Физико-химические свойства клеточной поверхности бактерий рода Azospirillum: цитохимический и электрооптический анализ Богатырев, Владимир Александрович

Введение к работе

Актуальность темы. В последние годы отмечается растущий интерес к сво-бодноживущим почвенным микроорганизмам, ассоциированным с корневой системой растений, в частности, к бактериям рода Azospiriflum. Наряду с представителями некоторых иных родов (цианобактериями, азотобактером, клостридиями, псевдомонадами и др.) эти микробы способны осуществлять ассоциативную (несимбиотическую) фиксацию атмосферного азота и снабжать растения важными для них метаболитами (например, фитогормонамн). Однако при этом не образуется выраженных морфологических атрибутов типа растительных клубеньков, характерных для бобово-ризобиального симбиоза. Поэтому особое значение приобретает поиск информативных физиолого-биохимических тестов и соответствующих методов их реализации, позволяющих характеризовать способность бактерий к установлению ассоциативных взаимодействий с растениями.

Очевидно, что на ключевых этапах контактных взаимодействий ассоциативных микроорганизмов с растениями большое значение имеет структура клеточной поверхности обоих партнеров. Б цело;.! рял« рабо і, посушенных ризобиальному симбиозу и агробактериальному патогенезу, была показана существенная ролі, бактериальных липополисахаридов, экзополисахаридов, белков-адгезинов и фибрилл на этапах узнавания и инфицирования микроорганизмами растения-хозяина (Matthysse et al., 1978, Leigt et al., 1985, Smit et al., 1989). Однако для азоспирилл, в отличие от ризобий и патогенных агробактерий, объем фактических данных о структуре, физико-химических и биохимических свойствах клеточной поверхности, а также о биологической роли различных ее компонентов весьма ограничен. Это, как мы полагаем, обусловлено, в частности, недостаточной проработанностью оптимальных методов исследования в их приложении к изучению тонких структурных особенностей внешней мембраны клеток азоспирилл. К числу таких методов мы относим методы цитохимического (Bullock, Petrusz, 1983, 1985) и электрооптического (Толстой и др., 1967, Стонлов и др., 1977, Мирошников и др., 1986) анализа клеток.

Маркеры для цитохимического анализа представляют собой конъюгаты биоспецифических макромолекул (зондов) с различными метками: ферментной, ра-дноизотопной, флуоресцентной . . . Очевидно, что универсальной метки для всего многообразия вариантов цитохимического анализа не существует. Поэтому, наряду с широко известными методиками, например, с применением иммунофермент-ного и радиоизотопного анализа, представляют интерес новые подходы, основанные, в частности, на использовании в качестве меток частиц коллоидного золота (КЗ).

Известные из литературы преимущества КЗ по сравнению с отмеченными выше метками сводятся к: а) возможности использования как в микроскопии, так и в твердофазном био- и иммуноанализе, б) более простой методике применения, в) высокой чувствительности, сопоставимой с чувствительностью радиоизотопной метки. Однако до начала исследований, представленных в данной диссертации, был недостаточно разработан ряд принципиальных вопросов, связанных с получением биоспецифических маркеров - конъюгатов КЗ с заданными свойствами, контролем качества получаемых препаратов и их практическим использованием в твердофазном био- и иммуноанализе бактериальных клеток.

Основой метода электрооптического анализа коллоидных систем является зависимость их оптических свойств от ориентации частиц под действием электрического поля. Анализ современной литературы показывает хорошие потенциальные возможности данного метода в его приложении к исследованию биологических

4 систем. В том числе это касается высокой чувствительности электрооптических характеристик суспензий клеток к изменениям электрофизических свойств клеточной поверхности, связанных с особенностями клеточного метаболизма (Фомченков, 1982), специфических и неспецифических взаимодействий клеточной поверхности с разнообразными высоко- и низкомолекулярными веществами (Сирота, 1979, Khlebtsov et ah, 1991) и т.д.

Однако оптические модели, использовавшиеся до недавнего времени для интерпретации результатов электрооптических измерений, не соответствовали реальным бактериальным и дрожжевым взвесям. Развитая в последние годы теория ориентационных оптических эффектов (Хлебцов, 1988, Khlebtsov et al., 1991) применительно к бактериальным суспензиям требовала экспериментальной проверки. Кроме того, дискуссионным оставался вопрос о природе механизмов ориентации клеток в инфранизкочастотных электрических полях. Экспериментальные исследования указанных двух проблем вошли в круг задач данной диссертации. При этом была также апробирована методика определения геометрических, оптических и электрофизических параметров клеток по данным спектральных, релаксационных и полевых измерений.

Цель работы. Основной целью данной работы было развитие методологии иммуноцитохимического и электрооптического анализа клеточных популяций в их приложении к оценке ряда молекулярно-генетических и биофизических характеристик почвенных ассоциативных бактерий рода Azospirillum. При этом решались следующие конкретные задачи:

1. Разработать эффективные методы синтеза коллоидного золота и его конъюгации с различными зондами - антителами, протеином А, лектинами, целлюла-зой и др., обеспечивающие получение биомаркеров с заданным размером частиц золота в интервале 1-50 нм.

2. Провести сравнение экспериментальных спектров ослабления золей золота и суспензий биомаркеров с результатами численных расчетов с применением современных оптических теорий.

3. Изучить возможность применения метода твердофазного иммуноанализа с биоспецифическими маркерами - конъюгатами коллоидного золота для изучения интактных бактериальных клеток.

4. Методом дот-блот анализа оценить эффективность взаимодействия интактных клеток азоспирилл с антителами, специфичными к О-антигенам различных штаммов бактерий данного рода.

5. Оценить влияние R - S диссоциации A. brasilense Sp 7 на характеристики поверхностных структур бактерий, определяемые методами иммуноцитохимического анализа.

6. Провести экспериментальное исследование электрооптических характеристик бактериальных суспензий в их сопоставлении с результатами усовершенствованной теории.

7. Провести изучение электрофизических свойств клеточной поверхности бактерий рода Azospirillum.

Научная новизна работы заключается в том, что в ней предложен новый способ синтеза КЗ восстановлением золотохлористоводородной кислоты (ЗХВК) (патент РФ N2013374), обеспечивающий получение стабильных маркеров в области относительно малых диаметров частиц КЗ (1-5нм). Впервые проведено сравнение экспериментальных спектров ослабления света золями золота и суспензиями конъюгатов с результатами расчетов, выполненных по современным версиям тео-

5 рий поглощения и рассеяния света малыми частицами с учетом их реальных геометрических и оптических особенностей.

Предложена оригинальная процедура твердофазного иммуноанализа целых клеток с использованием их прямого и непрямого мечения иммуноцитохимиче-скими маркерами, содержащими частицы КЗ (названная нами cell-gold im-munoblotting). С ее использованием впервые для азоспирилл показано, что при R -S диссоциации штамма A. brasiiense Sp 7, связанной с элиминацией плазмиды 115 МДа, происходят изменения свойств клеточной поверхности, которые могут свидетельствовать об утрате целлюлозоподобных структур на поверхности клеток-диссоциантов.

Впервые проведено сравнение электрооптических свойств клеточных популяций (ориентационный турбндиметрический эффект и дихроизм), полученных экспериментально, с результатами соответствующих теоретических расчетов. Экспериментально показана возможность решения задачи одновременного определения геометрических оптических и электрофизических параметров клеток по их ориен-тационным спекірам ослабления сааіа. Полученм новые данные по дискуссионному вопросу о природе дипольного момента микробных хлгтк. саидстслт.ет-вующие об отсутствии их полной переориентации даже в поле инфрашпкочастог-ных электрических импульсов. Обнаружена корреляция между рН-зависи.мым изменением низкочастотного электрооптического эффекта и нзоэлектрической точкой клеток.

Практическая значимость работы. Разработанный оригинальный способ синтеза золей золота позволил оптимизировать технологию получения конъюга-тов золотой метки с биоспецифическими зондами (иммуноглобулинами, лектина-ми, ферментами и т.п.) при любом заданном диаметре частиц из интервала 1-50нм. Получены калибровочные кривые для оперативного спектрофотометрического контроля процесса синтеза КЗ маркеров. На основе этих разработок создан Лабораторный технологический регламент для получения биомаркеров. Наработаны их опытные образцы и проведены лабораторные испытания в тест-системах с использованием иммуноглобулиновых, лектиновых и ферментных зондов. Составлен каталог препаратов, включающий 121 наименование биомаркеров, используемых в нескольких лабораториях ИБФРМ РАН. Часть образцов передана другим организациям по их заказам (включая представителей ближнего зарубежья) для проведения работ, связанных с решением широкого круга научных и прикладных задач в области физико-химической биологии, биотехнологии и медицины.

Результаты экспериментальной проверки теории ориентации иных оптических эффектов включены в разработку специализированного прибора - электрооптического спектрогурбидиметра, выполняемую в рамках международного научно-технического проекта "ЕОСТ" (совместно с Институтом физической химии Болгарской академии наук), финансируемого Министерством науки РФ.

На защиту выносятся следующие основные положения:

8. Усовершенствование технологии синтеза золей золота и его конъюгации с биомакромолекулами, а также методики контроля морфометрических и биоспецифических свойств получаемых препаратов.

9. Разработка и апробация на примере почвенных микроорганизмов методики твердофазного иммуноанализа целых клеток с использованием их прямого и непрямого мечения иммуноцитохимическими маркерами, содержащими частицы КЗ (cell-gold immunoblotting).

3. Установление взаимосвязи изменений некоторых физико-химических свойств клеточной поверхности бактерий A. brasilense Sp 7 в процессе R-S диссоциации, сопровождаемой элиминацией плазмиды 115 МДа, с возможной утратой наружных целлюлозоподобных глюкановых структур клеток.

4. Результаты экспериментального изучения: 1) концентрационной, спектральной и полевой зависимостей электрооптического эффекта бактериальных и дрожжевых суспензий; 2) типов движения бактериальных клеток в полях инфра-низких частот; 3) зависимости фазы и амплитуды динамической модуляции от электроповерхностных свойств клеток (изоэлектрическая точка, поверхностная поляризуемость) и физико-химических условий опытов (рН, ионная сила).

Работа выполнена в лаборатории физической химии клеточных структур (ЛФХКС) ИБФРМ РАН по планам НИР в рамках следующих тем: "Изучение молекулярно-генетических механизмов узнавания, контакта и обмена метаболитами азоспирилл и культурных злаков" (научный руководитель д.б.н., профессор Игнатов В.В., № гос. регистрации 01860024516); "Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений" (научный руководитель к.ф.-м.н., зав. лаб. Щеголев С.Ю., № гос. регистрации 01890017743); "Разработать методологию и измерительные устройства на основе спектротурби-диметрии и электрооптики для исследований в области иммунологии, микробиологии и биотехнологии" (научный руководитель к.ф.-м.н., вед.н.с. Хлебцов Н.Г., № гос. регистрации 01860027453).

Частично данная работа получила финансовую поддержку от Министерства науки и технической политики РФ в рамках программы "Средства обеспечения исследований по физико-химической биологии и биотехнологии" (Распоряжения № 1508ф от 11.05.93г. и последующие), Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта 94-03-09286) и Международного научного фонда (фонда Сороса) (номер гранта RNR000).

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на: Всесоюзной конференции "Биофизика микробных популяций" - Красноярск, 1987; Всесоюзной школе "Электронная микроскопия в молекулярной биологии" - Звенигород, 1990; 1-^я всесоюзной конференции "Теория и практика элекгрооптических исследований коллоидных систем" - Велигож, 1990; XX Meeting of the FEBS - Budapest (Hungary), 1990; V International Symposium on Nitrogen fixation with non-legumes - Florense (Italy), 1990; XII International Lectin Conference - Devis (USA), 1990; VI International Symposium "Colloid and Molecular Electrooptics" - Vama (Bulgaria), 1991; VIII Eastern European Symposium on Biological Nitrogen fixation - Saratov (Russia), 1992; International Symposium on Biomedical Optics EUROPE'93 - Budapest (Hungary), 1993; I European Nitrogen Fixation Conference - Szeged (Hungary), 1994; I International Conference on Polysaccharide Engineering - Trondheim (Norway), 1994; NATO Advanced Research Workshop on Azos-pirillum and Related Microorganisms - Sarvar (Hungary), 1994; International Workshop on Associative Interactions of Nitrogen-Fixing Bacteria with Plants - Saratov (Russia), 1995; а также на отчетных научных конференциях ИБФРМ РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 печатных работ (включая одно изобретение) в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав (включающих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложение полученных результатов и их обсуждение), заключения, списка исполь-

7 юванных литературных источников и приложения. Работа изложена на 201 стра-тис, иллюстрирована 40 рисунками и включает 6 таблиц. Список использовании литературных источников включает 168 наименований.