Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Род Agrobacterium/Rhizobium, физиологические и генетические свойства, таксономическое положение, разнообразие, основные представители–патогены растений 12
1.1.1. Систематическое положение Agrobacterium 12
1.1.2. Таксономическая внутриродовая структура Agrobacterium 15
1.1.3. Физиологические признаки Agrobacterium 17
1.1.4. Геном штаммов Agrobacterium 20
1.1.5. Вирулентность и распространение бактерий рода Agrobacterium 22
1.2. Этиология и экология заболеваний, вызываемых Agrobacterium 24
1.2.1. Плодовые и декоративные растения 24
1.2.2. Овощные культуры 25
1.2.3. Другие инфекционные и неинфекционные заболевания, сходные с бородатостью корней по симптомам 26
1.2.4. Молекулярный механизм трансформации растений и использование бактерий рода Agrobacterium в генной инженерии 27
1.2.5. Эволюция бактерий рода Agrobacterium с точки зрения возникновения новых патогенов 29
1.3. Растения–хозяева Agrobacterium spp.: огурец, розоцветные (роза и плодовые культуры, наиболее поражаемые патогенами) – ботаническая характеристика, физиология и особенности агротехники в гидропонной тепличной культуре 32
1.3.1. Огурец обыкновенный (лат. Cucumis sativus) 32
1.3.2. Розовые (Розоцветные) (лат. Rosaceae) 36
1.4. Пестициды с бактерицидным действием и средства биологической защиты растений от бактериозов 38
1.4.1. Химические бактерициды 42
1.4.2. Биологические препараты с бактерицидным действием 48
1.5. Методы диагностики болезней, вызываемых Agrobacterium 50
1.5.1. Фенотипические методы диагностики 51
1.5.2. Методы ДНК фингерпринтинга 52
1.5.3. Диагностика на основе полифазной систематики бактерий 55
2. Материалы и методы 57
2.1. Оценка распространенности заболеваний, вызванных Agrobacterium 57
2.2.Использованные штаммы фитопатогенных бактерий и бактерий–антагонистов. 58
2.2.1. Штаммы Agrobacterium 58
2.2.2. Коллекция штаммов фитопатогенных бактерий других видов 62
2.2.3. Коллекция штаммов бактерий–антагонистов 62
2.3. Методы определения фитопатогенов рода Agrobacterium в растениях, семенах, почве и воде 65
2.3.1. Техника изоляции и питательные среды 65
2.3.2. Оценка фенотипических признаков Agrobacterium 70
2.3.3. Основные дифференцирующие биохимические характеристики видов Agrobacterium 75
2.4. Методы определения патогенности Agrobacterium, инокуляции растений– хозяев, оценки развития болезни 77
2.5. Методы оценки эффективности средств химической и биологической защиты против фитопатогенов растений и Agrobacterium in vitro 78
2.5.1. Анализ бактерицидной активности бактерий–антагонистов 79
2.5.2. Анализ бактерицидной активности пестицидов и антибиотиков 80
2.6. Пробоподготовка для ПЦР и БИО–ПЦР диагностики возбудителя бородатости корней огурца и томата в гидропонной культуре, в воде и семенах растений 80
2.7. Молекулярно–генетические методы идентификации и оценки разнообразия популяции патогена 80
3. Результаты 87
3.1. Распространение фитопатогенных бактерий рода Agrobacterium в открытом и защищенном грунте в России 87
3.1.1. Распространение фитопатогенных бактерий рода Agrobacterium в открытом грунте в России 87
3.1.2. Встречаемость других бактерий в пораженных растениях 88
3.1.3 Распространение фитопатогенных бактерий рода Agrobacterium в защищенном грунте в России 94
3.2. Физиологическое и генетическое разнообразие возбудителей корончатого галла и бородатости корней в России 100
3.2.1. Изучение физиолого–биохимических особенностей Argobacterium 100
3.2.2. Изучение вирулентности и патогенности штаммов Agrobacterium 104
3.3.1. Анализ генетического разнообразия методом ПЦР фингерпринтинга 107
3.3.2.Изучение генетического разнообразия исследуемой коллекции Agrobacterium с помощью метода мультилокусного генотипирования (MLST) 112
3.4. Разработка метода ПЦР диагностики возбудителя бородатости корней огурца и томата в гидропонной культуре 127
3.4.1. Идентификация возбудителей бактериозов методом ПЦР 127
3.4.2. Пробоподготовка для ПЦР и БИО–ПЦР диагностики возбудителя бородатости корней огурца и томата в гидропонной культуре, в воде и семенах растений 129
3.5. Изучение бактерицидной активности бактерий–антагонистов, антибиотиков и химических пестицидов 131
3.6. Оценка эффективности средств химической и биологической защиты растений от возбудителей корончатого галла и бородатости корней и других бактериозов в производственных условиях 144
Заключение 150
Список литературы 153
- Огурец обыкновенный (лат. Cucumis sativus)
- Техника изоляции и питательные среды
- Распространение фитопатогенных бактерий рода Agrobacterium в защищенном грунте в России
- Оценка эффективности средств химической и биологической защиты растений от возбудителей корончатого галла и бородатости корней и других бактериозов в производственных условиях
Огурец обыкновенный (лат. Cucumis sativus)
Огурец посевной (лат. Cucumis sativus) – однолетнее травянистое растение, раздельнополое, овощная культура. Полиморфный вид.
Классификация: Царство – растения (Plantae), Отдел – цветковые (Angiosperms), класс – двудольные (Eudicots), порядок – тыквоцветные (Cucurbitales), семейство – тыквенные (Cucurbitaceae), род – огурец (Cucumis), вид – огурец обыкновенный (Анненков, 1878).
Культурные виды семейства Cucurbitaceae произрастают по всему миру. Семейство включает 118 родов и 825 видов, преимущественно теплолюбивых видов однолетних лиан (Jeffrey, 1990). В состав семейства Cucurbitaceae входят 4 главных культурных вида – арбуз (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. & Nakai), огурец (Cucumis sativus L.), дыня (Cucumis melo L.) и тыква (Cucurbita spp.). Род Cucumis (Огурец) включает 52 вида, из которых C. sativus и C. melo – наиболее важные с экономической точки зрения (Ghebretinsae et al., 2007).
Огурец культурный происходит из Азии, наиболее близкий дикорастущий родственник – Cucumis sativus var. hardwickii (Royle) Alef., растет в предгорьях Непала и Сев. Индии (Whitaker and Davis, 1962; Harlan, 1975). Огурец введен в культуру более 5000 лет назад, появление его в Иране документировано 3000 г. до н.э., в Италии и Египте – 1500 г. до н.э., а в Китае – началом нашей эры (Robinson and Decker–Walters, 1997, Leppik, 1966; Sitterly, 1973). Ботаническое описание
Стебель: до 1,5 м длиной, округлый, округло-граненый или граненый, стелющийся, ветвящийся, с простыми усиками, в разной степени опушен. Кустовые сорта со стеблем длиной 20-30 см. Листья очередные, пяти лопастные (лопасти острые), реже цельные (овальные). По длине различаются от 10-12 см до более 15 см. Корень стержневой и разветвленный. Огурец - перекрестноопыляющееся, в большинстве случаев однодомное раздельнополое растение, на котором образуются мужские и женские цветки. У партенокарпических форм плоды образуются без опыления цветков. Семена белые, удлиненно-эллиптические. Масса 1000 семян 25-30 г. (http://www.agroatlas.ra). Плод огурцов - ложная ягода длиной от 5 до 70 см. Имеет от 3 до 5 семенных камер.
Физиологические особенности
Всходы огурцов, в зависимости от погодных условий, появляются через 3-Ю дней после сева. Биологическая (семенная) спелость плодов наступает через 40-69 дней после цветения.
Требовательность к теплу - высокая, семена начинают прорастать при температуре 12-15 С. Понижение температуры ниже 15 С отрицательно влияет на поглощение корнями воды и питательных веществ из почвенного раствора, нарушает нормальную жизнедеятельность листьев взрослых растений. При снижении температуры почвы до 8-9 С функции корневой системы растения заторможены, и корни часто повреждаются фитопатогенными микроорганизмами.
Оптимальная температура для огурцов 25-30 С в дневное время и 17-18 С ночью. До наступления хозяйственной спелости огурцов требуется сумма средних суточных активных (15 С) температур воздуха 800-1000 С, для вызревания семенников - не менее 1500 С.
Огурцы очень требовательны к влажности почвы и воздуха. Кроме того, корневая система огурцов имеет низкую сосущую силу (1,5-2 атмосферы) и располагается в основном в верхнем слое почвы (на глубине до 20 см), где запасы влаги неустойчивы. Наиболее благоприятная относительная влажность воздуха для огурцов 80-90 % (в тепличных условиях до 100%), почвы 70-80 % от наименьшей влагоемкости (НВ). Минимальная освещенность, при которой возможно цветение и плодоношение огурцов - 2400 лк. Оптимальная освещенность 20 тыс. лк.
Растения отличаются от других овощных культур высокой требовательностью к условиям почвенного питания. Оптимальная реакция почвенного раствора близка к 6,0-6,5 рН, а допустимая не выходит за пределы 4,0-7,6 рН. Наибольшее число женских цветков образуется при размещении огурцов на почве, реакция которой близка к нейтральной (рН 5,9-6,1). Огурцы имеют низкую солеустойчивость по сравнению с другими овощными культурами. В состав плодов входят многие полезные вещества (Таблица 6).
Генетические особенности
ДНК огурца посевного насчитывает 367 миллионов пар оснований, но только 243,5 млн. п.о. были собраны в геном. Общее число предсказанных генов составило 26682, со средней длиной кодирующей последовательности 1046 п.о., и в среднем 4,39 экзона на ген. Около 81% всех генов имели гомологи в базе белков TrEMBL, около 66% были классифицированы по базе данных InterPro. Всего 82% всех генов были классифицированы. Были определены также 292 фрагмента, кодирующие rRNA, 699 – tRNA, 238 – малые ядерные RNA, 192 малые ядерные RNA, и 171 – гены miRNA (Huang et al. 2009).
Образцы генетического материала из 115 современных линий были изучены при помощи одно нуклеотидных полиморфизмов (SNP). На базе присутствия тех или иных полиморфизмов, делеций, вставок и других генетических особенностей выделили три главные группы огурцов – евразийские, восточноазиатские и происходящие из китайского региона Сишуанбаньна (Zhu et al., 2016).
Болезни и вредители
К основным вредителям относятся трипс оранжерейный (Heliothrips haemorrhoidalis Bouch.); паутинный клещ рода Tetranychus; полевые слизни; гусеницы совки–гаммы (Autographa gamma) и др., повреждающие листья, плоды и семена. К самым распространенным болезням относятся: мучнистая роса: [Golovinomyces cichoracearum (Erysiphe cichoracearum), Podosphaera xanthii (Sphaerotheca fuliginea)], ложная мучнистая роса (Pseudoperonospora cubensis), парша (Cladosporium cucumerinum), листовая пятнистость (Corynespora cassiicola), угловатая листовая пятнистость (Pseudomonas lachrymans), фузариозное увядание (Fusarium oxysporum), бактериальная мягкая гниль (Pectobacterium spp., Dickeya spp., Pseudomonas marginalis), бактериальные увядания (Erwinia spp., Serratia marcescens, Ralstonia solanacearum, Dickeya spp., Pectobacterium carotovorum sbsp. brasiliensis). В отдельные годы потери урожая от заболеваний могут составить 50– 70%. Наиболее экономически эффективным способом борьбы с болезнями является производство гибридов огурца с несколькими типами устойчивости к заболеваниям и применение комплекса биологических препаратов, колонизирующих субстрат и подавляющих патогена в ризосфере и в растении.
Техника изоляции и питательные среды
Выделение Agrobacterium из растений
Штаммы Agrobacterium spp. могут быть изолированы из сока поражённых растений, из корней, галлов. Проще всего выделять патогена из молодых, активно растущих галлов или корней белого, или кремового цвета.
Первый метод выделения: корончатый галл (корень) промывают проточной водой, удаляют потемневшую, некротизированная ткань, затем стерилизуют 1–3 минуты в 1% растворе гипохлорида. Ткани неколько раз промывают в стерильной воде. Выборки измельчают и помещают в пробирку со стерильной водой или буфером, затем встряхивают на вортексе и настаивают 10-30 мин., что позволяет бактериям диффундировать в жидкость.
100 мкл полученной суспензии распределяют шпателем на неселективной и селективной агаризованной среде в чашках Петри, и затем инкубируют при температуре 27–29 С в течении 3–4 дней. После инкубации проводят анализ морфологических признаков полученных колоний с учетом их морфологии на специфической среде, и в сравнении с колониями типовой культуры бактерий.
Морфология колоний и пигментация Agrobacterium варьируется. Некоторые штаммы, изолированные из ореха пекана (Carya illinoinensis) образуют на селективной среде синеваный пигмент, в то время как изоляты из винограда (Vitis vinifera) образуют красноватый, диффузный пигмент (Bouzar, 1994).
При выделении Agrobacterium из старых поражений, целевой организм выделяется совместно с большим числом морфологически и физиологически сходных бактерий, которые могут со временем при хранении и культивировании вытеснить целевой организм.
Для очистки бактериальной культуры от сопустствующих бактерий, с селективной среды забирается единичная колония, суспензируется в стерильной дистиллированной воде или буфере и наносится штрихом на PDA+CaCO3. Единичные колонии снова отбираются, суспензируются в буфере или стерильной воде и штрихом рассеваются. Повторяется это действие пока колонии на чашке не станут однородными. На PDA+CaCO3 можно определить выпуклость, глянцевость, округлость, край и цвет колоний Agrobacterium spp.(по Schaad et al., 2001, с изменениями).
Второй метод выделения: Исследуемый материал промывают водопроводной водой (1-3 мин.), затем стерильной водой, после чего растирают в стерильной ступке с небольшим количеством стерильной воды. При анализе семян, одревесневших плотных частей стебля, мясистых корней, корнеплодов, галлов для поверхностной стерилизации растительных такней можно применить 0,5–1% раствор марганцовокислого калия, 10% раствор коммерческого препарата Белизна, растворы перикиси водорода и других антисептиков.
Выделение и очистку культуры можно проводить несколькими способами:
а) Метод истощения: посев суспензии из растёртой кашицы микробиологической петлёй на последовательный ряд чашек Петри с агаризованной средой для получения отдельных колоний.
б) Метод нарастания: размещение мелких (3–4 мм) кусочков поражённой ткани на поверхности плотной питательной среды.
в) Метод накопительных культур: суспензию из растёртой кашицы вносят в жидкую селективную питательную среду, инкубируют в течении 12 часов, а затем высевают методом истощения на агаризованную среду (по Schaad et al., 2001, с изменениями).
Выделение Agrobacterium из семян, одревесневших плотных частей стебля, корней, корнеплодов
Исследуемый материал тщательно промывают водопроводной водой (3–15 мин.), стерилизуют 1–3 мин. в 70% спирте, или в 0,5–1% растворе марганцовокислого калия, или в 10% растворе коммерческого препарата «Белизна», растворах перикиси водорода и других антисептиков, в зависимости от состава загрязняющей микробиоты, затем промывают в стерильной воде, после чего растирают в стерильной ступке с небольшим количеством стерильной воды. После непродолжительной инкубации, проводится высев «на истощение» на чашки Петри с селективной или неселективной средой YDC или NBY. Через 3–4 дня культуру пересевают для получения изолятов из отдельных колоний, очищают и помещают в коллекцию.
Выделение Agrobacterium из почвы и воды
Использование селективных сред помогает выделению Agrobacterium spp. из воды и почвы. Для качественного определения патогена, по 100 мкл каждого из 6–7 десятикратных серийных разведений исходной суспензии почвы (1 г почвы на 10 мл воды) или образца воды, наносят на селективную среду. Культуру бактерий инкубируют при 27–29 С в течении 3–4 дней.
Минимальный порог определения Agrobacterium spp. методом разведения на селективной среде составляет 104 КОИ/г. почвы. Использование селективных питательных сред позволяет выявлять высокие концентрации бактерий в почве, особенно когда метод дополнен иммунофлюоресцентным анализом (Moore et al., 1997).
Альтернативно, в 10 мл воды вносят 1 г. почвы, взбалтывают, настаивают 15–20 мин. Получают одно 10–кратное разведение (1 мл суспензии и вносят в 9 мл стерильной воды). Микробиологической петлёй наносят суспензию на чашки Петри с питательной средой «методом истощения». Через 3 дня проводят выделение изолятов из единичных колоний.
Выделение Agrobacterium из ксилемной жидкости растений Эндофитные агробактерии были обнаружены в растениях винограда (Lehoczky, 1968) и хризантемы (Jones, 1988). A.vitis находится в сосудистой ткани винограда и может быть изолирован из жидкости ксилемы.
По 100 мкл. каждого из 6–7 десятикратных серийных разведений исходного образца сока, наносят на селективную среду. Культуру бактерий инкубируют при 27–29 С в течении 3–4 дней. Селективные среды для основных видов Agrobacterium.
Среда MG (Ophel and Kerr, 1990) г/л: D–манит – 5,0; L–глутаминовая кислота – 2,0; КН2РО4 – 0,5; NaCl – 0,2; MgSO4x7H2O – 0,2; дрожжевой экстракт – 0,5; теллурит калия – 0,2; агар – 15,0.
Среда 1А (Brisbane and Kerr, 1983) для Agrobacterium tumefaciens (биовар 1) г/л: L–арабитол – 3,04; NH4NO3 – 0,16; KH2PO4 – 0,54; K2HPO4 – 1,04; таурохолат натрия – 0,29; MgSO4x7H2O – 0,25; агар – 15; 2,0 мл 0,1% водного раствора фиолетового кристаллического; После автокловирования охлаждают до 50С, затем добавляют циклогексимидин (1 мл 2% раствора) и Na2SeO3(6,6 мл. 1% раствора).
Среда с 3–кетоглюкозидазой (Матвеева и др. 1986; 1987), г/л–лактоза – 10,0; дрожжевой экстракт – 1,0; агар – 20,0; рН – 7,2.
Раствор Бенедикта г/л: Na3C6H5O7. – 173,0; Na2CO3 – 100,0; растворяется в литровой колбе при нагревании, но не доводя до кипения, затем в другой колбе растворяется CuSO4x5H2O – 17,3 в 200 мл. воды. Сливаем 2 раствора в литровой мерной колбе. Охладить и довести раствор до 1 л.
Неселективные питательные среды для очистки бактериальной культуры и получения инокулюма
Картофельный агар с генциан–виолетом (Матвеева и др. 1986; 1987), г/л: на 1 литр дистиллированной воды – 200 г. очищенного нарезанного кусочками по 3–4 см картофеля, кипятить 20 мин., отвар профильтровать, довести до прежнего объёма (1 л), внести 20 г. агара, расплавить, вновь профильтровать, после чего добавить 3 мл. 0,1%–ного водного раствора генциан–виолета, и довести рН до 6,8–7,0.
Среда LB (Lysogeny broth) (Bertani, 1951), г/л–дрожжевой экстракт – 5,0; агар – 15,0; триптон – 10,0; NaCl – 10,0; рН – 7,2.
Среда YDC (Yeast dextrose carbonate agar) (Schaad, 1988), г/л, дрожжевой экстракт – 10,0; глюкоза – 20,0; CaCO3 – 20,0; агар – 20,0; рН – 7,0. Среда NBY (Nutrient broth yeast extract medium) (Schaad, 1988), г/л– питательный бульон – 8,0; дрожжевой экстракт – 2,0; K2HPO4 – 2,0; KH2PO4 – 0,5; MgSO4 – 0,246 мг; Глюкоза – 2,5; Агар – 16,0; рН – 7,0
Среда King B (King, 1954) г/л–пептон – 20,0; глицерин – 10,0; K2HPO4 – 1,5, MgSO4XH2O – 1,5; Агар – 20,0; рН – 7,2.
Все среды стерилизовали при давлении 0,5 атм. в течение 30 мин.
Распространение фитопатогенных бактерий рода Agrobacterium в защищенном грунте в России
Оценка зараженности декоративных культур
По результатам визуального обследования декоративных растений в тепличных хозяйствах Московской области, встречаемость симптомов, вызываемых Agrobacterium была повсеместной, но сильно различалась степень развития болезни и ее вредоносность. Согласно литературным данным, заражение саженцев розы Agrobacterium в период с 2006 по 2014 гг. составило от 6,7% до 33,3% (Головченко, 2015).
Agrobacterium в открытом грунте встречается на многих культурах. Возбудитель корончатого галла розы часто завозится в тепличные хозяйства с импортным посадочным материалом. На корнях, в зоне прививки растений розы A. tumefaciens вызывает образование галлов, которые разрастаясь, разрывают кору, растрескиваются и приводят к деформации побегов. В некоторых тепличных комплексах в течение двух месяцев после высадки саженцев розы распространенность болезни на сорте «Sombrero» возросла более, чем в 100 раз: с 0,05 до 6,7 % (Головченко, 2016).
Бактерии, попадая в субстрат сохраняются в нем до двух лет, даже в отсутствии растения–хозяина. Галлы способствуют дефициту питания у растений, препятствуют сокодвижению, уменьшают их продуктивность.
Саженцы с симптомами корончатого галла выявлялись во всех тепличных комплексах Белоруссии. Отмечено наличие галлов на саженцах розы сортов Apricot, Aqua, El Toro, Dolce Vita, Passion, Gletsjer, Sombrero, Penny Laine, Sphinx, Sphinx Gold, Sweet Dolomiti, F. White, Renate, San Siro (Головченко, 2016). Потери от заболевания в тепличных хозяйствах составляют от 6,7 до 33,9 % саженцев, в зависимости от сoрта.
В Ульяновском совхозе декоративного садоводства филиал ГУП «Мосзеленхоз», из 640 обследованных растений в теплице № 110 поражёнными Agrobacterium оказались 70% растений роз.
Оценка зараженности овощных культур защищенного грунта В 2013–2014 г. в ряде тепличных хозяйств России было отмечено поражение культур огурца и томата, выращиваемых на минеральной вате, заболеванием, сходным с ранее описанным в Великобритании «корневым матом» – «root mat» (синоним «бешенство корней» – «crazy roots») (Weller et al. 2000).
Возбудителем заболевания является Agrobacterium bv 1, несущая плазмиду Ri (pRi) (Weller et al., 2000). Бактерии проникают в растения через ранки на корнях или стеблях. Симптомы заболевания проявляются после переноса в растительную клетку фрагмента T–ДНК (pRi ДНК).
Симптомы болезни
Заболевание развивается постепенно, первые признаки обычно замечают примерно через месяц после заражения. В течение этого времени отмечают активный рост корневой системы. Вскоре белые корни появляются на поверхности кубика, потом их становится всё больше и больше, они выступают из субстрата над поверхность мата (блока). При снятии пленки с блока минеральной ваты кубика и блока видно, что переплетающиеся белые, мало разветвленные корни, образуют сплошной ковер (Рисунок 9).
Плотное переплетение корней препятствует проникновению в субстрат питательного раствора и способствует развитию фитопатогенных бактерий и грибов. Постепенно, пораженные корни желтеют, буреют, на поверхности появляются мелкие корончатые галлы, которые разрастаясь достигают нескольких сантиметров. Галлы могут появляться на корнях в глубине субстрата, на его поверхности, и на основании стебля растения и они затрудняют продвижение воды по сосудам ксилемы (Рисунок 9).
На растениях проявляются признаки дефицита элементов питания, ухудшается товарный вид зеленцов за счет увеличения доли изогнутых плодов и плодов с заостренной вершиной. Продуктивность культуры даже при отсутствии других болезней снижается на 15–20%. На поздней стадии болезни растения увядают и отмирают из–за системного распространения самих агробактерий и сопутствующих им вторичных патогенов: бактерий Pseudomonas marginalis, Pectobacterium carotovorum, грибов Fusarium spp., Pythium spp., и других, вызывающих корневые гнили и увядание растений.
В 2014–2016 гг. нами были собраны пораженные растения из нескольких тепличных хозяйств России (Новгородская, Ульяновская, Тульская и другие области), а также образцы воды и субстрата для идентификации причины нового заболевания растений и определения первичных источников заражения. Симптомы заболевания соответствовали описанию «корневого мата» (Weller et al., 2000) или «бородатости корней» (Горленко, 1966).
По общепринятым микробиологическим методам (Moore et al. 2001, Schaad et al., 2001), из разных частей растений (корни, стебли, галлы), поливной воды (речной, из скважины, поливной воды после фильтрации, из капельниц), дренажа, а также семян огурца выделяли фитопатогенные бактерии в чистую культуру на неселективных средах (YDC, NA, NBY) (Schaad et al., 2001) и селективной среде RS для Agrobacterium (Moore et al. 2001).
Полученные одиночные колонии бактерий, напоминающие Agrobacterium spp., отсевали на чашки Петри со средой NBY, и определяли их морфологические и физиологические признаки в соответствии с руководством по определению фитопатогенных бактерий (Schaad et al., 2001).
Изоляты, определенные как Agrobacterium биовар 1, были выделены из пораженных корней, стеблей огурца и томата, внутренних тканей плодов и семян, минеральной ваты, подстилающей почвы, дренажной и поливной воды. Все изоляты Agrobacterium spp. были проверены при помощи ПЦР в реальном времени согласно ранее описанному протоколу (Weller and Stead 2002).
После первого обнаружения в конце 2013 года, в течение 2014 г. растения со сходными симптомами были обнаружены в пяти регионах РФ (Таблица 8). В двух регионах – Ростовской и Новосибирской областях, вирулентные изоляты Agrobacterium bv1 были выделены из поливной воды во время культивации растений.
Бактериальную суспензию 10 изолятов из различных мест выделения использовали для заражения проростков восприимчивых сортов огурца «Марфинский» и томата «Гавриш» по методу, описанному Weller et al. (2000).
Симптомы болезни проявлялись через 4–5 недель после заражения. Ризогенные штаммы Agrobacterium были выделены повторно из всех зараженных растений. Симптомы не обнаруживались на растениях, зараженных непатогенными изолятами Agrobacterium radiobacter. Было проведено секвенирование фрагментов генов домашнего хозяйства (см. далее) atpD, glnA, и recA, выполненное по протоколу Puawska et al. (2012) для штаммов 7, 9, 52, 54, 71 и 73. Последовательности были депонированы в ГенБанк под номерами от KT831395 до KT831400 (atpD), от KT831401 до KT831406 (glnA), и от KT831407 до KT831412 (recA). BLAST анализ показал, что вновь секвенированные фрагменты генов имели от 98 до 100% гомологию с типовым штаммом A. radiobacter NCPPB 2659.
Возбудителем заболевания является почти любая бактерия близкая к роду Agrobacterium и несущая плазмиду Ri (pRi) (Weller et al., 2006).
Оценка эффективности средств химической и биологической защиты растений от возбудителей корончатого галла и бородатости корней и других бактериозов в производственных условиях
Одной из главных проблем цветочных хозяйств является низкая устойчивость культурных сортов роз в условиях защищённого грунта к многочисленным болезням растений. В цветоводческих теплицах разрешены практически все методы и препараты для борьбы с фитопатогенами, но далеко не все они дают желаемый результат. Распространено применение фунгицидов, обладающих множеством недостатков, например, фитотоксичность, способность вызвать резистентность у фитопатогенов, что ведет к необходимости смены препаратов, т.к. уже после первой обработки могут появиться устойчивые формы фитопатогена.
В связи с этим в последнее время особое внимание уделяется биологическому методу защиты растений, где используются микроорганизмы–антагонисты фитопатогенов и продукты их метаболизма или очищенные антибиотические вещества биологического происхождения.
Так, под влиянием антагонистов фитопатогенные микроорганизмы могут подавляться в ризосфере или в филлоплане растения, вследствие чего растения не подвергаются заражению. Подавление патогенных форм также происходит под влиянием активных веществ антагонистов–антибиотиков, бактерицинов, сидерофоров. Антибиотические вещества оказывают также своё бактерицидное действие в тканях растений (Сторожков, Нефедов, 1975).
В соответствии с договором между Российским университетом дружбы народов и Ульяновским совхозом декоративного садоводства филиал ГУП «Мосзеленхоз», в сентябре 2013 года был заложен опыт по разработке эффективных мер борьбы с Agrobacterium tumefaciens на розах. В связи с тем, что в совхозе «Ульяновский» в основном используется химический метод защиты растений, нами было проведено сравнительное изучение препаратов различной природы для борьбы с опасным заболеванием роз, вызываемым Agrobacterium tumefaciens.
С целью подтверждения вида возбудителя болезни с растений, имеющих видимые симптомы поражения корончатым галлом, были отобраны образцы для лабораторной диагностики.
В результате микробиологического анализа возбудитель был выделен и изолирован в чистую культуру, после чего с помощью ПЦР–анализа со специфичными праймерами VCF/VCR (Sawada et al., 1995) было подтверждено, что выделенные бактерии принадлежат виду Agrobacterium tumefaciens.
Первоначально был проведен мониторинг распространения Agrobacterium tumefaciens в цветочном комбинате УСДС (Раздел 3.1), в результате чего для проведения эксперимента была выбрана теплица № 110, где поражение растений данным типом бактериоза было максимальным.
В лабораторных условиях был проведен эксперимент по изучению эффективности различных химических препаратов, применяющихся в УСДС для подавления роста и развития болезней розы.
В результате, для производственного опыта в УСДС нами были выбраны следующие препараты: манкоцеб+ медный купорос, Фитоплазмин, ВРК–300 и штамм антагониста В–1 (Bacillus subtilis).
Производственный опыт был заложен в теплице № 110 по схеме, приведенной в таблице 43. Каждый вариант был заложен в 4–кратной повторности, по 40 учетных растений в каждой повторности (всего 160 растений на вариант).
Сорт роз: За–За (вид: чайно–гибридная, урожайность: 2012г.–78 цветов/кв.м. в год, 2013г.–86 цветов/кв.м. в год, длина стебля: 60–80см). Посадка была проведена в 2007 году. Тип субстрата: Агроперлит 75%, торф верховой 25%. Температурные условия в теплице при закладке опыта: Влажность–80–90% ночью, 70–80% днём, температура среднесуточная от 18 до 20С (ночь/день 16–18/18–22С).
Дата закладки опыта: 13.02.2014
Дата первого учёта: 13.02.2014
Дата второго учёта: 27.02.2014 (14–й день после обработки)
Дата третьего учёта: 13.03.2014 (29–й день после обработки)
Дата четвёртого учёта: 28.05.2014 (105–й день после обработки)
Для статистической обработки результатов использовали программы «Excel 2010» и STATISTICA 10.0 (StatSoft, USA).
Agrobacterium tumefaciens сохраняется в почве длительное время, и наличие галлов на пораженном растении приводит к резкому увеличению числа патогенных бактерий на единицу веса почвы, усиливая заражение новых растений и стеблей. Эффективность того или иного препарата для борьбы с данным бактериозом на розах оценивается по усыханию уже сформировавшихся галлов, а также по уменьшению скорости образования новых галлов как на уже пораженных растениях, так и на растениях без видимых симптомов поражения. В результате опыта была проведена сравнительная оценка эффективности предложенных препаратов для снижения степени поражения Agrobacterium tumefaciens.
При применении выбранных нами препаратов в рассчитанных концентрациях на растениях розы не наблюдалось проявление фитотоксичности.
Как видно из приведенных в таблице 44, в контрольном варианте за 105 дней учета число галлов в среднем увеличилось на 10%. В варианте с применением Манкоцеба и сульфатом меди в эквимолярном соотношении наблюдалось увеличение числа галлов в среднем на 15 %.
Вариант с применением Фитоплазмин продемонстрировал его неэффективность в однократной обработке, наоборот, развитие новых галлов в среднем увеличилось на 29%, что вероятно было связано со стимулирующим рост растительных тканей действием препарата, представляющего смесь культуральной жидкости и биомассы стрептомицетов – продуцентов антибиотиков (Streptomyces fradiae) (http://pharmbiomed.ru/).