорганизмы, обладающие комплексом агрономически полезных свойств: азотфиксация, фосфатмобилизация, ростстимуляция, антагонизм к фитопатогенам [33, 111, 232, 255], а также способны повышать продуктивность растений и качество продукции, не разрушая естественного плодородия почв, и сохранять экологическое равновесие в окружающей среде [4]. Проявление этих свойств, при взаимодействии с растениями позволяет в некоторой степени уменьшить количество химических обработок и дозы внесения минеральных удобрений [20, 38, 228].
Известно, что в состав корневых экссудатов входят азотсодержащие соединения (аминокислоты), а также много различных вторичных метаболитов, которые выполняют роль молекулярных сигналов. Корневые выделения могут как стимулировать, так и подавлять развитие микроорганизмов и семян других растений [190, 257, 261, 272]. Биотехнологические методы могут быть привлечены к регуляции продукции вторичных метаболитов [88].
Механизмы действия микроорганизмов на развитие растений самые разнообразные и активно обсуждаются в литературе [210, 212, 216, 219, 220, 233, 252, 276]. В корневой зоне небобовых растений не образуются специфические азотфиксирующие структуры, и поэтому складываются особые взаимоотношения между растениями и микроорганизмами, которые определяются как ассоциативный комплекс [132, 159]. Эти системы привлекают пристальное внимание ученых, исследующих проблемы биологического азота и фосфора [24, 52, 94, 176, 208, 274].
Спектр изученных диазотрофных бактерий постоянно пополняется. Давно известные свободноживущие бактерии Azotobacter, Clostridium, Azospirillum, Beijerinckia, Derxia были дополнены факультативно-анаэробными бактериями, такими, как энтеробактерии, играющими важную роль в фиксации азота атмосферы в целинных лесных почвах, а также бактерии рода Xanthobacter в окультуренных почвах южной зоны. В настоящее время способность к фиксации азота из атмосферы установлена у представителей большинства таксономических групп бактерий. Важное место в осуществлении этого процесса занимают бактерии рода Azotobacter, который является известным индикатором окультуренности почвы [21, 85, 243]. Изучены генетические аспекты регулирования процесса азотфиксации в свободноживущих микроорганизмах, в том числе и азотобактера [213, 214] и показано их ростстимулирующее действие на растение [215].
Активными азотфиксаторами среди грамположительных бактерий являются клостридии и бациллы [42]. Обнаружены два вида бацилл, характеризующихся высокой азотофиксирующей активностью, B. polymyxa и B. macerans. На основании генетических особенностей эти два вида переносятся в относительно недавно созданный род Paenibacillus [235]. Штамм Bacillus megaterium является активным колонизатором корней кукурузы и риса [286]. Новый вид азотфиксирующей бактерии Paenibacillus brasilensis получен из ризосферы кукурузы в Бразилии [248]. Заселение цианобактериями рисовых полей увеличивает урожай риса примерно на 20%. В умеренном климате ежегодная фиксация ими азота составляет не более 20-40 кг азота на гектар [3].
В зоне корней риса в природных условиях складывается особое сообщество ризосферной микробиоты в связи с выращиванием культуры в почвах, которые затапливаются водой. В его состав входят: анаэробные фототрофные бактерии и цианобактерии представители родов Rhodospirillum, Rhodomicrobium, Rhodopseudomonas, Rhodobacter [196]. Диазотрофы рода Azoarcus способны образовывать эндофитную ассоциацию с корнями риса, проникая в кортекс, систему везикул, ксилему и корневые волоски [256].
Поскольку в ризоплану и ризосферу растений попадают продукты фотосинтеза в виде корневых выделений, именно здесь складываются более благоприятные, в сравнении с почвой, условия для энергоемкого процесса микробной азотфиксации, который, в свою очередь, тесно связан с фосфорным питанием. Фосфор является энергетической основой фотосинтеза и продуктивных процессов у растений [37], а низкая доступность его растениям вызывает морфогенетические изменения в корнях [263]. Обеспечивать растения доступными формами фосфора способны микроорганизмы [17, 168, 253].
Кончик корня (апекс) имеет апикальный рост и окружен чехлом из слизи, предохраняющей его от механических и биологических повреждений. Формирование корневого чехлика происходит с участием, покрывающих его клеток, которые со временем, отделяясь от поверхности корня, выделяют такие вещества, как пектиновые арабиногалактановые полисахариды и глицинобогащенные белки [16]. Отдельные вещества, входящие в состав корневой слизи, могут использоваться микроорганизмами в качестве источника углерода [260].
Вещества, поступающие с экссудатами, утилизируются микробиотой прикорневой зоны и активизируют ее хемотаксисную активность. Достигая высокой численности, микроорганизмы вокруг корня образуют муфту, а на его поверхности биопленку, микроколонии или различные агрегаты [203]. Прикрепление клеток, необходимое для образования пленки, осуществляется с помощью адгезинов - полисахаридов и поверхностных белков [205]. Показаны механизмы прикрепления агробактерий к корням двудольных и однодольных растений и образования ими опухолей [198]. Объяснена роль внешних мембранных белков в адгезии клеток Pseudomonas fluorescens к корням. Лучшее развитие корневой системы растения обеспечивает индолилуксусная кислота, которую производит Pseudomonas putida [215].
Корневые волоски увеличивают всасывающую поверхность корня, выделяют продукты обмена и являются местом начального взаимодействия с микроорганизмами [184, 192]. Прикрепление микроорганизмов к поверхности корневых волосков растений начинается с первых минут контакта и может иметь различную продолжительность. Бактерии, несущие на своей поверхности сложный комплекс молекул различной природы, крепятся или боком, или одним из своих полюсов. Считается, что полярно располагаются те ризобии, которые под воздействием корневых экссудатов сформировали полисахаридную капсулу. Ответственным за первый этап прикрепления бактерий могут быть белки, которые находятся на поверхности микроорганизма.
Изучение полезных свойств выделенных штаммов
Азотфиксация является процессом восстановления атмосферного азота до аммиака [204], который становится доступным для растений. Нитрогеназа представляет собой ферментную систему, катализирующую реакцию азофиксации [60].
На долю фиксированного азота атмосферы свободноживущими и ассоциативными диазотрофами приходится примерно 30% от общего количества биологического азота [81, 160].
Одним из действенных средств повышения азотфиксирующей активности в ризосфере сельскохозяйственных культур является интродукция высокоэффективных конкурентоспособных штаммов бактерий – диазотрофов в ризосферу растений [99, 107, 247]. Известно, что диазотрофы обладают как правило комплексом полезных для растений свойств: стимуляция роста и развития, контроль фитопатогенов [81].
Ассоциативные бактерии могут улучшать питание растений такими элементами, как азот, фосфор, калий. Большинство необходимых растениям соединений фосфора относится к минеральным и органическим нерастворимым солям, которые недоступны для растений [242]. Как известно, ризосферные бактерии способны к растворению труднодоступных почвенных фосфатов, что положительно сказывается на фосфорном питании растений [182, 259].
При использовании в исследованиях селективных сред для характеристики хозяйственно-полезных свойств выделенных нами штаммов ассоциативных бактерий у 92,3% культур отмечен рост разной интенсивности на глюкозо-аспаргиновой среде (среде Муромцева для выделения фосфатмобилизирующих бактерий), однако, зоны растворения отсутствовали. Из выделенных нами штаммов 53,5% способны расти в условиях дефицита азота (среда Виноградского).
Учитывая, что продуктивность растений определяется наличием доступного азота, именно этот элемент оказывается первым в минимуме. Дальнейшие наши исследования были направлены на изучение такой экологической группы микроорганизмов как диазотрофы. Следует также отметить, что из злаковых культур, рис в ассоциации с почвенными диазотрофами имеет высокий уровень азотфиксирующей активности [127, 159]. Ассоциативные ризосферные микроорганизмы формируют на корнях растений сложные по таксономическому составу и структурно-функциональной организации сообщества, которые полифункционально влияют на растения. К этой группе относятся бактерии рода Azotobacter, Beijerinckia, Pseudomonas, Micrococcus, Bacillus, Azospirillum, Klebsiella [27, 42, 91, 117, 192, 194, 206, 279]. Скрининг нововыделенных штаммов по способности фиксировать азот атмосферы методом ацетилен-редукции позволил выявить наиболее активные из них (рисунок 3.5).
Ни один штамм не превысил, взятый нами за эталон по азотфиксирующей активности Azotobacter vinelandii 10702. Азотфиксирующая активность Flavobacterium sp. 77 была на уровне с P. Fluorescens П 10, имеющего высокую степень ассоциативности к растениям капусты [98].
Таким образом, установлено, что штаммы, ассоциативные с растениями риса в чистой культуре способны фиксировать азот атмосферы.
Наряду с азотфиксацией, важными механизмом взаимодействия диазотрофов с растением, является синтез веществ, стимулирующих рост (ауксины, цитокинины, гиббереллины) [82, 166, 211]. Обработка семян сельскохозяйственных растений перед посевом диазотрофами способствует повышению их всхожести, скорости развития проростков и развития растений [117, 264, 273].
Биотест [11] на семенах пшеницы (таблица 3.2) показал положительный эффект бактеризации новыми штаммами. Всхожесть семян увеличилась на 7,7 – 30,8% в сравнении с контролем. Наибольшая эффективность отмечена у штаммов Flavobacterium sp. 5, Flavobacterium sp. 72 и Bacillus sp. 92.
Анализ результатов лабораторного опыта показал, что восемь из 10 исследуемых штаммов стимулировали рост корней, а четыре из них -проростки пшеницы (рисунок 3.6). Три штамма P. Ifriqiyense 6, Flavobacterium sp. 72, шт. Cystobasidium minutum 11 оказали стимулирующее действие как на корень (на 31,5%, 20,8% и 32,6% к контролю), так и на побеги пшеницы (6,4%, 4,4% и 6,4% – соответственно). Неидентифицированный штамм ARR 1 оказывал угнетающее действие на корни и побеги семян соответственно на 76,8% и 36% в сравнении с контролем.
Положительное действие исследуемых штаммов на всхожесть семян и развитие проростков пшеницы позволило нам предположить о продуцировании фитогормонов ауксиновой природы, которое наиболее выражено у штаммов P. ifriqiyense 6, Flavobacterium sp. 72 и A. tumefaciens 32.
В модельных вегетационных опытах на двух образцах почвы исследовали влияние бактеризации на развитие растений риса. Высота инокулированных растений увеличивалась на 34,8-40,5% относительно контроля и на 10,8-15,6% относительно варианта с референтным штаммом. Превышение по массе растений составило 61,9-76,2% и 54,5-68,2% соответственно (таблица 3.3).
При инокуляции семян A. tumefaciens 32 длина корней увеличивалась на 108% по сравнению с контролем и на 15% – отнотельно референтного штамма A. radiobacter 204. При обработке семян риса ассоциативным штаммом P. ifriqiyense 6 высота растений превышала контроль в 1,3 раза, длина корней – в 1,9 раза, а воздушно-сухая масса растений – в 1,8 раза.
В литературе имеются сведения о положительном влиянии диазотрофов – продуцентов цитокининов на увеличение высоты растений [249] и их биомассы [6].
Дальнейшие исследования показали способность штаммов флаво- и агробактерий, ассоциативных с растениями риса, продуцировать фитогормоны, в частности индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) (таблица 3.4). Анализ результатов показал, что ассоциативные с растениями риса штаммы бактерий синтезируют фитогормоны ауксиновой природы. Штамм A. tumefaciens 32 в концентрации суспензии 1:50 проявил стимуляцию роста на 32 %, P. ifriqiyense 6 (1:10) – на 16 % превышали показатель контроля. Следует отметить, что A. tumefaciens 32 в разведениях 1:10 и 1:100, P. ifriqiyense 6 – 1:50 увеличивали прирост колеоптилей пшеницы на уровне аутентичного раствора (ИУК 10-5).
Динамика биологической активности почвы ризосферы риса при интродукции штаммов ассоциативных с растениями
Выявленная тенденция увеличения численности микроорганизмов отдельных эколого-трофических групп в результате интродукции нововыделенных штаммов ассоциативных бактерий вызывает научный интерес к исследованию биохимических процессов в ризосфере инокулированных растений. Одной из важных характеристик активности микробного сообщества почвы является определение интенсивности выделения СО2 [86]. Этот процесс очень динамичный и зависит от типа почвы, сезона, температуры, физиологического состояния растений и других факторов.
В условиях вегетационного опыта респирация ризосферной почвы повысилась в вариантах с предпосевной обработкой семян штаммами ассоциативных бактерий (рисунок 4.6).
Так, в варианте с применением штамма A.radiobacter 204 интенсивность выделения углекислого газа почвой ризосферы риса была на 70% выше, чем в контроле, в вариантах с обработкой A. tumefaciens 32 и P. ifriqiyense 6 на 117% и 122% - соответственно. Максимальная микробиологическая активность наблюдалась в варианте с обработкой Flavobacterium sp. 72 и респирация почвы была на 230% больше, чем в контроле.
Результаты исследований полевых опытов показали, что респирация ризосферной почвы повышается в вариантах с предпосевной обработкой семян (таблица 4.6).
Биологическая активность почвы ризосферы риса в вариантах с перспективными штаммами A. tumefaciens 32 и Flavobacterium sp. 72 в фазу кущения увеличивалась на 33 и 53% соответственно к контролю. В фазы цветения и созревания в вариантах с инокуляцией увеличение составляло 20-130% и 20-40% соответственно, относительно контроля. Эмиссия углерода в варианте с обработкой семян Flavobacterium sp. 72 на 40-130% превышала контроль и на 17-91% вариант с референтным штаммом A.radiobacter 204.
Биохимический гомеостаз почвы регулируется системой ферментов, осуществляющих функции синтеза или деструкции органических веществ в почве. Окислительно-восстановительные процессы в почве осуществляются группой ферментов – оксидоредуктаз, в том числе каталазы, которая осуществляет расщепление ядовитой для растений и микроорганизмов перекиси водорода. Считается, что каталазная активность имеет прямую зависимость от численности микроорганизмов при активной деятельности последних, и, наоборот, обратную зависимость - когда микробиота неактивна.
В вегетационных опытах отмечено повышение каталазной активности ризосферной почвы в вариантах с инокуляцией на 12,3-101,5% в сравнении с контролем (рисунок 4.7).
Такая тенденция наблюдалась и в полевых опытах по всем фазам вегетации растений риса в течение двух лет исследований (2012-2013 гг.) за исключением фазы созревания (2013 г.) с инокуляцией штаммом P. ifriqiyense 6, где этот показатель был на 7,3% ниже, чем в контроле. Максимальная же активность каталазы в эту фазу того же года наблюдалась в варианте опыта с референтным штаммом A. radiobacter 204 и превышала контроль на 46,3%. Два года подряд в фазу цветения варианты A. tumefaciens 32 и P. ifriqiyense 6 имели максимальные отметки каталазной активности и в 2012 году были на 192,3% и 161,5% выше контрольных, а в 2013 году – на 277,8% и 322,2%, соответственно (таблица 4.7).
Биологическая фиксация азота является эффективным экологическим, энергосберегающим приемом увеличения запасов азота и гумуса в почвах. Интегральным показателем процессов фиксации азота является их интенсивность. В связи с этим, важно иметь представление об интенсивности азотфиксации в различных типах почв, ризосфере растений и путях усиления данного процесса [11, 119, 149].
Исследуемые штаммы бактерий в чистой культуре фиксируют азот атмосферы (раздел 3). Результаты исследований почвы ризосферы (2012 г.) показали, что при интродукции штамма A. tumefaciens 32 нитрогеназная активность почти в 3 раз превышала контроль в фазу кущения (таблица 4.8). В фазу цветения ПАА в этом варианте составляла 314,4 нМоль С2Н4 / г почвы в час, против 236,9 нМоль С2Н4 в контроле. В фазу цветения отмечено резкое снижение ПАА по сравнению с кущением и созреванием, однако в вариантах с предпосевной обработкой семян P. ifriqiyense 6 и Flavobacterium sp. 72 этот показатель был на 135,4% и 91,0% больше, чем в контроле.
Результаты исследований 2013 года показали повышение потенциальной азотфиксирующей активности в фазу цветения в вариантах с обработкой семян штаммами A. tumefaciens 32 и Flavobacterium sp. 72 на 4,3% и 12,8% соответственно по сравнению с контролем (таблица 4.9). Максимальный показатель ПАА в фазу созревания отмечен в варианте с обработкой А. tumefaciens 32, и составил 839,1 нМоль С2Н4 / г в час, что на 63,2% превышало контроль (514,3 нМоль С2Н4 / г в час).
Определяли парный коэффициент корреляции (k) между количеством диазотрофов и ПАА. Корреляционный анализ показал прямую зависимость между исследуемыми признаками в фазы цветения и созревания со средним коэффициентом корреляции (0,3 k 0,7). Высокий коэффициент корреляции -0,89 (-1,0 k -0,7) определен в фазу кущения в условиях 2012 года, при этом отмечено обратную зависимость, как и в следующем году (рисунок 4.8).
После 2-3-летней монокультуры риса наблюдается снижение всхожести семян [240] и урожая, что связано с исчерпанием доступных для растений питательных веществ, размножением фитопатогенов и накоплением токсинов. Токсичные для растений вещества продуцируют многие актиномицеты, грибы и некоторые бактерии. Фитотоксические свойства рисовых полей обусловлены продуктами анаэробного метаболизма почвенных микроорганизмов, которые в севообороте – до очередного посева успевают разложиться, а в монокультуре – нет [151].
Токсичность почвы в 2012 году в фазу кущения выявлена в контроле (12,5%) и в варианте с P. ifriqiyense 6 (1,5%). В остальных вариантах отмечена стимуляция проростков тест-культуры и наибольшая в варианте с Flavobacterium sp. 72 (21,6%). Как было отмечено выше, фитотоксичность рисовых чеков обусловлена анаэробным метаболизмом и в фазу цветения культуры уровень воды выше, чем в фазы кущения и созревания. В этот период отмечается ингибирующее влияние почвы ризосферы на проростки. В фазу цветения во всех вариантах опыта проявлялась токсичность почвы ризосферы риса (таблица 4.10).
Биологическая продуктивность системы ризобактерии-Oryza sativa L.
Растения риса отзывчивы на различные агроприемы интенсификации производства зерна, в том числе бактеризацию семян. Одним из основных компонентов структуры урожая риса является продуктивность метелки, которая в зависимости от сорта, уровня минерального питания растений, температурных условий года существенно колеблется. Формирование элементов продуктивности метелки определяется уровнем притока к ней азотистых и углеродных соединений из вегетативных органов растений [28].
В фазу кущения температура оказывает значительное влияние на развитие растений и последующий урожай культуры. Оптимальной температурой почвы и воды в этот период считается 28-30С [57].
Установлена прямолинейная зависимость урожайности риса от количества тепла (коэффициент корреляции равен 0,968) [152]. По сумме температур за вегетационный период 2012 год был благоприятным для развития растений риса. Предпосевная бактеризация семян положительно влияла на такие структурные элементы урожая как количество зерен в колосе и массу 1000 семян (таблица 5.1).
Высокая зерновая продуктивность отмечалась у инокулированных растений риса в благоприятном по агроклиматическим условиям 2013 году и прибавка урожая составляла от 32,9 до 65,9% (таблица 5.2).
В условиях 2015 года инокуляция обеспечила увеличение исследуемых структурных элементов урожая. В варианте с P. ifriqiyense 6 зарегистрированы максимальные значения количества зерен в колосе 206,7 шт. и масса 1000 зерен – 25 г, против 122,3 шт. и 23,5 г в контроле. В этом варианте урожай зерна риса в 2,5 раза был больше, чем в контроле (таблица 5.3). В целом инокуляция семян риса перспективыми штаммами обеспечила прибавку урожая на 5,6-10,4 т/га или 80,0-148,6% к контролю.
Анализ урожайности за три года (таблица 5.4) показал стабильное повышение продуктивности риса при инокуляции семян перед посевом штаммами ассоциативных бактерий. Отмечено, что при бактеризации семян ассоциативными штаммами микроорганизмов количество зерен в колосе увеличивается на 31,8-43,9%. Масса 1000 семян, которая является одним из показателей качества риса (крупность зерен), при бактеризации увеличивалась на 5,1-12,8% относительно контроля.
Такой агротехнологический прием обеспечивал прибавку урожая зерна на 30,4-69,6%. Наиболее эффективной является инокуляция штаммом P. ifriqiyense 6, обеспечивающей стабильную прибавку урожая в среднем за три года на 6,4 т/га к контролю, и на 3,6 т/га выше рефернтного.
Таким образом, предпосевная обработка семян ассоциативными штаммами микроорганизмов является эффективным агротехнологическим приемом современного земледелия для оптимизации азотного питания растений. Показано, что перспективные штаммы повышают биологическую продуктивность риса. Прирост урожая зерна риса при инокуляции семян штаммом P. ifriqiyense 6 в условиях 2012 года составил 4,0 т / га (34%), в 2013 -4,2 т / га (51%) , в 2015 г. – 10,4т/г (148%) к контролю. Максимальный урожай риса в 2013 году получено в варианте с инокуляцией A. tumefaciens 32, который составил 13,6 т / га против 8,2 т / га в контроле. Обработка семян риса перед посевом ассоциативными штаммами – эффективный технологический прием, обеспечивающий прибавку урожая в среднем за три года исследований от 30,4 до 69,6%, за счет повышения массы семян и количества зерен в колосе.
Качество производимого в Крыму риса получило высокую международную оценку. Европейский центр по изучению рынка в 2004 году (г. Брюссель, Бельгия), проведя экспертизу риса выращиваемого на севере Крыма, не только рекомендовал его реализацию на международном рынке, но и выдал Сертификат о качестве, подтверждающий его соответствие мировым стандартам, высокое качество и конкурентоспособность. Международную Золотую медаль качества и Сертификат качества был получен и в июле 2005 года на IV международной деловой встречи "Мальта: средиземноморские перспективы" [22].
Одним из показателей качества зерна является содержание влаги, которая влияет на интенсивность биохимических и микробиологических процессов, а они в свою очередь на технологические и пищевые качества зерна. Анализ качества зерна (таблица 5.5) показал тенденцию уменьшения массовой доли влаги в зерне при инокуляции семян новыми штаммами, имеет большое значение при хранении продукции.
В вариантах с инокуляцией увеличивается массовая доля золы, что является положительной характеристикой качества продукции, учитывая, что зола содержит необходимые для человека все макро- и микроэлементы. В отдельных случаях массовая доля сырой клетчатки уменьшается, и можно считать положительным фактом, ведь рис содержит 3% клетчатки и 80% углеводов, что обуславливает его высокую усвояемость.