Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Щелочные экосистемы и алкалофильное микробное сообщество 10
1.1. Типы щелочных экосистем 10
1.2. Механизм формирования содовых озер 11
1.3. Содовые озера как возможные наземные центры происхождения биоразнообразия 13
1.4. Характеристика и распространенность современных содовых озер 15
1.5. Функциональное разнообразие алкалофилыюго микробного сообщества 17
1.5.1. Продукционная часть 17
1.5.2. Деструкционная часть 19
1.5.2.1 Анаэробные алкалофилы 19
1.5.2.2. Аэробные алкалофилы 24
ГЛАВА 2. Денитрифицирующие микроорганизмы 32
2.1. Цикл азота и его особенности в содовых водоемах 32
2.2. Разнообразие путей восстановления нитрата 36
2.3. Разнообразие денитрифицирующих организмов 39
2.4. Типы бактериальных нитратредуктаз 40
2.5. «Альтернативные» нитратредуктазы 43
ГЛАВА 3. Жизнь микроорганизмов в условиях высоких концентраций солей 46
3.1. Краткая характеристика гиперсоленых экосистем 46
3.2. Галофильные микроорганизмы и их классификация 47
3.3. Механизмы адаптации галофилов к стрессовым условиям 49
3.3.1. Накопление неорганических ионов 49
3.3.2. Накопление органических осморегуляторов 54
Экспериментальная часть 58
ГЛАВА 4. Материалы и методы исследования 58
4.1. Микроорганизмы, среды и условия культивирования 58
4.2. Рост и ростовые характеристики 60
4.3. Аналитические определения 61
4.4. Получение суспензий клеток и бесклеточных экстрактов 62
4.5. Определение внутриклеточных концентраций ионов Na+, К+ и СГ 62
4.6. Анализ аминокислотного состава общего клеточного белка 62
4.7. Анализ осмолитов 63
4.8. Определение активности ферментов 63
4.9. Определение наличия молибденового кофактора 64
4.10. Определение молекулярной массы и субъединичного состава нитратредуктазы...65
4.11. Анализ металлов в активном центре нитратредуктазы 66
ГЛАВА 5. Описание алкалофильных денитрифицирующих бактерий из содовых озер 67
5.1. Систематическое положение новых денитрифицирующих галоалкалофилов 67
5.2. Физиология штамма Z-7398-2 69
5.3. Описание штаммов Z-7009 и AIR-2 - представителей новых видов рода Halomonas 76
5.3.1 Штамм Z-7009 76
5.3.2. Штамм AIR-2 82
ГЛАВА 6. Изучение свойств нитратредуказы галоалкалофильной денитрифицирующей бактерии halomonas campisalis z-7398-2 87
6.1. Влияние вольфрамата натрия на рост галоалкалофильных денитрифицирующих бактерий 87
6.2. Определение наличия молибденового кофактора 89
6.3. Очистка нитратредуктазы 90
6.4. Некоторые свойства нитратредуктазы 91
ГЛАВА 7: Стратегии осмоадаптации галоалкалофильных бактерий 99
7.1. Оценка внутриклеточных концентраций ионов Na+, К+ и СГ 99
7.2. Оценка возможности накопления органических осмолитов 102
7.3. Анализ аминокислотного состава оєшего клеточного белка 105
7.4. Влияние солей на активность ферментов галоалкалофилов 107
Заключение 111
Выводы 115
Список литературы 117
- Содовые озера как возможные наземные центры происхождения биоразнообразия
- Цикл азота и его особенности в содовых водоемах
- Краткая характеристика гиперсоленых экосистем
- Микроорганизмы, среды и условия культивирования
Введение к работе
Актуальность. Микробное сообщество содовых озер активно изучается с начала 1990-х годов. В нашей стране интерес к ним в значительной степени обусловлен гипотезой Г.А. Заварзина о том, что эпиконтинентальные содовые водоемы могут являться центром формирования наземной биоты в прошлом (Заварзин, 1993) и рассматриваться, таким образом, как реликтовые. Содовые озера представляют собой уникальную экосистему, в которой экстремально высокий рН часто сочетается с высокими концентрациями солей вплоть до насыщающих. Чтобы выжить в таких условиях, микроорганизмы должны располагать комплексом адаптационных механизмов. В настоящее время существует большое количество работ, посвященных изучению этих механизмов у разнообразных галофильных бактерий (Sadler et al, 1980; Vreeland et al, 1984; Vreeland, 1987; Galinski and Triiper, 1994; Canovas et al, 1996; Mojica et al, 1997; Ono et al, 1998; Valderrama et al, 1998; Roepler and Miiller, 2001). Однако галоалкалофильные представители содовых озер с этой точки зрения мало изучены. Активное исследование микробного сообщества содовых озер, начатое в лаборатории акад. Г.А. Заварзина (Zhilina and Zavarzin, 1994) и описание ряда новых микроорганизмов различных систематических групп (Заварзин и др., 1999) позволило провести сравнительное изучение механизмов адаптации этих бактерий к экстремальным условиям.
В настоящее время известны представители основных групп микроорганизмов, осуществляющих круговороты элементов в содовых водоемах. Среди них новые представители групп первичных и вторичных анаэробов, совместное действие которых приводит к полной деструкции органического вещества (Zavarzin and Zhilina, 2000). С циклом углерода напрямую связан цикл азота, являющийся важнейшим звеном в функционировании любой экосистемы.
Диссимиляциошюе восстановление нитрата (денитрификация) является хорошо изученным процессом в микробиологическом плане, однако первые алкалофильные денитрификаторы были описаны относительно недавно. Новейшие исследования показали, что к литотрофному восстановлению нитрата способны представители рода Thioalkalivibrio (Sorokin et al, 2002c; Sorokin et al, 2003b; Sorokin et al, 2004b), а в условиях органотрофного питания важнейшую роль играют представители рода Halomonas. Высокая численность галомонад в щелочных экосистемах подтверждается результатами молекулярно-биологических исследований (Duckworth et al, 1996), однако на данный момент идентифицировано лишь небольшое число облигатно алкалофильных представителей этого рода (Berendes et al, 1996, Mormile et al, 1999, Duckworth et al, 2000). Предполагается, что алкалофильные галомонады могут обладать уникальными
свойствами, отличающими их от нейтрофильных представителей этого рода (Jones and Grant, 2000). Таким образом, их изучение представляет определенный интерес.
Ключевым ферментом ассимиляции нитратов у эукариот, а также ассимиляции и диссимиляции нитратов у прокариот является нитратредуктаза, катализирующая восстановление нитрата в нитрит. Несмотря на разнообразие форм, универсальность фермента для про - и эукариот определяется наличием общего молибденового кофактора у всех выделенных до сих пор нитратредуктаз. Зависимость нитратредуктаз от молибдена была установлена еще 50 лет назад (Wolfe, 1954) и многократно подтверждалась дальнейшими исследованиями (Львов, 1989; Кильдибеков и др., 1996). Однако индийскими исследователями было показано, что у вольфрамустойчивого мутанта Nostoc musconun нитратредуктазная активность стимулировалась не молибденом, а ванадием (Singh Н et ai, 1993; Singh S. et ai, 1993). Таким образом, уникальность молибдена в биологическом восстановлении нитратов впервые была поставлена под сомнение.
В 1998 году в лаборатории проф. Н.П. Львова (ИНБИ им. А.Н. Баха РАН) из клеток ванадатредуцирующей бактерии Pseudomonas isachenkovii впервые были выделены две так называемые «альтернативные» нитратредуктазы, не содержащие молибден и молибденовый кофактор (Antipov et ai, 1998). У ферментов был обнаружен ряд необычных свойств (Антипов и др., 1999). На основании результатов этого исследования была сформулирована гипотеза, согласно которой безмолибденовые нитратредуктазы, возможно, синтезируются у организмов, населяющих экстремальные местообитания. Были обозначены возможные пути поиска микроорганизмов с новым типом нитратредуктаз (Антипов, 1999). В числе экстремальных факторов рассматривается и высокий рН окружающей среды. К началу нашей работы исследований, касающихся структуры и свойств нитратредуктаз алкалофилов, не проводилось. По предложению проф. Н.П. Львова было предпринято исследование нитратредуктаз облигатно алкалофильных штаммов денитрификаторов, выделенных из содовых озер Т.Н. Жилиной и Д.ІО. Сорокиным, что потребовало описания этих организмов и изучения особенностей их физиологии.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение особенностей физиологии и биохимии новых алкалофильных денитрифицирующих бактерий и исследование механизмов осмоадаптации у этих и описанных ранее галоалкалофильных представителей содовых озер.
В рамках основной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Описание новых штаммов алкалофильных гетеротрофных денитрифицирующих бактерий, выделенных из содовых озер;
Поиск безмолибденовых нитратредуктаз у новых штаммов галоалкалофильных денитрификаторов. Исследование свойств безмолибденовой нитратредуктазы штамма Z-7398-2 как модельного объекта;
Изучение механизмов адаптации галоалкалофильных бактерий к осмотическому стрессу на примере новых штаммов денитрификаторов и описанных ранее микроорганизмов:
а) определение внутриклеточных концентраций ионов натрия, калия и хлора;
б) идентификация внутриклеточных осмопротекторов;
в) анализ аминокислотного состава общего клеточного белка;
г) исследование способности ферментов метаболизма к функционированию в условиях
высоких концентраций солей.
Научная новизна и практическая значимость. Определен таксономический статус 11-ти штаммов алкалофильных денитрифицирующих бактерий из содовых озер. Штамм Z-7009, а также штаммы AIR-1 и AIR-2 отнесены к роду Halomonas в качестве новых видов. Остальные 8 штаммов из озера Магади отнесены к ранее известному виду Halomonas campisalis. У выбранного для изучения штамма Н. campisalis Z-7398-2 выделена и очищена до гомогенного состояния «альтернативная» нитратредуктаза, не содержащая молибден и молибденовый кофактор в активном центре.
Исследованы стратегии осмоадаптации галоалкалофильных бактерий. Обнаружено, что внутриклеточные концентрации ионов Na+, К+ и СГ у //. campisalis и Н. kenyensis недостаточны для уравновешивания внутреннего и внешнего осмотического давления, и баланс достигается благодаря накоплению органических осморегуляторов, как это характерно для нейтрофильных представителей этого рода. В клетках Tindallia magadiensis обнаружен бетаин. Напротив, у галоалкалофильного представителя порядка Halanaerobiales Natroniella acetigena осмолиты не обнаружены, а осмоадаптация осуществляется за счет накопления в клетке экстремально высоких концентраций солей. Установлено, что белки изучаемых галоалкалофильных бактерий обогащены остатками кислых аминокислот, как это характерно для галофильных белков. Показано, что дополнительным способом приспособления изученных микроорганизмов к осмотическому стрессу является возможность функционирования их ферментов в широком интервале концентраций солей.
Полученные результаты расширяют представления о физиолого-биохимическом разнообразии галоалкалофильных денитрифицирующих бактерий и их месте в круговороте азота в содовых водоемах. Новые штаммы могут быть рекомендованы в качестве потенциальных агентов для очистки щелочных нитратсодержащих сточных вод
различного происхождения. Исследованные галоалкалофильные микроорганизмы представляют интерес как источники эктоина, бетаина и новых солетолерантных ферментов.
Апробация работы. Отдельные материалы диссертации докладывались на III съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), XVI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004), 8-й и 9-й международных школах-конференциях «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004 и 2005), 2-й региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2004). На конкурсе научных работ Института биохимии им. А.Н. Баха РАН 2002 года работа заняла второе место. На 9-й Пущинской школе-конференции «Биология -наука XXI века» работа была отмечена как лучшее стендовое сообщение.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 6 тезисов, 1 статья принята к печати.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 139 страницах машинописного текста и включают 29 рисунков и 15 таблиц. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», «Выводы», «Заключение» и «Список литературы», включающий 279 наименований.
Благодарность. Автор выражает глубокую признательность д.б.н. Т.Н. Жилиной за предоставление культур и ценные советы по их описанию, к.б.н. А.Н. Антипову (ИНБИ РАН) за руководство биохимической частью работы, д.б.н. Д.Ю. Сорокину за предоставление штаммов AIR-1 и AIR-2, к.б.н. В.В. Кевбрину и к.б.н. Е.Н. Детковой за советы и помощь в освоении методик, к.х.н. А.Н. Шумскому (ИОХ РАН), к.х.н. Н.С. Иконникову (ИНЭОС РАН), к.б.н. Л.Е. Дулову, к.б.н. A.M. Лысенко, к.т.н. Т.В. Колгановой за помощь на отдельных этапах работы. Я особенно благодарна д.б.н. М.А. Пушевой за общее научное руководство и заведующему лабораторией реликтовых микробных сообществ ИНМИ им. С.Н. Виноградского РАН акад. Г.А. Заварзину за помощь в интерпретации результатов.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ 01-04-48553, 01-04-48217, грантов Президента РФ «Ведущие научные школы» НШ-1101.2003.4 и РИ-112/001/027, гранта Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (руководитель Г.А. Заварзин).
Содовые озера как возможные наземные центры происхождения биоразнообразия
Сообщества, продукционная часть которых представлена цианобактериями, являются одними из древнейших биоценозов на Земле. В соответствии с современными представлениями, цианобактерии представляют собой весьма консервативную группу, подвергавшуюся лишь небольшим изменениям на протяжении геологической летописи. При разнообразии в деталях циано-бактериальные сообщества сохраняли свою архитектуру и состав, претерпевая эволюцию, не выходящую за рамки изменчивости, приуроченной к местообитаниям. Ископаемые цианобактерии можно с большой уверенностью отнести к крупным современным таксонам. Так, один из основных представителей цианобактериального сообщества озер. Восточно-Африканского рифта Spirulina является аналогом ископаемой цианобактерии Heliconema. Это позволяет предположить, что современные биоценозы с доминированием цианобактерии представляют собой экстремальные выражения более обширных экосистем, развивавшихся 1.6-3 млрд. лет назад в биосферах протерозоя и архея до появления эукариот, то есть являются реликтовыми. Следовательно, изучая современные цианобактериальные сообщества можно составить представление о микробной биосфере протерозоя.
В настоящее время в качестве реликтовых рассматривается, по крайней мере, три биоценоза с доминированием циано-бактериального сообщества (Заварзин, 1993):
1. Термофильные сообщества гидротерм углекислотного состава, трансформирующие вулканические газы;
2. Бентосные сообщества прибрежных гиперсоленых лагун, образовавшиеся при концентрации хлоридно-натриевых вод океана, в которых развиваются циано-бактериальные маты - предшественники строматолитов;
3. Сообщества эп и континентальных водоемов содового типа.
Возникает вопрос о том, какое из перечисленных сообществ с наибольшей степенью вероятности соответствует понятию аналога древнего биоценоза. Для того чтобы сообщество соответствовало определению «реликтовое» и могло рассматриваться как исходное для эволюции биоты, оно должно отвечать, по крайней мере, трем основным требованиям:
1. Являться автономной системой (т. е. должно содержать основные функциональные группы организмов, необходимые для замкнутости биогеохимических циклов);
2. Включать представителей большинства филогенетических ветвей, чтобы не оказаться тупиковым;
3. Сообщество должно быть открытым, то есть при уменьшении экстремальных факторов должно переходить в «нормальное» наземное сообщество (прежде всего почв и континентальных вод)
Термофильные сообщества глубоководных гидротерм часто рассматриваются как аналоги наиболее древних микробных сообществ. Действительно, некоторые организмы в них живут за счет глубинных эксгаляций, однако в современных условиях такие сообщества зависят от привносимых конвекционным потоком веществ и, следовательно, не являются автономными. Кроме того, они слишком ограничены, чтобы служить центрами возникновения биоразнообразия.
При рассмотрении двух других биоценозов могут быть сформулированы две противоположные теории о направленности формирования биоразнообразия. Традиционное представление о морском происхождении биоты подтверждают строматолиты, образованные древними цианобактериальными сообществами (Крылов и Заварзин, 1983). Современные аналоги таких сообществ характерны для прибрежных морских лагун и горячих источников.
При изучении современных содовых озер, приуроченных к зонам повышенного вулканизма, Кемпе и Дегенс сформулировали гипотезу первичного «содового океана», рассчитав, что благодаря углекислотному выщелачиванию масса вод могла быть щелочной (Kempe and Degens, 1985). Существование такого океана не доказано, однако возможность преобладания подобных водоемов внутри древнего континента вполне реальна. В таком случае содовые озера, генезис которых не связан с океаном, в принципе
можно противопоставить морским условиям как внутриконтинентальные места обитания первичной биоты. Тогда можно предположить, что прокариотная жизнь вышла не из океана, как предполагается традиционно, а с континента. Об этом свидетельствует и большое разнообразие циапобактерий в современных содовых водоемах, в то время как для современного океана они несвойственны и представлены малым числом видов.
На основании изложенных выше фактов в 1993 г. Г.А. Заварзиным была сформулирована гипотеза о том, что экстремально алкалофильное микробное сообщество содовых озер может рассматриваться как реликтовое (Заварзин, 1993).
Цикл азота и его особенности в содовых водоемах
Цикл азота является одним из ключевых в природе. Будучи компонентом двух важнейших биологических макромолекул - белков и нуклеиновых кислот, азот является важнейшим элементом для существования жизни. В природе совершается сложный цикл взаимопревращений молекулярного азота и его разнообразных соединений, в составе которых он находится в различных степенях окисления от +5 до -3 (Рис. 4). Ключевую роль в этих процессах играют бактерии.
Функционирование цикла азота в содовых водоемах, так или иначе, было затронуто в предыдущих разделах, однако, представляется целесообразным еще раз остановиться на этом вопросе с целью систематизации и обобщения имеющихся данных, а также определения специфических особенностей этого цикла в условиях высоких значений рН.
В содовых водоемах фиксация атмосферного азота осуществляется в первую очередь алкалофильными цианобактериями. Связанный азот откладывается в их клетках в форме специфического запасного вещества цианофицина - высокомолекулярного полипептида, состоящего из остатков аспарагиновой кислоты и аргинина в молярном соотношении 1:1. Образование цианофицина, который, высвобождаясь из клетки, может служить потенциальным субстратом для аммонификации, является важной чертой содовых водоемов, где продуценты органического вещества представлены не водорослями, как во многих водных экосистемах, а цианобактериями.
В настоящее время данные по таксономической принадлежности азотфиксирующих цианобактерий содовых озер практически отсутствуют, однако, по аналогии с микробным сообществом соленых экосистем, можно предположить участие в этом процессе галоалкалофильных штаммов Microcoleus. Представители этого рода цианобактерий широко распространены в низкоминерализованных содовых озерах и являются эдификаторами циано-бактериальных матов в них. В высокоминерализованных содовых водоемах известна распространенность Spinilina spp., которые также могут отвечать за процесс фиксации азота. В литоральной зоне Большого Содового озера (Невада, США) за азотфиксацию ответственны Anabaena spp. (Oremland et al, 1988). К азотфиксации могут быть способны не только организмы-продуценты, но и представители других функциональных групп, например, как обнаружено недавно, анаэробный целлюлозолитический организм Clostridium alkalicellum (Zhilina et al, 2005).
После отмирания азотфиксирующих бактерий их биомасса становится доступна для разложения другими организмами. На первой стадии процесса действуют гидролитические организмы, обладающие пептолитической активностью и расщепляющие белки на мономеры. Образовавшиеся аминокислоты используются для анаболических нужд большой группой микроорганизмов, и в том числе - анаэробными аммонификаторами Tindallia и Natronincola (Kevbrin et al, 1998; Zhilina et al, 1998; Pikuta et al, 2003a), что приводит к накоплению аммония. Как видно из схемы, представленной на рисунке 4, цикл азота предусматривает несколько путей его дальнейшего использования. В первую очередь это ассимиляция в качестве источника азота микроорганизмами различных групп. Еще один путь заключается в анаэробной конденсации аммиака с нитритом (и реже с нитратом) в гидразин с последующим образованием газообразного азота. Этот процесс носит название анаэробного окисления аммиака (ANAMMOX) и обнаружен относительно недавно (Mulder et al, 1995; Jetten et al, 1998; Strous et al, 1999; Thamdrup and Dalsgaard, 2002; Jetten et al, 2003). Возможность его протекания в содовых водоемах не исключена, однако экспериментальные подтверждения этого к настоящему времени отсутствуют. Наконец, в аэробных условиях аммоний может утилизироваться нитрификаторами первой (Sorokin et al, 2000а; Sorokin et al, 2001c) и второй (Sorokin et al, 1998) фазы. В настоящее время достоверно доказано протекание нитрификации в низкоминерализованных содовых озерах.
Согласно расчетам, первая стадия процесса автотрофной нитрификации блокируется при концентрации NaCl свыше 100-150 г/л, а для второй стадии этот предел еще ниже. Это связано, вероятно, с биоэнергетическими последствиями необходимости справляться с воздействием высоких концентраций солей в условиях метаболизма с низким энергетическим выходом (Огеп, 1999; Огеп, 2001). Таким образом, в низкоминерализованных озерах результатом совместного действия азотфиксирующих и нитрифицирующих бактерий является накопление нитрата, как это характерно для всех неэкстремальных экосистем. Что касается высокоминерализованных содовых озер типа Магади, где концентрации солей могут достигать насыщающих, то источник нитрата в них остается неизвестным.
Краткая характеристика гиперсоленых экосистем
Гиперсоленые экосистемы природного происхождения могут быть обнаружены на всех континентах, однако чаще всего они приурочены к районам с теплым и сухим климатом. В таких условиях процессы испарения преобладают над поступлением влаги (дождевой или привносимой промывными течениями). Как правило, гиперсоленые экосистемы возникают при испарении морской воды (так называемые талассофильные экосистемы). В таком случае состав солей в них близок к составу морской воды. Однако существуют и типично континентальные - аталассофильные - экосистемы, такие, как, например, содовые озера и солончаки, происхождение которых не связано с морем. Механизм формирования различных соленых экосистем приведен на рисунке 3.
Вклад в развитие солености вносят разнообразные ионы, как катионного, так и анионного характера, причем их количество, соотношение и определяемый ими рН значителыю варьируют. Как указывалось ранее, ионный состав гиперсоленых водоемов напрямую зависит от геологических, климатических и топографических факторов. Разнообразие этих факторов объясняет существование высокоминерализованных экосистем различного типа. Так, в соленых озерах запада США, среди которых озеро Моно, уровень солености является средним, тогда как щелочность высока, и рН достигает 10 (Tierney, 1997). Напротив, в Великом Соленом озере и в Мертвом море, являющихся гиперсолеными, общее содержание солей превышает 20%, а значение рН близко к нейтральному (Oremland and King, 1989). При этом в Великом Соленом озере преобладают ионы Na+ (105.4 г/л) и СГ (181.0 г/л), в то время как в Мертвом море доминирующим является хлорид-ион, а содержание иона натрия невелико. В последнем случае также высоки концентрации двухвалентных катионов - кальция и магния. В случае водоемов, в которых минерализация сопровождается высокой карбонатной щелочностью, Са2+ и Mg2+ выпадают в осадок, как это наблюдается в содовых озерах (Ollivier et al., 1994). В морских солеварнях - гиперсоленых экосистемах антропогенного происхождения, где испаряющаяся морская вода последовательно перекачивается через непрерывный ряд водоемов с увеличением солености - также происходит осаждение кальция виде карбонатов или сульфатов, сопровождающееся увеличением концентрации NaCl. Содержание сульфата, являющегося важнейшим акцептором электронов в соленых экосистемах, также значительно варьирует. Среднее содержание этого аниона в Мертвом море составляет 4мМ, в северной части Великого Соленого озера - 281 мМ (Javor, 1989). Низкая концентрация сульфата в Мертвом море может быть связана с его осаждением в виде кальциевой соли, что невозможно в Великом Соленом озере, где концентрация Са2+ очень мала. Ионный состав различных типов гиперсоленых экосистем представлен в таблице 3.
Организмы, растущие при повышенных концентрациях солей, называются галофилами. Как правило, галофилия рассматривается как потребность в большом количестве солей для оптимального роста, в то время как термин «галотолерантность» качественно и количественно описывает способность расти при концентрации соли, превышающей оптимальную (Zahran, 1997). Организмы, толерантные к солям и другим растворенным веществам, широко распространены среди бактерий, грибов, дрожжей, водорослей и простейших, а также среди вирусов, характерных для этих организмов. В зависимости от пределов и оптимумов роста выделяют несколько типов таких организмов. Следует отметить, что у многих из них отношение к солям варьирует в зависимости от температуры и состава среды культивирования. Температура, как правило, оказывает влияние на нижние пределы роста микроорганизма (Ventosa et al, 1998b). Например, Salinivibrio costicola при 30C растет в интервале минерализации от 0.5 до 4 М NaCl, а при 20С рост возможен уже при 0.2 М NaCl (Кашнер, 1981). Таким образом, определяя степень галофилии микроорганизма, следует указывать условия его культивирования. Классификация галофильных микроорганизмов представлена в таблице 4.
Сообщество умеренно соленых экосистем может быть представлено как прокариотами, так и эукариотами, однако с возрастанием минерализации биоразнообразие и численность эукариот падают. При экстремальных значениях этого стрессового фактора развивается исключительно прокариотное сообщество.
Метаболическое и таксономическое разнообразие галофильных прокариот крайне велико. Они обнаружены среди оксигенных и аноксигенных фотосинтетиков, денитрификаторов, сульфатредукторов с полным и неполным окислением, гомоацетогенов, водородных, метилотрофных и ацетокластических метаногенов, различных аэробных хемоавтотрофов (Жилина, 1983; Grant and Ross, 1986; Oren, 1986; Zhilina, 1986; Жилина и Заварзин, 1987; Javor, 1989; Жилина и Заварзин, 1990; Жилина и др., 1991а и б; Заварзин и др., 1993; Кевбрин и др., 1994; Ollivier et al, 1994; Ventosa et al, 1998a). Интересным является тот факт, что для каждого метаболического процесса имеются строго определенные пределы уровня солености, при которых процесс может протекать. Например, при концентрации NaCI свыше 100-150 г/л блокируются процессы автотрофной нитрификации, ацетокластического и гидрогенотрофного метаногенеза, ацетокластической сульфатредукции. Напротив, процессы оксигенного и аноксигенного фотосинтеза, аэробного дыхания и денитрификации, при которых изменение свободной энергии выше, могут протекать при концентрации NaCI, близкой к насыщающей.
Микроорганизмы, среды и условия культивирования
Присутствие солей во внутриклеточном пространстве требует адаптации ферментативных систем. Многие ферменты галофилов толерантны к солям или даже требуют их наличия для сохранения высокой активности. Известно также, что соли различной природы могут оказывать разное влияние на активность ферментов. Предполагается, что поведение ферментов по отношению к солям до определенной степени может быть прогнозировано на основании данных о внутриклеточном ионном составе и, как следствие, - аминокислотном составе общего клеточного белка (Oren and Мапа, 2002). Объектами данного исследования являлись ферменты метаболизма исследованных галоалкалофилов: Н. campisalis, Т. magadiensis и N. acetigena. У галомонады в качестве объектов изучения было выбрано несколько анаболических ферментов, а у Г. magadiensis и N. acetigena интерес представляла СО-дегидрогеназа -ключевой фермент метаболизма ацетогенных бактерий, а также гидрогеназа, высокая активность которой была продемонстрирована ранее у Т. magadiensis (Деткова, 2003).
Влияние солей на активности лактатдегидрогеназы (далее лактат-ДГ), глутаматдегидрогеназы (глутамат-ДГ) и одного из ферментов гликолиза глицеральдегид 107 3-фосфат дегидрогеназы (глицеральдегид-3-Ф-ДГ) Н. campisalis представлены на рисунке NaHC03, М
Лактат-ДГ Н. campisalis была максимально активна в присутствии 0.3 М NaCl, 0.24 М К.С1 и 0.4 М NaHCCb. При этом активность возрастала на 10-20 %. Однако, дальнейшее увеличение концентраций солей приводило к ингибированию фермента. Глутамат-ДГ была максимально активна в отсутствие КС1, однако остаточная активность сохранялась при 2.4 М (около 10% от максимальной). Глутамат-ДГ оказалась наиболее толерантной из трех изученных ферментов по отношению к КС1. Небольшие концентрации NaCl (0.3-0.75 М) оказывали стимулирующее действие на фермент, а дальнейшие увеличение концентрации NaCl приводило к снижению активности. NaHCCb вызывал 40% увеличение активности при концентрации 0.65 М, однако далее активность снижалась. В случае глицеральдегид-3-Ф-ДГ влияние трех различных солей было сходным. Фермент был максимально активен в отсутствие солей, а при содержании в реакционной смеси около 1 М NaCl, КС1 или NaHCCb активность падала приблизительно на 40 %. 2.2 М NaCl и 1.8 М КС1 полностью подавляли активность.
СО-дегидрогеназа и гидрогеназа Т. magadiensis угнетались высокими концентрациями NaCl и проявляли максимальную активность в отсутствие соли (Рис. 29а). Несмотря на ингибирующее действие соли, ферменты сохраняли около 40% от максимального уровня активности при концентрации NaCl, превышающей 4.0 М. Напротив, оба фермента оказались толерантны к КС1: активности слабо зависели от его присутствия в интервале концентраций 0-2.2 М (Рис. 296). Активность СО-дегидрогеназы была максимальна в присутствии 0.25 М NaHCC 3 и снижалась при дальнейшем увеличении концентрации бикарбоната в реакционной смеси. Уровень активности гидрогеназы Т. magadiensis оставался примерно постоянным в интервале концентраций NaHC03 0-1.2 М (Рис. 29в)
Известно, что в большинстве случаев внутриклеточные ферменты бактерий, использующих стратегию «совместимые осморегуляторы», ингибируются высокими концентрациями солей. Несмотря на то, что изученные ферменты Н. campisalis проявляют определенную устойчивость, сохраняя небольшую активность в присутствии около 2 М NaCl и 1.5 М КС1, их максимальная активность проявляется либо в отсутствие солей, либо при их низких концентрациях. Концентрации, оказывающие стимулирующий эффект, близки к тем, которые обнаруживаются во внутриклеточном пространстве бактерии. У Т. magadiensis внутриклеточные концентрации солей оказались выше, чем у Н. campisalis, что объясняет более высокую солетолерантность ферментов этой бактерии.
СО-дегидрогеназа экстремального галоалкалофила N. acetigena оказалась активна в пределах 0-4.1 М NaCl, причем (в отличие от аналогичного фермента Т. magadiensis) в отсутствие соли и при ее концентрации 3.5 М активность была одинаковой. Максимум 109 наблюдался при 0.7 М NaCl. Активность сохранялась во всем исследованном диапазоне концентраций NaHCOj с широким максимумом при 0 - 0.7 М. Высокая солетолераитность этого фермента хорошо согласуется с обнаруженными высокими концентрациями солей в клетках N. acetigena.
В целом, независимо от интервалов активности, все исследованные ферменты галоалкалофилов до некоторой степени адаптированы к присутствию солей, что может представлять собой дополнительный механизм приспособления организма к высокосоленой среде обитания. На основании проведенного исследования можно заключить, что изученные галоалкалофилы независимо от таксономической принадлежности располагают комплексом адаптационных механизмов, способствующих их выживанию в условиях гиперсоленых экосистем.
